黑龍江地區(qū)鯉皰疹病毒3型的流行病學(xué)調(diào)查及其主要囊膜蛋白的抗原表位預(yù)測

李 淵，徐黎明，趙景壯，劉 淼，任廣明，尹家勝，紀(jì) 鋒，盧彤巖

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

黑龍江地區(qū)鯉皰疹病毒3型的流行病學(xué)調(diào)查及其主要囊膜蛋白的抗原表位預(yù)測

李 淵1,2，徐黎明1，趙景壯1，劉 淼1，任廣明1，尹家勝1，紀(jì) 鋒1，盧彤巖1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

2015-2016年對來自黑龍江地區(qū)46個養(yǎng)殖場送檢的鯉魚進(jìn)行錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus，KHV)的分離鑒定，并應(yīng)用DNAStar等軟件對檢出的陽性樣本的主要囊膜蛋白(Major envelop protein，MEP)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，KHV的檢出率約為6.5%，3株陽性樣本具有相同的MEP基因序列，稱之為KHV-HLJ1516。MEP基因開放閱讀框為771 bp，編碼256個氨基酸，相對分子質(zhì)量為28 280.58，等電點為8.40。對KHV-HLJ1516的MEP基因序列同源性分析表明，其與KHV-GZ11分離株僅有1個堿基不同，但并未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，堿基相似性為99%；而與HZ419分離株相比，KHV-HLJ1516的MEP基因有3個堿基發(fā)生突變，相應(yīng)的氨基酸由Asn變?yōu)镮Ie。聚類分析結(jié)果顯示，KHV-HLJ1516與KHV-GZ11處于同一分支，而HZ419位于另一分支。B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示，KHV-HLJ1516的MEP的抗原表位主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸區(qū)段。

鯉皰疹病毒3型；進(jìn)化分析；流行病學(xué)；B細(xì)胞抗原表位；預(yù)測

錦鯉皰疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus，KHV)引起的錦鯉和鯉魚的一種高致病性疾病，出現(xiàn)癥狀后24～48 h死亡，死亡率高達(dá)80%～90%[1]。到目前為止，包括亞洲、歐洲和北美洲等多個國家均發(fā)現(xiàn)該病毒。所以快速準(zhǔn)確的診斷已成為關(guān)注的重點，目前的診斷方法有細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)[2,3]、電鏡觀察[4,5]、PCR[6]、酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(ELISA)[7,8]、原位雜交技術(shù)[9]及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)[10]等。

錦鯉皰疹病毒(KHV)，又稱鯉皰疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-Ⅲ)，屬于皰疹病毒科，是雙鏈DNA病毒，有囊膜，與同科的鯉魚皰疹病毒(cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1)、叉尾鮰病毒(channelcatfish virus，CCV)之間有免疫交叉反應(yīng)[11]。主要囊膜蛋白(Major envelop protein，MEP)是錦鯉皰疹病毒囊膜的主要組成部分，其功能與病毒對細(xì)胞吸附、穿入、從細(xì)胞核膜出芽釋放及誘導(dǎo)細(xì)胞融合有關(guān)，并有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞毒作用[12]。本研究通過對2015～2016年間我國黑龍江地區(qū)送檢的鯉魚進(jìn)行常規(guī)的錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus,KHV)病原監(jiān)測，采用了KHV國標(biāo)檢測方法，得到3株具有相同MEP基因序列的陽性樣本，稱之為KHV-HLJ1516；通過對KHV-HLJ1516的MEP的基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定其與其他區(qū)域KHV之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，掌握該分離株的遺傳背景，為我國KHVD的防治提供參考；此外本研究應(yīng)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對MEP序列進(jìn)行了B細(xì)胞抗原表位綜合預(yù)測，旨在為進(jìn)一步研究KHV的MEP的功能及其基因背景信息和分子流行病學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

取自2015-2016年間我國黑龍江地區(qū)送檢的鯉魚，采集肝、脾和頭腎為待檢樣品。采樣數(shù)量按SC/T7014-2016中的6.1的規(guī)定。DNA聚合酶rTaq premix(大連寶生物公司)；DNAzol ? Reagent(Invitrogen,USA)；DNA Marker 及PCR純化試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。引物均由哈爾濱博萊仕合生物公司合成。

1.2 DNA的提取

將100 μL組織懸液放入1 mL的離心管，再加入1 mL DNAzol，顛倒混勻5次，室溫下靜置5 min，然后10 000g離心10 min；吸取上清，加入0.5 mL無水乙醇，顛倒混勻5～8次，室溫下靜置1-3 min，然后5 000g離心5 min；吸棄上清，加入0.8～1 mL 75%乙醇漂洗兩次，然后離心；吸棄乙醇，干燥10-15 min；加入0.2～0.3 mL無菌水溶解，即為提取的DNA，作為PCR模板。

1.3 KHV的鑒定

以提取的DNA作為PCR模板。用于KHV檢測的引物為國標(biāo)提供，引物序列：P3∶5′-GACACCACATCTGCAAGGAG-3′，P4∶5′-GACACATGTTACAATGGTCGC-3′。50 μL的體系：rTag 25 μL，引物2 μL，模板2 μL，水21 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增特異性片段。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 30 s，隨后是94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，共40個循環(huán)，最后保持在4 ℃。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 MEP基因擴(kuò)增、序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以GenBank已登錄的錦鯉皰疹病毒MEP基因序列，設(shè)計合成引物：P1∶5′-ATGGCAGTCACCAAAGC-3′，P2∶5′-TCACCACATCTTGCCG-3′。以提取的DNA作為PCR模板，進(jìn)行MEP基因的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：93 ℃ 2 min；隨后是93 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)，最后保持在4 ℃。結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，對目的條帶進(jìn)行膠回收，然后將回收產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行測序。利用DNAStar中的EditSeq軟件推導(dǎo)MEP基因的氨基酸序列。并用DNAman對MEP基因序列進(jìn)行比對。將獲得的MEP基因序列BLAST進(jìn)行序列同源性分析并用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。選擇的參考序列來自Genbank中的日本株TUMST1(GenBank：AP008984.1)、美國株KHV-U(GenBank：DQ657948.1)和以色列株KHV-I(GenBank：DQ177346.1)，還有國內(nèi)的KHV-GZ11(GenBank：KJ627438.1[13]及HZ419 GenBank：KP004896.1)。本研究所分離的KHVHLJ-1516的MEP基因序列已提交Genbank，其accession no.為KY010497。

1.5 MEP的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測

應(yīng)用DNAStar軟件中的Protean模塊分析KHV-HLJ1516的MEP的B細(xì)胞抗原表位；Chou-Fasman法和Gamier-Robson法預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)；Karplus-Schulz法預(yù)測其柔性區(qū)段；Kyte-Doolittle法分析其親水性；Emini法預(yù)測其表面可能性；Jameson-Wolf 法和Kolaskar-Tongaonkar法(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)分別預(yù)測其抗原指數(shù)和抗原表位指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚剖檢

感染KHV后的魚皮膚上出現(xiàn)蒼白的塊斑與血泡，體表分泌大量黏液，眼睛凹陷，腹部充血和出血(圖1)。

圖1 病鯉的癥狀Fig.1 Symptoms of infected common carp

2.2 KHV的鑒定

對送檢的46份鯉魚采樣(肝、脾、頭腎)，提取核酸，利用國標(biāo)提供的引物進(jìn)行以Sph為目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果顯示在預(yù)計大小位置出現(xiàn)特異性目的片段(292 bp)(圖2)。通過測序?qū)Ρ热觋栃詷颖維ph基因片段完全相同，且與Genbank收錄的鯉KHV的Sph基因具有100%的相似性，說明三個樣本均為KHV。本次調(diào)研結(jié)果顯示黑龍江地區(qū)2015～2016年間的KHV檢出率約為6.5%。

圖2 KHV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.2 Gel electrophoresis of PCR product of KHV1，2，3陽性樣本PCR產(chǎn)物；N，陰性對照； M，DL2000 DNA marker

2.3 KHV-HLJ1516的MEP基因的擴(kuò)增及序列測定

以檢出的陽性樣本為模板，P1、P2為引物，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示得到了與目的條帶大小一致的特異性條帶(圖3)。序列分析結(jié)果表明MEP基因開放閱讀框長為771 bp，編碼含有256個氨基酸的主要囊膜蛋白。MEP預(yù)測的相對分子質(zhì)量為28 280.58，等電點為8.40。值得注意的是這三株陽性樣本的MEP具有相同的核酸序列。因此，本研究將這三株KHV分離株稱之為KHV-HLJ1516。

圖3 KHV-HLJ1516主要囊膜蛋白基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.3 Gel electrophoresis of PCR product of MEP gene of KHV-HLJ15161，2，3陽性樣本PCR產(chǎn)物；M，DL2000 DNA marker

2.4 KHV-HLJ1516的MEP基因序列比對及遺傳進(jìn)化分析

將測序結(jié)果與GenBank中收錄的MEP基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，廣州某地區(qū)的KHV-GZ11、KHV-I、KHV-U和TUMST1分離株的MEP核酸序列相似性均為100%，而KHV-HLJ1516的MEP基因與KHV-GZ11的MEP基因相似性為99%，其MEP基因有1個堿基發(fā)生了突變，但并未導(dǎo)致該位點的氨基酸發(fā)生改變；而與國內(nèi)的HZ419分離株相比，KHV-HLJ1516的MEP基因有3個堿基發(fā)生了突變，并影響了相應(yīng)的氨基酸由Asn變成了IIe。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，KHV-HLJ1516與KHV-GZ11與KHV-I、KHV-U和TUMST1分離株均處于同一個分支，而國內(nèi)的HZ419分離株卻位于另一分支(圖4)。

圖4 基于KHV-HLJ1516主要囊膜蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the MEP gene sequence of KHV-HLJ1516

2.5 KHV-HLJ1516的MEP二級結(jié)構(gòu)和抗原表位分析

應(yīng)用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法預(yù)測MEP的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其預(yù)測的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角存在較多的重合區(qū)域(圖5)。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)顯示：KHV-HLJ1516的MEP是以α-螺旋和β-折疊為主有一定的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的混合型蛋白，α-螺旋和β-折疊一般是起支架作用，蛋白質(zhì)的功能部位和酶的活動中心一般在無規(guī)則卷曲部位。

圖5 不同方法預(yù)測的KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of MEP of KHV-HLJ1516 predicted by various methods A: α-螺旋；B: β-折疊；T: β-轉(zhuǎn)角；C: 無規(guī)則卷曲。

Karplus-Schulz法預(yù)測的MEP柔性區(qū)段位置為：5，10～16，22～30，40～41，71～73，108～110，149～152，177～180，192～196，201～205，

218～239，243～253，這些區(qū)域有一定的柔韌性，形成抗原表位的可能性較大(圖6)。

圖6 Karplus-Schulz法預(yù)測KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的柔性區(qū)段Fig.6 Flexible regions of MEP of KHV-HLJ1516 predicted by Karplus-Schulz method

Kyke-Doolittle法氨基酸親水性預(yù)測結(jié)果顯示，KHV-HLJ1516的MEP的親水性較低，親水性區(qū)段主要在氨基酸序列的后段，提示該區(qū)段位于蛋白表面的可能性最大，作為抗原表位的幾率也相對較高。Emini法分析MEP的表面可能性結(jié)果顯示，可能性較大的區(qū)域為：7～13，68～75，147～151，198～214，221～237，245～253，因此，這些區(qū)段很有可能位于蛋白的表面，可能是B細(xì)胞的優(yōu)勢區(qū)域(圖7)。

圖7 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的表面可能性分析Fig.7 Surface probability of MEP of KHV-HLJ1516

2.6 KHV-HLJ1516的MEP抗原指數(shù)和抗原表位指數(shù)

Jameson-Wolf法對MEP的抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測，可看出MEP中存在許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，其中區(qū)段最大的位置在218～239，因此該段有可能是優(yōu)勢抗原表位；還有一些其他抗原指數(shù)較高的區(qū)段，如7～16，22～31，36～43，69～77，104～111，184～196，198～211，243～255形成抗原表位的可能性也較大(圖8)。

圖8 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的抗原指數(shù)分析Fig.8 Antigenic index of MEP of KHV-HLJ1516

Kolaskar-Tongaonkar法[14]預(yù)測的MEP抗原表位平均抗原指數(shù)為1.051，最大值為1.265，最小值為0.917。

2.8 KHV-HLJ1516的MEP B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果綜合分析

如果某一氨基酸區(qū)段中：抗原指數(shù)≥1.033，親水性指數(shù)≥0，氨基酸的抗原表位可能性指數(shù)≥1，氨基酸個數(shù)大于等于7個，并且其內(nèi)部或附近又含有柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域，則這一區(qū)段有可能是抗原表位。Kolaskar-Tongaonkar方法預(yù)測大于7個氨基酸的KHV-HLJ1516的MEP抗原表位分析結(jié)果可以直接給出抗原表位的序列，見表1。表位大小至多不超過30個氨基酸殘基。綜合以上考慮，本研究預(yù)測的KHV-HLJ1516的MEP可能的B細(xì)胞抗原表位區(qū)段主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸區(qū)段。

表1 KHV-HLJ1516的主要囊膜蛋白的B細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列Tab 1 Amino acid sequence of B cell antigenic epitope of MEP of KHV-HLJ1516

3 討論

KHVD自1997年首次報道以來，傳播、流行于亞洲、歐洲、北美及非洲多個國家[15]。2002年，劉葒等[16]首次報道KHVD傳到中國廣東，時隔三年后，周永燦等[17]報道已從中國自然感染鯉魚中檢測到KHV，2010年閆春梅等[18]又從吉林省某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場檢測出KHV，至此表明，KHVD已在中國成蔓延趨勢，應(yīng)引起重視。中國南北地理、氣候、環(huán)境等差異顯著，所以針對北方的KHVD監(jiān)測就很重要了。2015-2016年，在KHVD易發(fā)的季節(jié)，課題組對黑龍江省多家鯉魚養(yǎng)殖場送來的監(jiān)測鯉魚樣品進(jìn)行病原檢測，從46家養(yǎng)殖場共檢出3個陽性樣本，檢出率約為6.5%，該結(jié)果說明KHV已經(jīng)存在并且流行于黑龍江省的鯉魚養(yǎng)殖場。KHV 主要感染鯉和錦鯉，其魚苗、幼魚、成魚階段均可感染[19]，其他鯉科魚、錦鯉和鯽的雜交后代、錦鯉和金魚的雜交后代也對其易感[20]。魚體感染KNV后，在其腦、眼、脾、鰓、腎、腸和腸內(nèi)容物都能檢測出該病毒[21]。所以認(rèn)為該病是通過水傳播的。接種疫苗可能是一種控制KHVD發(fā)生的容易想到的辦法，該病的減毒苗已經(jīng)應(yīng)用于臨床[22]，但目前還沒有理想的疫苗來防治KHVD[23]，主要靠加強監(jiān)測，切斷傳播途徑等措施防控?？傊瑸楦玫姆乐圃摬”┌l(fā)流行，需要進(jìn)行區(qū)域的監(jiān)測管理[24]，加強全球的合作交流，建立有效的檢測方法，研制有效的KHV疫苗，保障我國錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

在本研究中分離得到的3株KHV陽性樣本的MEP基因序列完全一致。在NCBI中對測序的結(jié)果直接BLAST分析，結(jié)果顯示KHV-HLJ1516的MEP核苷酸與參考病毒株的MEP核苷酸相似性均為99%，而KHV-I(以色列)、KHV-U(美國)、TUMST1(日本)和KHV-GZ11(中國廣州)的MEP核酸序列100%相同。該結(jié)果說明本研究分離的KHV毒株與我國其他地區(qū)分離株具有基因序列差異性，可能為新毒株。跟廣州KHV-GZ11分離株相比，黑龍江分離株KHV-HLJ1516的MEP基因有1個堿基發(fā)生了突變，但并未導(dǎo)致該位點的氨基酸發(fā)生改變。而與國內(nèi)另一參考毒株HZ419相比，其MEP基因有3個堿基發(fā)生了突變，并影響了相應(yīng)的氨基酸由Asn變成了IIe。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，KHV-HLJ1516仍與這四株參考毒株處于同一個分支，說明KHV-HLJ1516與廣州KHV-GZ11及KHV-I(以色列)、KHV-U(美國)、TUMST1分離株具有相對較近的親緣關(guān)系，而與中國另一KHV分離株HZ419親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

囊膜蛋白通常與病毒的感染甚至病毒的毒力相關(guān)[25]。本實驗成功獲得了KHV長771 bp的MEP基因，編碼256個氨基酸，預(yù)測的相對分子質(zhì)量為28 280.58，等電點為8.40。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)顯示：KHV-HLJ1516的MEP是以α-螺旋和β-折疊為主有一定的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的混合型蛋白，α-螺旋和β-折疊一般是起支架作用，蛋白質(zhì)的功能部位和酶的活動中心一般在無規(guī)則卷曲部位?？乖砦患纯乖瓫Q定簇，決定抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，有效的分析抗原表位有助于疾病的診斷以及疫苗分子的設(shè)計。抗原表位篩選方法主要集中在研究B細(xì)胞抗原表位，作為B細(xì)胞抗原表位首先應(yīng)位于或易于移動于蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，這樣就傾向于參與構(gòu)成β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。另外，具有一定柔韌性，親水性強、表面極性大的氨基酸殘基通常參與表位構(gòu)成[26]。表位大小一般由5～7個氨基酸和單糖殘基組成，至多也不超過30個氨基酸殘基。綜合以上考慮，本研究預(yù)測的KHV-HLJ1516的MEP可能的B細(xì)胞抗原表位區(qū)段主要位于4～11，24～40，42～63，82～110，209～218，238～249氨基酸區(qū)段，為進(jìn)一步探索KHV分子流行病學(xué)及表位疫苗的構(gòu)建研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Epidemiologic investigation of Koi herpes virus type 3 in Heilongjiang province and prediction of antigenic epitopes of major envelope protein

LI Yuan1,2,XU Li-ming1,ZHAO Jing-zhuang1,LIU Miao1,REN Guang-ming1,YIN Jia-sheng1,JI Feng1， LU Tong-yan1

(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Carps from 46 fish farms of Heilongjiang province were subjected to isolation of Koi herpes virus (KHV) during 2015～2016.The major envelope protein (MEP) gene of the KHV was subjected to bioinformatics analyses by using the DNAStar and other software.The results showed that the detection rate of KHV in Heilongjiang province during 2015～2016 was about 6.5%.The 3 isolated KHV had the same MEP gene sequence,and which were called KHV-HLJ1516.The open reading frame (ORF) of the MEP was 771 bp,encoding 256 amino acids.The predicted relative molecular mass of the MEP was 28280.58 and isoelectric point was 8.40.The homology analysis showed that compared with KHV-GZ11,the MEP gene of the KHV-HLJ1516 had a single site nucleotide mutation which did not cause the change of amino acid.The MEP of KHV-HLJ1516 was 99% identical to KHV-GZ11 at the nucleotide level.Compared with HZ419,KHV-HLJ1516 had 3 nucleotide mutations which caused a mutation from Asn to IIe.The results of cluster analysis showed that KHV-HLJ1516 was clustered in the same branch with KHV-GZ11,while another isolate of HZ419 was clustered in another branch.B cell epitopes of the MEP showed that the likely B cell epitopes of KHV-HLJ1516 MEP were mainly located at 4～11,24～40,42～63,82～110,209～218,238～249 amino acids.

Cyprinid herpesvirus 3;phylogenetic analysis;epidemiology;B cell antigenic epitope;prediction

2016-10-26；

2017-03-18資助項目：黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(GA13B401)

李 淵(1989-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向為魚類病害防治。E-mail: 1154662843@qq.com

盧彤巖。E-mail: lutongyan@hotmail.com*

S941

A

1000-6907-(2017)04-0037-07