新型氣體信號分子H2S 與骨質疏松的研究概況

宗群川 王濤

青海大學附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，青海 西寧 810000

H2S作為一種氣體化合物，傳統(tǒng)上被認為是活生物體的毒性試劑，然而在真核生物發(fā)現(xiàn)也可以合成后，H2S逐漸得到大家的關注。目前，H2S被認為是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種重要的氣體信號分子，在循環(huán)系統(tǒng)、胃腸道、免疫、內分泌和神經系統(tǒng)均有調節(jié)作用[1]。H2S由機體多種細胞和宿主微生物產生，內源性H2S以L-半胱氨酸為底物，由胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(CSE)[2]為主要的酶機制催化產生(見圖1)，其他如3-巰基丙酮酸硫轉移酶(MST)和半胱氨酸氨基轉移酶(CAT)在特定組織類型中也很重要。CSE在周圍組織中比CBS更重要，CBS在腦中占主導地位[3]，也有認為CBS和3-MST主要存在于腦中，CSE主要與外周或非神經組織相關?，F(xiàn)有發(fā)現(xiàn)所有三種酶是普遍存在的，所以H2S幾乎影響所有細胞過程[4]。H2S在體內有未解離的H2S和解離的HS-兩種狀態(tài)，兩者之間保持動態(tài)平衡，而NaHS 作為外源性H2S供體已應用于相關研究當中。

骨質疏松癥是一種以骨量減少，骨密度降低，骨微結構受到破壞以及骨中的多種蛋白質被改變?yōu)樘卣鞯某Ｒ姷墓趋兰膊?，增強了骨折的風險。其較高的發(fā)病率和死亡率，使骨質疏松性骨折面臨著衛(wèi)生保健的嚴峻問題，尤其是老年女性和男性[5]。雌激素缺乏引起的絕經期女性骨質疏松癥至關重要[6]。此外，長期使用糖皮質激素和遺傳因素等都可以成為導致骨質疏松癥的因素。隨著H2S在機體循環(huán)、免疫和神經系統(tǒng)等新型功能的發(fā)現(xiàn)，H2S調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的作用成為當代研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)H2S在保持成骨細胞(OB，骨代謝細胞)和破骨細胞(OC，骨橋蛋白細胞)平衡的精細調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。絕經后和長期使用糖皮質激素等導致的骨質疏松癥的病因研究中均已明確H2S的重要地位，通過H2S的控制來調節(jié)骨細胞的動態(tài)平衡成為骨質疏松癥研究的熱點。

1 H2S與不同病因骨質疏松癥的相關研究

1.1 H2S與絕經后骨質疏松癥的相關研究

絕經后骨質疏松癥的發(fā)生與雌激素水平下降明顯相關，而H2S成為兩者相互影響的的橋梁。H2S的產生與人體類固醇激素保持密切的聯(lián)系，研究證明類固醇可以調節(jié)H2S的生物合成，其中雌激素直接調節(jié)人類破骨細胞(SCs)中的CBS和CSE的mRNA水平，基質細胞產生的H2S可刺激成骨細胞的分化產生，故雌激素通過對H2S的影響調節(jié)骨細胞的平衡[7]。Francesco等[8]研究證實，卵巢切除(OVX)骨量丟失模型中，H2S生成酶CBS和CSE受到抑制，血清和骨髓中H2S水平降低。此外，H2S有預防氧化應激的作用[9]，雌激素的丟失可降低H2S水平，從而導致機體對氧化應激的防御減弱[10]，加速了骨骼衰老。因此，H2S的刺激成骨細胞的分化產生及預防氧化應激的作用，提示H2S的減少介導或加強了雌激素缺乏與骨中氧化應激的作用對骨老化的影響。

另有研究發(fā)現(xiàn)，通過GYY4137(水溶性H2S的緩釋供體)的治療可使OVX小鼠中的血清H2S正?；?，GYY通過激活Wnt信號增加了基質細胞中的Wnt配體，如Wnt16(Wnt16誘導成骨細胞中的Wnt信號傳導，阻止皮質骨脆性骨折和抑制破骨細胞產生[11])，亦可增加骨形成來防止骨小梁和皮質骨損失，因此GYY可能是皮質骨合成代謝過程的的必要介質，H2S或可參與調節(jié)絕經后骨質疏松癥。

1.2 H2S與長期使用糖皮質激素導致骨質疏松癥的研究

糖皮質激素(GC)的使用可以直接誘導成骨細胞死亡和凋亡[12]。長期使用GC的骨組織學圖像顯示成骨細胞數(shù)量減少和成骨細胞凋亡水平增加，即患者易患骨質疏松癥[13]。重要研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松(Dex)刺激的骨質疏松組織的MC3T3-E1細胞中，CBS和CSE顯著下調。因此，GC的長期使用導致的骨質疏松癥與H2S產生的抑制現(xiàn)象存在著密切關系。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體NaHS可激活AMPK信號傳導并抑制MC3T3-E1細胞損傷，同時H2S保護MC3T3-E1細胞免受H2O2介導的氧化損傷[14]。其中H2S在MC3T3 E1細胞中依賴AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)的激活介導細胞的保護活性，故AMPK信號可能是由H2S激活的關鍵信號分子[15,16]，在Dex導致的骨質疏松癥中對MC3T3-E1細胞發(fā)揮著保護作用。探究其中機制發(fā)現(xiàn)，AMPK可調節(jié)ATP內穩(wěn)態(tài)的同時促進NADPH合成，減弱氧化應激介導的細胞損傷并限制其消耗。AMPK/ACC(乙酰輔酶A羧化酶)信號軸作為抗氧化劑來維持ATP/NADPH體內平衡，并從氧化應激反應過程中拯救細胞[17]。Zhou等[18]表示AMPK還可以激活自噬系統(tǒng)抑制H2O2誘導的成骨細胞凋亡。類似的，Jeon等[19]發(fā)現(xiàn)AMPK激活劑(A-769662)保護成骨細胞免受H2O2誘導的凋亡。

2 H2S預防和/或治療骨質疏松癥發(fā)生機制的相關研究

2.1 H2S與氧化應激作用的相關研究

老年男性和女性的氧化應激增加與骨形成減少密切相關，據(jù)報道，H2O2誘導各種類型細胞的凋亡或壞死[20]?；钚匝?ROS)抑制成骨細胞祖細胞的增殖和/或分化及鈣化過程，降低成骨細胞的骨形成，破壞纖連蛋白基質[21]。老年骨質疏松的婦女中也發(fā)現(xiàn)血漿抗氧化劑顯著減少[22]。CSE和CBS酶的底物L-半胱氨酸，可以保護細胞免受H2O2誘導的損傷。同時，數(shù)據(jù)表示H2S的內源性和外源性應用可以保護成骨細胞抵抗氧化應激。

研究發(fā)現(xiàn)H2S可以逆轉由H2O2抑制的mRNA水平和ALP(堿性磷酸酶)的活性，NaHS抑制osterix(osterix基因激活上調骨基質蛋白骨鈣素)表達，從而顯著逆轉H2O2，但對Runx2(Runx2基因作用效果同osterix)沒有影響。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)H2S影響成骨細胞膠原蛋白的表達。Banerjee等[24]發(fā)現(xiàn)成骨細胞MC3T3-E1細胞中可以產生TNF-α和NO及某些局部因子使H2O2產生上調，而H2S可以預防由H2O2引起的MC3T3-E1細胞膠原蛋白的丟失，NaHS的應用可以抑制了H2O2誘導TNF-α和NO產生的過程。同時H2S可通過抑制p38 MAPK(促分裂素原活化蛋白激酶)逆轉H2O2受損的SOD(超氧化物歧化酶)活性，p38 MAPK的活化降低了幾種組織中的SOD活性，H2S亦可以通過MAPK依賴機制的抗氧化作用保護MC3T3-E1細胞免受H2O2的損傷。

2.2 H2S調節(jié)Ca2+通道影響骨間質細胞(BMMSC)和骨密度

高同型半胱氨酸血癥與CBS缺陷患者相似具有多種表現(xiàn)，如近視、外差、智力遲鈍、血栓栓塞性疾病和骨質疏松的經典臨床特征[25]。在Liu等[7]研究中，發(fā)現(xiàn)H2S并非通過提高HCY水平發(fā)揮作用，同時HCY治療不能誘導BMMSC損傷。有試驗表明高同型半胱氨酸(HCY)水平可以刺激破骨細胞活性增加[26]。研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的H2S通過BMMSCs中的多個TRP通道的硫酸化維持細胞間Ca2 +體內平衡。與人體中的經典信號分子不同，氣體信號分子是具有自由滲透膜的獨特能力的目標特異性分子，H2S水平的降低導致BMMSC中的級聯(lián)反應，包括改變的Ca2+通道巰基化，Ca2+內流，Wnt /β級聯(lián)蛋白信號轉導和成骨分化，最終的結果是骨質疏松癥表型。但不同Ca2+通道的H2S控制的機制是未知的。因此，針對H2S缺陷相關疾病，早期了解H2S的作用機制對H2S供體療法的研究進展有著重要的作用[27]。

2.3 H2S對骨質疏松影響因素金屬蛋白酶(MMP)的相關研究

骨微血管重塑是骨結構和功能的主要預測因子。血管壁中50%的總蛋白是彈性蛋白，在重塑期間，彈性蛋白由特異性基質金屬蛋白酶(MMP)降解，被更硬的膠原蛋白替代(彈性蛋白的周轉比膠原蛋白的周轉慢1000倍)。組成性重塑的平衡對于骨的結構和功能是必要的。MMP的降解可引發(fā)各種病理狀況，包括骨質疏松癥，骨關節(jié)炎和心血管疾病。Thomas 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨著H2S從16μmol/L開始持續(xù)增加至40μmol/L，MMP活性降低。這與當前的認為較低的H2S的生理濃度是有益的觀點一致。有趣的是，硝普鈉(NO的供體)濃度為1μmol/L時MMP活性增加，MMP活性呈指數(shù)增加，硝普鈉3μmol/L能夠克服在H2S 40μmol/L下發(fā)生的MMP活性的降低，導致MMP活性的更顯著的指數(shù)增加。H2S抑制MMP的活化及氧化應激引起的膠原螺旋的破壞，NO通過與超氧化物結合并形成過氧亞硝酸鹽促進氧化應激，從而促進MMP活化和破壞膠原螺旋。H2S和NO之間存在復雜的作用在體內可能不相同，故在今后的研究需要該平衡在臨床上有利的方向傾斜。

3 H2S抵制骨質疏松癥與氧化還原酶SQRDL I264T的相關研究

骨質疏松癥和/或骨質疏松癥相關性狀的易感性基因/基因座通過基于基因的關聯(lián)研究大量被發(fā)現(xiàn)[29]。然而，只有少部分基因研究了其在骨重塑的功能機制[29]。由于疾病中最常見變異體的效應很小或不大[29]，很難證明遺傳變異體在疾病表型中的功能效果。Lagoutte等[30-32]研究發(fā)現(xiàn)并證明了H2S催化氧化還原酶SQRDL I264T變體對前骨MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化的重要作用。SQRDL在線粒體中表達，并且通過在線粒體H2S代謝過程的第一步驟中催化H2S的氧化來調節(jié)細胞H2S水平，并且SQRDL蛋白可在多個組織中表達[30,31]。過表達SQRDL I264T變體的前骨原MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化明顯好于過表達WT SQRDL細胞的成骨細胞的分化。H2S對骨重塑的已知作用可以解釋當前研究的發(fā)現(xiàn)，其證明了H2S催化酶SQRDL I264T變體對前骨原MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化的顯著作用。

SQRDL基因的3'下游區(qū)域的rs11079467 SNP(單核苷酸多態(tài)性)最接近rs12594514 SNP，并且顯示與該SNP最強的相關性(距離：70bp和R2=0.983)。rs11079467 SNP在隊列試驗中顯示與骨質疏松顯著相關，同時也證明肥胖和骨質疏松的相關性[32]，這或許與脂肪細胞和成骨細胞的祖細胞均來源于間充質干細胞有關[33]?？傊琒QRDL I264T nsSNP作為絕經后婦女的骨質疏松癥的顯著易感性變異，密切參與骨形成的基礎機制，對前成骨細胞的成骨細胞分化具有積極的影響。

4 外源性H2S對破骨細胞的影響

隨著對內源性H2S在各種組織器官研究的不斷深入，外源性H2S調節(jié)骨細胞代謝及功能的研究也不斷開展。內源性H2S通過誘導CSE的表達增加谷胱甘肽的產生[9]，依賴NFE2生物因子的抗氧化反應的激活[34]，調節(jié)氧化還原的平衡來調節(jié)破骨細胞。然而，H2S的外源性供體(NaHS)是否可以影響人類破骨細胞分化以及基礎配體的機制研究較少。

Laura等[35]發(fā)現(xiàn)NaHS通過劑量依賴性的降低h-OCs(人類破骨細胞)的分化，其機制主要是降低依賴RANKL(破骨細胞分化因子，可激活破骨細胞)的細胞ROS的水平和持續(xù)激活h-pre-OC中的NRF2(NFE2相關因子)抗氧化劑系統(tǒng)直接抑制h-OC的分化。此外，NaHS可以下調RANKL / OPG(護骨素)mRNA在骨髓間質干細胞中的表達，抑制RANKL / OPG比例，間接的抑制h-OCs分化。這些發(fā)現(xiàn)強烈支持NaHS直接和間接機制驅動調節(jié)h-OCs分化的能力，及在骨消耗性疾病的藥理學相關性。

5 小結

隨著我國人口老齡化日趨嚴重，骨質疏松癥患者逐漸增多，其預防和治療成為醫(yī)療界的重大課題。研究結果表明H2S的生物合成涉及雌激素調節(jié)骨形成的機制，同時H2S水平下降參與小鼠OVX的骨消耗效應。此外，H2S可抑制氧化應激、調節(jié)骨間質細胞Ca2+通道、促進MMP活性等預防治療骨質疏松癥(見圖1)。H2S水平的恢復是絕經后及長期使用Dext導致的骨質疏松癥潛在的新的治療方法。雖然H2S在骨代謝中起重要作用的精確機制有待檢查，但不可否認，氣體信號分子H2S作為一個有潛力的新興領域在骨質疏松的探索中有巨大的發(fā)展空間。H2S供體(例如NaHS)可以是現(xiàn)有藥物的有價值的替代物，其中大蒜油(證明是一種H2S供體)在OVX大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，可阻止骨質疏松癥的發(fā)展[36]。其抑制了人破骨細胞(h-OC)分化的信號級聯(lián)中的氧化還原敏感性，抑制h-OC形成和功能，而不誘導其前體的凋亡或急性毒性。因此，可以保留殘余的h-OCs功能，這對于OB-OC之間的通信是非常重要的。更有趣的是，Towler等[37]研究發(fā)現(xiàn)指甲角蛋白中的二硫化物含量可以反映骨的蛋白質和礦物質含量，間接預測骨質疏松癥和潛在性骨折。大量研究證據(jù)表明，H2S有著重要的臨床應用價值，但是由于有限的實驗模型、時間過程以及臨床應用存在的不穩(wěn)定因素，仍有局限性。

圖1 機體H2S的生產酶途徑及對骨質疏松癥作用機制Fig.1 The pathway of enzyme production of H2S and its effect mechanism on osteoporosis