柚皮素通過環(huán)核苷酸通路拮抗血小板聚集的體外研究*

黃曼婷， 吳煥林， 徐丹蘋△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 2廣東省中醫(yī)院， 廣東 廣州 510020)

柚皮素通過環(huán)核苷酸通路拮抗血小板聚集的體外研究*

黃曼婷1， 吳煥林2， 徐丹蘋2△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，2廣東省中醫(yī)院， 廣東 廣州 510020)

目的： 探討柚皮素拮抗二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)血小板聚集的作用機(jī)制。方法: 采用ELISA檢測柚皮素對ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平的影響。采用高效液相法檢測柚皮素對血小板磷酸二酯酶(PDE)活性影響。采用Western blot檢測柚皮素對ADP刺激的血小板內(nèi)血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)磷酸化形式p-VASP(Ser157)、p-VASP(Ser239)的蛋白水平的影響。分別給予蛋白激酶A(PKA)抑制劑H89、蛋白激酶G(PKG)抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPS和蛋白激酶C(PKC)抑制劑GF109203X預(yù)先孵育血小板后，再用柚皮素處理，然后給予ADP刺激，Western blot檢測p-VASP(Ser239)蛋白水平。采用血小板聚集儀進(jìn)一步觀察PKA抑制劑、PKG抑制劑預(yù)先孵育血小板是否影響柚皮素對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用。結(jié)果: 柚皮素劑量依賴性地升高ADP抑制的血小板內(nèi)cGMP水平，而并不改變cAMP水平。柚皮素還能顯著升高血小板PDE活性。Western blot結(jié)果顯示，柚皮素可明顯升高由ADP抑制的p-VASP(Ser239)水平，但不影響p-VASP(Ser157)的蛋白水平，預(yù)先孵育PKG或PKC抑制劑并不影響柚皮素對p-VASP(Ser239)蛋白表達(dá)的作用，而預(yù)先孵育PKA抑制劑后，則能抑制柚皮素對p-VASP(Ser239)蛋白表達(dá)的作用。PKA抑制劑能阻斷柚皮素對血小板聚集的拮抗作用，而PKG抑制劑并不影響其作用。結(jié)論: 柚皮素可能通過升高血小板內(nèi)cGMP水平和激活PKA依賴的信號通路來介導(dǎo)VASP的磷酸化，從而發(fā)揮抗血小板聚集的作用。

柚皮素； 血小板聚集； 環(huán)磷酸腺苷； 環(huán)磷酸鳥苷； 磷酸二酯酶； 血管擴(kuò)張刺激磷蛋白

血小板活化過度，例如在內(nèi)皮受損部位的過度活化，成為許多心血管疾病比如心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛和卒中等的發(fā)病基礎(chǔ)，其中血小板聚集是血小板活化過程中不可缺少的環(huán)節(jié)。血小板活化是一個復(fù)雜的過程，涉及多個血小板激動劑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。環(huán)核苷酸包括環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)，是血小板信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的第二信使系統(tǒng)，可以將胞外信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、放大，轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信息，在血小板活化過程中發(fā)揮著重要的作用。血小板激活劑作用于血小板時首先與細(xì)胞膜受體結(jié)合，通過與膜受體偶聯(lián)的G蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)或鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase, GC)，使cAMP、cGMP的生成，cAMP、cGMP再通過cAMP依賴性蛋白激酶A(protenin kinase A, PKA)、cGMP依賴性蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)介導(dǎo)一系列的蛋白磷酸化反應(yīng)[1]。cAMP和cGMP能夠抑制G蛋白偶聯(lián)受體配體(如凝血酶、二磷酸腺苷)、膠原、血栓素、血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)和纖維蛋白原誘導(dǎo)的血小板激活。當(dāng)血小板內(nèi)cAMP、cGMP水平升高時，可以抑制血小板的活化，其中包括：抑制激活劑誘導(dǎo)的Ca2+動員，抑制G蛋白的激活，抑制血小板黏附、顆粒分泌、纖維蛋白原結(jié)合和血小板聚集[2-4]。最近，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，一系列具有抑制GC作用而促進(jìn)血小板內(nèi)cGMP生成的化合物，已經(jīng)被證實(shí)在動物體內(nèi)具有明顯的抗血栓形成的作用[5]。目前研究表明，提升血小板胞內(nèi)cAMP、cGMP水平能抑制誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集[1]。

柚皮素(naringein)是廣泛存在于蕓香科植物葡萄、葡萄柚、西紅柿以及柑橘類水果中的二氫黃酮類化合物，也是中藥化橘紅的主要有效成分。我們前期體外、體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)[6]，柚皮素具有顯著的抗血小板聚集作用，能通過PI3K/Akt途徑拮抗二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，很可能開發(fā)為一種理想的抗血小板聚集藥物，但其抗血小板聚集的作用機(jī)制還有待更深入的研究。因此，本研究通過柚皮素對血小板環(huán)核苷酸通路的影響，進(jìn)一步研究柚皮素拮抗血小板聚集作用的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料與儀器

柚皮素購自成都曼思特生物科技有限公司，純度大于98.0%；ADP、前列腺素 E1(prostaglandin E1，PGE1)、纖維蛋白原、三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)、cAMP、 cGMP和Rp-8-Br-PET-cGMPS購自Sigma-Aldrich；GF109203X和H89購自Selleck；抗磷酸化(Ser157)血管擴(kuò)張刺激磷蛋白[phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein，p-VASP (Ser157)]抗體、抗p-VASP (Ser239) 抗體、抗GAPDH 抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology；cGMP ELISA 試劑盒購自Cayman；cAMP ELISA 試劑盒購自上海源葉公司； Western blot化學(xué)發(fā)光 HRP 底物和PVDF膜購自Millipore。LC-20A高效液相色譜儀及配套的四元泵、SPD-M20A檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器和柱溫箱均為SHIMADZU產(chǎn)品；LBY-NJ4血小板聚集儀均購自北京普利生儀器有限公司。

2 方法

2.1 洗滌血小板的制備[7-8]正常SD大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈穿刺取血，用3.2%枸櫞酸鈉溶液以1∶9(抗凝劑∶血)的比例抗凝，向混勻的全血中加入PGE1(終濃度0.1 mg/L)，將全血混勻后，300×g離心6 min。吸取上層富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，加入PGE1(終濃度0.1 mg/L)，900×g離心10 min，棄去上清液；得到的濃縮血小板團(tuán)塊，加入適量Tyrode buffer (12 mmol/L NaHCO3、138 mmol/L NaCl、5.5 mmol/L glucose、2.9 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、0.42 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L HEPES，pH 7.4)及PGE1(終濃度為0.1 mg/L)，巴氏吸管輕柔吹打，重懸血小板，900×g離心6 min，棄去上清液，得到血小板團(tuán)塊；重新將血小板沉淀于含2×10-5U/L apyrase的Tyrode buffer 中，血小板終濃度調(diào)整至4×1011/L。

2.2 血小板內(nèi)cAMP、cGMP含量的檢測 取洗滌血小板300 μL，加入不同濃度柚皮素和同等體積的4% DMSO為溶劑對照，37 ℃孵育5 min后加入誘導(dǎo)劑ADP(終濃度10 μmol/L)，于血小板聚集儀上進(jìn)行血小板聚集反應(yīng)，同時取未經(jīng)處理的血小板作為對照(用ADP誘導(dǎo)洗滌血小板聚集，必須加入2 mmol/L CaCl2和0.3 g/L人纖維蛋白原)。聚集反應(yīng)結(jié)束后，立即加入10 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)終止反應(yīng)，隨后100 ℃煮沸5 min，4 ℃冷卻，13 000×g離心5 min，取上清進(jìn)行ELISA檢測。

2.3 高校液相色譜法檢測血小板內(nèi)cAMP/cGMP的減少量判斷血小板磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性[9]SD大鼠腹主動脈取血，用3.2%枸櫞酸鈉溶液以1∶9(抗凝劑∶血)的比例抗凝，300×g離心6 min獲得PRP，PRP以900×g離心10 min得血小板沉淀，加入預(yù)冷的PBS(含0.1% Triton X-100)重懸血小板，冰上超聲破碎血小板(50 Hz，每次5 s、10次，每次間隔停頓5 s)，4 ℃低溫12 000×g離心20 min 去除血小板碎片沉淀，獲取含有大鼠血小板PDE的提取物。

采用高效液相色譜法檢測cAMP和cGMP在與PDE反應(yīng)后的減少量，計(jì)算PDE活性。用LC-20A高效液相色譜儀，色譜柱采用依利特C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。cAMP測定流速為1.0 mL/min，cGMP測定流速為0.6 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為室溫。流動相由甲醇和50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)組成，容積比為1∶9。進(jìn)樣量為100 μL。

2.4 血小板聚集測定 采用Born比濁法進(jìn)行血小板聚集性測定[10]。用300 μL Tyrode buffer 作為參比，于比濁管中加入洗滌血小板300 μL，分別加入H89(PKA抑制劑，終濃度5 μmol/L)和Rp-8-Br-PET-cGMPS(PKG抑制劑，終濃度30 μmol/L)，37 ℃孵育5 min后，加入終濃度為200 μmol/L的柚皮素，37 ℃孵育5 min后，加入誘導(dǎo)劑ADP(終濃度10 μmol/L)并記錄300 s 內(nèi)最大聚集率(用ADP誘導(dǎo)洗滌血小板聚集，必須加入2 mmol/L CaCl2和0.3 g/L人纖維蛋白原)。

2.5 Western blot 檢測蛋白水平 血小板聚集反應(yīng)結(jié)束后，立即加入10 mmol/L EDTA終止反應(yīng)。3 000×g離心3 min，得血小板沉淀，用PBS洗2次，加入適量細(xì)胞裂解液，置冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min，所得上清即為細(xì)胞總蛋白。留取20 μL裂解后的樣本進(jìn)行BCA蛋白定量，剩下的樣本加入5×loading buffer，100 ℃煮5 min，分裝，-80 ℃保存。取30 μg樣本上樣，將樣本電泳、轉(zhuǎn)膜，用5% 牛血清白蛋白溶液室溫封閉1 h，洗膜3次。分別加入1∶1 000工作濃度的特異性抗體[p-VASP(Ser157)、p-VASP(Ser239)和GAPDH]，室溫輕柔振動孵育1 h后，放入4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜3次后加入II抗，室溫孵育1 h，洗膜3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像儀成像并分析定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)-t檢驗(yàn)或Student-Newman-Keuls(SNK)-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 柚皮素對血小板內(nèi)cAMP和cGMP生成的影響

圖1顯示，與靜息血小板相比，ADP刺激后，血小板內(nèi)cGMP的含量顯著降低(P<0.05)，不同濃度柚皮素處理可以呈劑量依賴性地增加血小板內(nèi)cGMP的含量，與ADP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而柚皮素對cAMP水平無明顯影響。

Figure 1.Naringenin elevated cGMP levels but not cAMP levels significantly in ADP-stimulated platelets. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsADP group.

圖1 柚皮素對ADP誘導(dǎo)血小板cAMP、cGMP生成的影響

2 柚皮素對血小板PDE活性的影響

我們從大鼠血小板中制備了PDEs酶，通過使用高效液相色譜法檢測酶反應(yīng)體系中PDEs酶底物cAMP/cGMP的剩余量，即計(jì)算峰面積，來反映柚皮素處理對PDE活性的抑制作用。對照品及樣品的高效液相色譜圖見圖2。在200、400和800 μmol/L 3個反應(yīng)液濃度時，柚皮素均可顯著抑制血小板PDE活性，見圖3。

3 柚皮素對VASP磷酸化的影響

柚皮素可明顯升高由ADP抑制的p-VASP(Ser239)水平(P<0.01)；柚皮素有增加p-VASP(Ser157)蛋白水平的趨勢，但與ADP組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。預(yù)先孵育PKG或PKC抑制劑并不影響柚皮素對p-VASP(Ser239)蛋白水平的影響，而預(yù)先孵育PKA抑制劑后，則能抑制柚皮素誘導(dǎo)的p-VASP(Ser239)蛋白水平(P<0.05)，見圖5。

4 柚皮素與PKA、PKG抑制劑合用對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用

單獨(dú)給予PKA抑制劑H89和PKG抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPS均不影響ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。200 μmol/L柚皮素能明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，但用PKA抑制劑H89預(yù)先處理血小板后再給予終濃度200 μmol/L柚皮素處理，其血小板聚集率升高，從(19.5±6.7)%升高到(26.0±3.6)% (P<0.05)。而PKG抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPS和柚皮素合用組血小板聚集率為(17.7±4.9)%，與單純柚皮素處理組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖5。

Figure 2.The high efficiency liquid chromatogram of reference substance and samples.

圖2 對照品及供試品的高效液相色譜圖

討 論

cAMP和cGMP是血小板胞內(nèi)信號傳遞的第二信使，各種激活劑作用于血小板時首先與細(xì)胞膜受體結(jié)合，通過第二信使的作用，促使血小板聚集，引起血小板活化。cAMP和cGMP增加時通過以下機(jī)制抑制血小板活化[1, 11]：(1)抑制Ca2+動員、內(nèi)流，降低血小板內(nèi)Ca2+水平。血小板內(nèi)60%以上 Ca2+在靜息狀態(tài)下儲存在致密管道中，當(dāng)誘導(dǎo)劑如ADP、膠原、凝血酶通過各自受體，使Ca2+從致密管道釋放到胞漿，胞漿Ca2+水平增加，血小板激活，提高胞內(nèi)cAMP和cGMP水平，繼而降低Ca2+水平來抑制血小板激活。(2)抑制誘導(dǎo)劑類物質(zhì)如磷酸肌醇的降解，抑制肌球蛋白與激動蛋白的結(jié)合，進(jìn)而抑制血小板活化。(3)抑 制Ca2+敏感性蛋白激酶C的磷酸化。

Figure 3.Naringenin inhibited PDE activity in the rat platelets extracts. A: naringenin inhibited cAMP-phosphodiesterase activity in platelets； B: naringenin inhibited cGMP-phosphodiesterase activity in platelets. Means±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L naringenin group.

圖3 柚皮素抑制PDE活性

Figure 4.The effect of naringenin on VASP phosphorylation in ADP-stimulated platelets. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsADP group.

圖4 柚皮素對ADP誘導(dǎo)的血小板VASP磷酸化的影響

Figure 5.The effect of naringenin on platelet aggregation and the phosphorylation of VASP at S239 in the presence of PKA, PKG and PKC inhibitors before incubation with naringenin. Rp：Rp-8-Br-PET-cGMPS. A: platelet aggregation was measured in the presence of PKA and PKG inhibitors before incubation with naringenin. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsADP group；#P<0.05vsADP+ naringenin+H89 group. B: VASP phosphorylation at S239 was analyzed in the presence of PKA, PKG and PKC inhibitors before incubation with naringenin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsADP group；#P<0.05vsADP+naringenin (800 μmol/L).

圖5 柚皮素與PKA、PKG、PKC抑制劑聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率和p-VASP(Ser239)表達(dá)的影響

誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生的反應(yīng)如形態(tài)改變、黏附、聚集、顆粒內(nèi)容物的釋放等均是胞內(nèi)Ca2+水平增加的結(jié)果，均可通過增加胞內(nèi)cAMP和cGMP水平來抑制胞漿Ca2+水平，因此近年來調(diào)節(jié)cAMP和cGMP的物質(zhì)被發(fā)展為抗血小板藥物[12]。在我們的研究中，血小板經(jīng)ADP激活后，cGMP生成減少，經(jīng)柚皮素預(yù)處理后，胞內(nèi)cGMP含量增加，能逆轉(zhuǎn)ADP誘導(dǎo)的cGMP減少，而柚皮素對cAMP含量改變不大。提示柚皮素極有可能是通過影響血小板cGMP途徑來發(fā)揮抗血小板聚集的作用。

血小板的cAMP和cGMP水平主要受兩類酶調(diào)控，AC或GC負(fù)責(zé)其合成，PDE負(fù)責(zé)其降解[13]。PDE和AC、GC一起共同調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸水平。AC催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成cAMP，GC催化三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)合成cGMP，PDE則選擇性作用于3’, 5’-磷酸二酯鍵，將cAMP和cGMP裂解我5’-cAMP和5’-cGMP[14]。PDE分布廣泛，在血小板、心臟、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)均有存在，目前分為11個亞型，每一亞型又包括不同的亞亞型。PDEs在血小板中表達(dá)的種類有PDE2A、PDE3和PDE5，其中PDE3能水解cAMP和cGMP，而PDE5能水解cGMP[13]。我們的研究結(jié)果顯示200 μmol/L柚皮素即可顯著抑制血小板提取的PDEs活性，柚皮素在同樣濃度范圍內(nèi)劑量依賴性增加cGMP水平，抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，說明柚皮素對血小板聚集的抑制與其抑制PDE活性繼之提升cGMP有關(guān)。

cAMP和cGMP生理作用的發(fā)揮是通過PKA和PKG介導(dǎo)的蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。Walter等[15]純化出一個46/50 kD的血小板蛋白，稱之為血管擴(kuò)張刺激磷蛋白，是cGMP和cAMP依賴的激酶的一個底物。環(huán)核苷酸活化的蛋白激酶A在3個位點(diǎn)上使VASP磷酸化，而磷酸化與血小板活化的抑制有關(guān)[16-17]。相應(yīng)地，脫磷酸作用則與活化有關(guān)。靜息下，血小板內(nèi)VASP以磷酸化的非活化形式存在，當(dāng)細(xì)胞受體接收刺激活化或抑制AC、GC活化偶聯(lián)Gi蛋白時，引起下游cAMP、cGMP水平升高或降低，抑制p-VASP去磷酸化或促使其去磷酸化[18-19]。VASP的3個磷酸化位點(diǎn)Ser157、Ser239和Thr278已經(jīng)被鑒定。Ser239位點(diǎn)是主要的PKG磷酸化位點(diǎn)，而Ser157位點(diǎn)是主要的PKA磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)血小板內(nèi)cAMP水平升高，VASP磷酸化位點(diǎn)Ser157被PKA激活，而胞內(nèi)cGMP水平升高，PKG則激活VASP磷酸化位點(diǎn)Ser239[20]。為了進(jìn)一步考察柚皮素是否通過cGMP或cAMP介導(dǎo)的信號通路抑制血小板活化，我們利用Western blot技術(shù)檢測柚皮素對p-VASP(Ser239)和p-VASP(Ser157)的影響。研究結(jié)果顯示，柚皮素呈劑量依賴性增加p-VASP(Ser239)的蛋白水平，升高由ADP抑制的p-VASP(Ser239)水平，而柚皮素并不改變p-VASP(Ser157)的蛋白水平。這與我們前面發(fā)現(xiàn)柚皮素能逆轉(zhuǎn)ADP誘導(dǎo)的cGMP減少，而對cAMP含量改變不大的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。為了證實(shí)柚皮素是否通過cGMP/PKG通路來介導(dǎo)VASP(Ser239)的磷酸化，我們分別采用PKA抑制劑H89、PKG抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPS和PKC抑制劑GF109203X預(yù)先孵育血小板后，再用柚皮素處理，觀察抑制劑是否影響柚皮素對p-VASP(Ser239)的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，預(yù)先孵育PKG或PKC抑制劑并不影響柚皮素對p-VASP(Ser239)的表達(dá)，而預(yù)先孵育PKA抑制劑后，則能降低柚皮素對p-VASP(Ser239)的蛋白水平，這表明柚皮素并不是通過cGMP/PKG通路來介導(dǎo)VASP(Ser239)的磷酸化，而是通過升高胞內(nèi)cGMP水平和PKA依賴的信號通路來介導(dǎo)VASP(Ser239)的磷酸化。此外，我們進(jìn)一步采用PKA抑制劑、PKG抑制劑預(yù)先孵育血小板后，再用柚皮素處理，觀察抑制劑是否影響柚皮素抑制血小板聚集作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PKA抑制劑能逆轉(zhuǎn)柚皮素抑制的血小板聚集，而PKG抑制劑并不影響其作用。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明cGMP-介導(dǎo)的PKA激活在柚皮素抑制的血小板聚集作用中起重要作用。雖然大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為cGMP誘導(dǎo)的VASP磷酸化是由PKG介導(dǎo)的，但近年來有研究發(fā)現(xiàn)cGMP能通過抑制PDE3激活cAMP-PKA通路[21]，Li等[22]也發(fā)現(xiàn)PKA在cGMP誘導(dǎo)的VASP磷酸化和血小板聚集中扮演了重要作用，我們的研究結(jié)果與其發(fā)現(xiàn)是一致的。

綜上所述，柚皮素拮抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用的潛在分子機(jī)制可能是通過升高血小板內(nèi)cGMP水平和激活PKA依賴的信號通路來介導(dǎo)VASP磷酸化實(shí)現(xiàn)的。

[1] Smolenski A. Novel roles of cAMP/cGMP-dependent signaling in platelets[J]. J Thromb Haemost, 2012, 10(2):167-176.

[2] Rukoyatkina N, Walter U, Friebe A, et al. Differentiation of cGMP-dependent and -independent nitric oxide effects on platelet apoptosis and reactive oxygen species production using platelets lacking soluble guanylyl cyclase[J]. Thromb Haemost, 2011, 106(5):922-933.

[3] Schwarz UR, Walter U, Eigenthaler M. Taming platelets with cyclic nucleotides [J]. Biochem Pharmacol, 2001, 62(9):1153-1161.

[4] Münzel T, Feil R, Mülsch A, et al. Physiology and pathophysiology of vascular signaling controlled by guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate-dependent protein kinase[J]. Circulation, 2003, 108(18):2172-2183.

[5] Stasch JP, Pacher P, Evgenov OV. Soluble guanylate cyclase as an emerging therapeutic target in cardiopulmonary disease[J]. Circulation, 2011, 123(20): 2263-2273.

[6] 黃曼婷， 吳煥林， 徐丹蘋. 柚皮素通過PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的體外研究[J]. 中國病理生理雜志，2017，33(3):517-522.

[7] Boylan B, Gao C, Rathore V, et al. Identification of Fc gamma RIIa as the ITAM-bearing receptor mediating alphaIIbbeta3 outside-in integrin signaling inhuman platelets[J]. Blood, 2008, 112(7):2780-2786.

[8] Liu J, Pestina TI, Berndt MC, et al. Botrocetin/VWF-induced signaling through GPIb-IX-V produces TxA2 in an alphaIIbbeta3- and aggregation-independent manner[J]. Blood, 2005, 106(8):2750-2756.

[9] 劉 旭， 程玉芳， 張漢霆， 等. 咯利普蘭對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠 學(xué)習(xí)記憶及海馬 PDE4活性的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008, 24(6): 1096-1100.

[10]Born GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal[J]. Nature, 1962, 194:927-929.

[11]Lee DH, Kim HH, Cho HJ, et al. Antiplatelet effects of caffeic acid due to Ca2+mobilizationinhibition via cAMP-dependent inositol-1, 4, 5-trisphosphate receptor phosphorylation[J]. J Atheroscler Thromb, 2014, 21(1): 23-37.

[12]Hayashi H, Sudo T. Effects of the cAMP-elevating agents cilostamide, cilostazol and forskolin on the phosphorylation of Akt and GSK-3beta in platelets[J]. Thromb Haemost, 2009, 102(2): 327-335.

[13]Omori K, Kotera J. Overview of PDEs and their regulation[J]. Circ Res， 2007, 100(3): 309-327.

[14]Zhao CY, Greenstein JL, Winslow RL. Roles of phosphodiesterases in the regulation of the cardiac cyclic nucleotide cross-talk signaling network[J]. J Mol Cell Cardiol, 2016, 91:215-227.

[15]Walter U, Eigenthaler M, Geiger J, et al. Role of cyclic nucleotide-dependent protein kinases and their common substrate VASP in the regulation of human platelets[J]. Adv Exp Med Biol, 1993, 344:237-249.

[16]Harbeck B, Hüttelmaier S, Schluter K, et al. Phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein regulates its interaction with actin[J]. J Biol Chem, 2000, 275(40): 30817-30825.

[17]Lambrechts A, Kwiatkowski AV, Lanier LM, et al. cAMP-dependent protein kinase phosphorylation of EVL, a Mena/VASP relative, regulates its interaction with actin and SH3 domains[J]. J Biol Chem, 2000, 275(46):36143-36151.

[18]Aszódi A, Pfeifer A, Ahmad M, et al. The vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) is involved in cGMP- and cAMP-mediated inhibition of agonist-induced platelet aggregation, but is dispensable for smooth muscle function[J]. EMBO J, 1999, 18(1):37-48.

[19]Wentworth JK, Pula G, Poole AW. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) is phosphorylated on Ser157 by protein kinase C-dependent and independent mechanisms in thrombin-stimulated human platelets[J]. Biochem J, 2006, 393(Pt 2): 555-564.

[20]Vaiyapuri S, Ali MS, Moraes LA, et al. Tangeretin regulates platelet function through inhibition of phosphoinositide 3-kinase and cyclic nucleotide signaling[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013, 33(12): 2740-2749.

[21]Jang EK, Azzam JE, Dickinson NT, et al. Roles for both cyclic GMP and cyclic AMP in the inhibition of collagen-induced platelet aggregation by nitroprusside[J]. Br J Haematol, 2002, 117(3): 664-675.

[22]Li Z, Ajdic J, Eigenthaler M, et al. A predominant role for cAMP-dependent protein kinase in the cGMP-induced phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein and platelet inhibition in humans[J]. Blood, 2003, 101(11): 4423-4429.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Antiplatelet aggregation of naringenin via cyclic nucleotide signaling: in vitro studies

HUANG Man-ting1, WU Huan-lin2, XU Dan-ping2

(1TheSecondClinicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine，2GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510020,China.E-mail:danpingxu@hotmail.com.cn)

AIM: To investigate effect of naringenin on ADP-induced platelet aggregation and its possible mechanism. METHODS: The levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) were measured in the platelets with ADP stimulation using ELISA in the presence or absence of different concentrations of naringenin. The effect of naringenin at different concentrations on the change of phosphodiesterase (PDE) activity was measured by high efficiency liquid chromatography. The effects of naringenin at different concentrations on phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) at positions Ser157 and Ser239 in washed platelets with ADP stimulation were analyzed by Western blot. The phosphorylation of VASP at Ser239 was also analyzed in the presence of protein kinase A (PKA), protein kinase G (PKG), or protein kinase C (PKC) inhibitors before incubation with naringenin. The platelet aggregation was measured in the presence of PKA or PKG inhibitors before incubation with naringenin. RESULTS: Naringenin elevated cGMP levels significantly but not cAMP levels in the platelets with ADP stimulation in a dose-dependent manner. Naringenin inhibited PDE activity. Naringenin increased the phosphorylation of VASP at Ser239 in a dose-dependent manner in the platelets with ADP stimulation but only modest changes in the phosphorylation at position Ser157. The phosphorylation level of VASP at Ser239 position was inhibited when the platelets were treated with PKA inhibitor before incubation with naringenin. Incubation of platelets with neither PKG nor PKC inhibitors before treatment with naringenin affect the phosphorylation of VASP at Ser239. Pretreatment with PKA inhibitor but not PKG inhibitor significantly reversed the antiplatelet aggregation by naringenin in ADP-stimulated platelets. CONCLUSION: Naringenin may inhibit platelet activation through the elevation of cGMP- and PKA- mediated VASP phosphorylation.

Naringenin; Platelet aggregation; Cyclic adenosine monophosphate; Cyclic guanosine monophosphate; Phosphodiesterase; Vasodilator-stimulated phosphoprotein

1000- 4718(2017)07- 1306- 07

2016- 12- 05

2017- 04- 10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81403341)；廣東省中醫(yī)藥管理局科技專項(xiàng)(No. 20141093)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2016A020226011)

R285.5； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.025

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△通訊作者 Tel: 020-39318374; E-mail: danpingxu@hotmail.com.cn