運(yùn)動(dòng)干預(yù)糖尿病心肌病的分子機(jī)制研究

王成績(jī)

(安徽省巢湖學(xué)院體育學(xué)院， 安徽 巢湖 238000)

運(yùn)動(dòng)干預(yù)糖尿病心肌病的分子機(jī)制研究

王成績(jī)△

(安徽省巢湖學(xué)院體育學(xué)院， 安徽 巢湖 238000)

目的： 觀察鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌組織中NADPH氧化酶表達(dá)的變化，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)NADPH氧化酶的影響。方法: 大鼠糖尿病模型建立成功1周后，測(cè)定糖尿病對(duì)心肌組織中NADPH氧化酶亞基表達(dá)的影響，測(cè)定8周的運(yùn)動(dòng)能否有效影響NADPH氧化酶亞基的表達(dá)；觀測(cè)糖尿病對(duì)心肌膠原蛋白表達(dá)的影響，8周運(yùn)動(dòng)是否能夠影響膠原蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 糖尿病導(dǎo)致心室NADPH氧化酶亞基p47phox和 gp91phox表達(dá)增加，而8周運(yùn)動(dòng)能夠抑制這2種亞基表達(dá)的增加；糖尿病引起心房肌p47phox表達(dá)顯著增加，運(yùn)動(dòng)抑制其增加；糖尿病大鼠心肌膠原蛋白III水平顯著增加，運(yùn)動(dòng)降低膠原蛋白的增加。結(jié)論: 運(yùn)動(dòng)減低糖尿病大鼠心臟p47phox和 gp91phox的表達(dá)。這可能是改善心內(nèi)基質(zhì)的重要機(jī)制，因此運(yùn)動(dòng)干預(yù)糖尿病心肌病的一個(gè)有效機(jī)制可能是通過(guò)抑制心肌氧化應(yīng)激和降低膠原蛋白的表達(dá)。

糖尿病心肌?。?NADPH氧化酶； 運(yùn)動(dòng)； 膠原蛋白Ⅲ

中等強(qiáng)度和頻率的有氧運(yùn)動(dòng)是慢性心衰患者的心臟康復(fù)措施之一[23]。運(yùn)動(dòng)降低血漿Ang II水平[24-26]。但是，運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病患者NADPH氧化酶活性及其亞基表達(dá)的影響還不完全清楚。本研究探討糖尿病是否能夠誘導(dǎo)p47phox和gp91phox表達(dá)增加，觀察糖尿病心肌病與這些亞基表達(dá)的增加存在什么樣的關(guān)系，同時(shí)確定運(yùn)動(dòng)是否能夠改善/降低糖尿病誘導(dǎo)的這些亞基的表達(dá)增加，進(jìn)而探討運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司); 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ； Sigma);檸檬酸合酶試劑盒(北京綠源博德生物科技有限公司);Anti-p47phox抗體(上海瑞齊生物科技有限公司);兔抗人多克隆抗體gp91phox(Abcam);Goat Anti-Type III Collagen(武漢艾美捷科技有限公司)；SelectCycler II 梯度PCR儀(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立 80只雄性SD大鼠，體重190～200 g，購(gòu)于南京君科生物工程有限公司。飼養(yǎng)習(xí)服1周后，建立糖尿病模型，一次腹膜內(nèi)注射65 mg/kg STZ (溶于2% 0.1 mmol/L冷卻檸檬酸緩沖液，pH 4.5)。注射48 h后空腹血糖>13.89 mmol/L時(shí)為建模成功。對(duì)照組大鼠注射不含STZ的檸檬酸緩沖液。整個(gè)研究中，體重相似大鼠配對(duì)飼養(yǎng)，室溫22 ℃，12 h光照循環(huán)，濕度30%～40%。自由飲食。

2.2 運(yùn)動(dòng)方案 建模成功1周后，對(duì)照組和糖尿病組大鼠分別隨機(jī)分為2組。對(duì)照組和糖尿病組中的1組不運(yùn)動(dòng)，其他2組根據(jù)修正的Musch等[27]的運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行8周運(yùn)動(dòng)。4組分別為不運(yùn)動(dòng)正常對(duì)照(normal control， NC)組、不運(yùn)動(dòng)糖尿病(diabetic control， DC)組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照(exercise control， EC)組和糖尿病運(yùn)動(dòng)(diabetic exercise， DE)組。適應(yīng)期中，大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間為每天5～15 min，跑臺(tái)初始速度為10 m/min，坡度為0，共5 d，目的是確保有效的耐力運(yùn)動(dòng)。接著跑臺(tái)坡度和速度逐漸增加到10%和25 m/min，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間增加到每天60 min。2組對(duì)照組除跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)外，其它日常處理與2組運(yùn)動(dòng)組一樣。

2.3 樣本收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4組大鼠用過(guò)量戊巴比妥麻醉(65 mg/kg，肌注)，建模過(guò)程中，無(wú)死亡案例。胸腔切開，摘取心臟，液氮中快速冷凍，-80℃保存。摘取后肢比目魚肌，快速冷凍，-80℃保存。

2.4 檸檬酸合酶分析 根據(jù)先前的方法[28]，通過(guò)測(cè)量肌肉勻漿中檸檬酸合酶的活性評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)效應(yīng)。檸檬酸合酶活性依據(jù)總蛋白含量進(jìn)行標(biāo)化，用mmol·g-1·min-1表示。

2.5 半定量RT-PCR 用半定量RT-PCR測(cè)定左右心室和心房組織中的p47phox和gp91phox相對(duì)水平。左右心室在低溫恒溫器上切成100 μm厚的冠狀切片，15號(hào)穿刺針穿刺心房取樣(左心耳部心房肌)。用TRIzol試劑法提取左右心室和心房組織總RNA。4組取等量總RNA (1 μg)，在37 ℃含有隨機(jī)六聚物和100 U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶中逆轉(zhuǎn)錄40 min。p47phox和gp91phox引物用于聚合酶鏈反應(yīng)，測(cè)定每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄量。β-肌動(dòng)蛋白共同擴(kuò)增作為內(nèi)參照。

反應(yīng)條件為： 94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 min， 66 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，從每份PCR反應(yīng)中取7 μL與藍(lán)/橙上樣染料混合，在100 V，用1%含溴乙啶瓊脂凝膠電泳45 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯影凝膠。用柯達(dá)分析軟件分析譜帶強(qiáng)度，用各自相對(duì)的β-肌動(dòng)蛋白譜帶進(jìn)行標(biāo)化。p47phox的上游引物為5’-ACCTGTCGGAGAAGGTGGT，下游引物為5’-TAGGTCTGAAGGATGATGGG；gp91phox的上游引物為5’-CATTTACCACTGTGCTTGGCA-3’，下游引物為5’-CCAGAGTCATGGCAGGAGGT-3’。

2.6 Western blot 用Western blot法分析4組大鼠左室、右室和心房組織p47phox和gp91phox。心臟在含1mmol/L苯甲磺?；锖偷鞍酌敢种苿┗旌衔锏腞IPA緩沖液中勻漿后提取蛋白質(zhì)。測(cè)量心房膠原蛋白III水平作為心肌硬化的一個(gè)指標(biāo)，每份蛋白樣本30～40 μg與等量4% SDS樣本緩沖液，分餾到7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移后，室溫下用含5%脫脂奶粉TBST阻斷PVDF膜1 h。接著，4 ℃用 I 抗-p47phox兔多克隆抗體，兔抗人gp91phox多克隆抗體，抗-膠原蛋白III山羊多克隆抗體孵育過(guò)夜，與相應(yīng)過(guò)氧化物酶結(jié)合第 II 抗體孵化1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光可視化信號(hào)，用UVP數(shù)字成像系統(tǒng)檢測(cè)，用ImageJ軟件定量信號(hào)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠的一般特征

表1顯示4周后4組大鼠的特征。研究初始，大鼠平均體重為(196±4) g。8周后，NC組大鼠平均體重增加到(298±12)g，但EC組平均體重為(213±8) g。DC組平均體重為(213±11)g，DE組平均體重為(210±7) g 。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，NC和EC組大鼠空腹血糖水平?jīng)]有顯著變化，分別為(3.78±0.66) mmol/L和(4.22±0.50) mmol/L。DC組空腹血糖顯著增高到(21.44±0.83) mmol/L，DE組為(18.44±0.72) mmol/L。腓腸肌中檸檬酸合酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌線粒體體積和數(shù)量，增加肌肉的呼吸能力。增加的線粒體轉(zhuǎn)而增加檸檬酸合酶活性，反映運(yùn)動(dòng)相關(guān)肌肉活性的增加。由表1可見，NC組檸檬酸合酶活性(4.33±0.56) mmol·g-1·min-1，DC組為(4.08±0.36) mmol·g-1·min-1，DC組稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EC組為(7.05±0.33) mmol·g-1·min-1，DE組為(7.12±0.42) mmol·g-1·min-1，運(yùn)動(dòng)顯著增加檸檬酸合成酶的活性(P<0.05)。

表1 4組大鼠的特征

Table 1.The characteristics of the rats with different treatments (Mean±SD.n=20)

TreatmentBodyweight(g)FBG(mmol/L)Citratesynthase(mmol·g-1·min-1)NC298±123.78±0.664.33±0.56DC213±11**21.44±0.83**4.08±0.36EC213±8**4.22±0.507.05±0.33**DE210±7**18.44±0.72#7.12±0.42**#

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDC group.

2 糖尿病大鼠左室p47phox和gp91phox表達(dá)增加，運(yùn)動(dòng)可以減緩增加

8周后，與NC組相比，DC組左室p47phox和gp91phox的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。8周的運(yùn)動(dòng)使大鼠左室p47phox和gp91phoxmRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，與DC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the left ventricle of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of detected p47phoxby RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

圖1 4組大鼠左室p47phox和 gp91phox的表達(dá)

3 運(yùn)動(dòng)降低糖尿病大鼠引起的右室p47phox和gp91phox的增加

DC組右室p47phox的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與NC組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；右室gp91phox的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，但2組間gp91phox蛋白質(zhì)表達(dá)的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與DC組相比，8周運(yùn)動(dòng)降低 p47phox和gp91phox的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the right ventricle of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of p47phoxdetected by RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

圖2 4組大鼠右室p47phox和 gp91phox的表達(dá)

4 運(yùn)動(dòng)能夠降低糖尿病大鼠心房p47phox和gp91phox表達(dá)增加

由圖3可見，與NC組相比，DC組大鼠心房p47phox和 gp91phox的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與預(yù)期的一樣，與DC組相比，運(yùn)動(dòng)8周后，DE組心房p47phox和 gp91phox的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與NC組相比，DC組p47phox蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而gp91phox蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?jīng)]有增加。EC組和DE組心房p47phox的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低與運(yùn)動(dòng)降低心房p47phox的mRNA表達(dá)水平增加的狀況相似。

5 運(yùn)動(dòng)降低糖尿病誘導(dǎo)的心房膠原蛋白III表達(dá)的增加

由圖4可見，與NC組相比，DC組大鼠細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原蛋白III顯著增加(P<0.05)。8周運(yùn)動(dòng)降低糖尿病大鼠膠原蛋白III蛋白表達(dá)的增加(P<0.05)，達(dá)到與對(duì)照組相似的水平，但8周運(yùn)動(dòng)沒(méi)有影響非糖尿病對(duì)照組大鼠膠原蛋白III的表達(dá)。

Figure 3.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the atrium of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of p47phoxdetected by RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

圖3 4組大鼠心房p47phox和 gp91phox的表達(dá)

Figure 4.The expression of collagen III in the atrium of the rats with different treatments. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

圖4 心房膠原蛋白III表達(dá)變化的比較

討 論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心臟NADPH氧化酶胞質(zhì)亞基p47phox和膜結(jié)合亞基gp91phox被上調(diào)，運(yùn)動(dòng)可以降低糖尿病誘導(dǎo)的2種亞基表達(dá)的增加。由于運(yùn)動(dòng)開始于建模1周后，運(yùn)動(dòng)可能預(yù)防或減小而不是逆轉(zhuǎn)糖尿病誘導(dǎo)的表達(dá)增加。有研究報(bào)道，與NC組相比，DC組大鼠縮短分?jǐn)?shù)、射血分?jǐn)?shù)、每搏輸出量和心輸出量顯著降低。8周的運(yùn)動(dòng)顯著增加射血分?jǐn)?shù)百分比，降低左室收縮末期直徑的增加，改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的糖尿病組dp/dt的增加。心臟NADPH氧化酶亞基表達(dá)的改變可能與糖尿病心功能改善有關(guān)。

線粒體和NADPH氧化酶的遞增信息在糖尿病心臟ROS產(chǎn)生中起基礎(chǔ)作用。此外，ROS介導(dǎo)過(guò)氧亞硝酸鹽形成增加誘導(dǎo)體肌細(xì)胞凋亡，表明氧化應(yīng)激是一個(gè)常見的凋亡介質(zhì)，誘導(dǎo)糖尿病大鼠心臟損傷。數(shù)據(jù)表明糖尿病心臟氧化應(yīng)激水平增加可能部分原因是NADPH氧化酶亞基上調(diào)，這種改變可能被運(yùn)動(dòng)降低。這些結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)的有益效應(yīng)可能與糖尿病心肌病的氧化應(yīng)激改善有關(guān)。NADPH氧化酶在Ang II誘導(dǎo)的心臟肥大和間質(zhì)纖維化中的關(guān)鍵作用，用靶向破壞NADPH氧化酶亞基gp91phox可以證實(shí)。p47phox在激動(dòng)劑激活酶中起關(guān)鍵作用。

研究表明糖尿病大鼠心組織p47phox和gp91phox表達(dá)被上調(diào)。左室和心房上調(diào)最多，而右室輕微升高。這些發(fā)現(xiàn)與臨床數(shù)據(jù)一致，顯示糖尿病與收縮舒張和任何左室功能障礙和相對(duì)不足的右室危險(xiǎn)增加有關(guān)。在心室肌細(xì)胞，高血糖狀態(tài)下通過(guò)增強(qiáng)增加p47phox蛋白質(zhì)表達(dá)而增加ROS產(chǎn)生，可以被血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor， AT1R)拮抗劑阻斷。研究顯示[29]Ang II灌注通過(guò)AT1R活化，誘導(dǎo)主動(dòng)脈外膜gp91phoxmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加。另外，據(jù)報(bào)道，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠主動(dòng)脈NADPH氧化酶活性增加，gp91phoxmRNA上調(diào)[30]。而且，在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良大鼠模型中，NADPH氧化酶活性和膠原蛋白III增加與心衰發(fā)病機(jī)制有關(guān)，糖尿病患者心內(nèi)膜心肌活檢也發(fā)現(xiàn)膠原蛋白III顯著增加。

Ang II可以刺激心肌成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白I和III，研究提示抑制NADPH氧化酶的活性可以通過(guò)降低ROS而延緩Ang II引起的心臟重塑。膠原蛋白穩(wěn)定狀態(tài)的增加逐漸增加心室硬化，是糖尿病心肌病一個(gè)獨(dú)特的特征。雖然提出糖尿病心肌病的內(nèi)科治療使用不同的抗氧化劑已經(jīng)幾十年，然而，這樣的治療未能降低心功能紊亂或改善結(jié)果。這可能是由于缺乏以恰當(dāng)?shù)姆绞礁纳菩膬?nèi)膜ROS負(fù)擔(dān)。運(yùn)動(dòng)是預(yù)防2型糖尿病的一個(gè)關(guān)鍵因素被廣泛接受，且對(duì)心臟病患者存在有益效應(yīng)，即使這種有益效應(yīng)的機(jī)制還不完全清楚。運(yùn)動(dòng)通過(guò)延緩糖尿病誘導(dǎo)的心動(dòng)徐緩，降低心肌收縮力而維持心輸出量。動(dòng)物和臨床研究表明運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生眾多有益的生理變化，包括降低血糖、體脂和胰島素抵抗、改善血糖控制和脂質(zhì)代謝、改善壓力反射敏感性、降低血漿Ang II水平、降低腎交感神經(jīng)活性和對(duì)Ang II應(yīng)答的動(dòng)脈血壓。另外，運(yùn)動(dòng)能夠上調(diào)心血管系統(tǒng)的抗氧化酶表達(dá)和活性。

研究表明，糖尿病誘導(dǎo)的NADPH氧化酶亞基p47phox和gp91phox翻譯以及轉(zhuǎn)錄的增加，增加心肌氧化應(yīng)激。糖尿病大鼠心房gp91phox在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)增加，但不在蛋白質(zhì)水平，表明轉(zhuǎn)錄增加與組織中蛋白質(zhì)表達(dá)改變不一定相關(guān)。

運(yùn)動(dòng)通過(guò)改善NADPH氧化酶表達(dá)和活性，可能減緩糖尿病的發(fā)生。運(yùn)動(dòng)可以使糖尿病相關(guān)血糖、血漿Ang II和TNF-α的增加正?；?。這些因素的正常化能降低ROS誘導(dǎo)劑水平，因而抑制NADPH氧化酶活性。另外，有研究指出運(yùn)動(dòng)上調(diào)主動(dòng)脈和心臟組織中抗氧化劑表達(dá)和活性，如SOD、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽。本研究的重要意義是闡述了運(yùn)動(dòng)降低p47phox和gp91phoxmRNA的表達(dá)的特殊機(jī)制。

綜上所述，糖尿病狀態(tài)下心肌組織NADPH氧化酶亞基p47phox和gp91phox的mRNA表達(dá)上調(diào)，運(yùn)動(dòng)降低NADPH氧化酶亞基表達(dá)的上調(diào)，使膠原蛋白III的增加正?；?。本研究為運(yùn)動(dòng)作為調(diào)節(jié)糖尿病心臟氧化應(yīng)激水平的一種有效非藥物工具的潛在機(jī)制提供支持。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Molecular mechanism of exercise intervention in diabetic cardiomyopathy in rats

WANG Cheng-ji

(CollegeofPhysicalEducation,ChaohuUniversity,Chaohu238000,China.E-mail：wcjch2008@126.com)

AIM: To investigate the effect of streptozotocin-induced diabetes on the expression of NADPH oxidase, and to determine the effect of exercise on the expression of NADPH oxidase. METHODS: One weeks after successful modeling, the effect of diabetes mellitus on the expression of NADPH oxidase subunits in the cardiac tissue was determined. The effect of exercise for 8 weeks on the protein expression of NADPH oxidase subunits and the effect of diabetes on the protein expression of collagen in the heart were observed, and whether 8 weeks of exercise affected the expression of collagen were also measured. RESULTS: Diabetes mellitus resulted in the increased expression of NADPH oxidase subunits p47phoxand gp91phoxin the cardiac ventricle, and exercise for 8 weeks inhibited the increase in the expression of NADPH oxidase subunits p47phoxand gp91phox. Diabetes mellitus significantly increased the expression of p47phoxin the atrial muscle, while exercise inhibited this increase. Diabetes mellitus significantly increased the levels of cardiac collagen III, while exercise reduced the increase in collagen protein. CONCLUSION: Reduction of diabetic rat heart p47phoxand gp91phoxexpression by effective exercise therapy may be an important mechanism of improving the cardiac matrix by inhibiting myocardial oxidative stress and decreasing collagen expression, thus preventing diabetic cardiomyopathy.

Diabetic cardiomyopathy; NADPH oxidase; Exercise; Collagen III

1000- 4718(2017)07- 1244- 07

2016- 10- 17

2017- 02- 21

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.015

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△通訊作者 Tel: 13856531173; E-mail： wcjch2008@126.com