AQP4與先天性腦積水的相關性研究

喬小放,趙紅梅,王海亮,王耀剛,趙 斌,麻彤輝,劉 軍*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.長春市第二醫(yī)院，吉林 長春130062)

*通訊作者

AQP4與先天性腦積水的相關性研究

喬小放1,趙紅梅2,王海亮1,王耀剛2,趙 斌1,麻彤輝1,劉 軍1*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.長春市第二醫(yī)院，吉林 長春130062)

目的 研究AQP4在腦積水鼠中的遺傳規(guī)律，探討其在腦積水中的作用。方法 隨機選擇未腦積水AQP4敲除雄鼠與AQP4敲除雌鼠交配，用其F1、F2、F3代建立遺傳圖譜，研究其遺傳規(guī)律。提取大腦組織總RNA，制作基因芯片研究其在遺傳中的作用。結(jié)果 AQP4基因敲除表型的是可遺傳的且與性別無關，同時并非單基因遺傳，且為常染色體遺傳；小鼠全基因芯片表明在AQP4敲除的背景下腦積水表型的發(fā)生有其它遺傳基因的參與。結(jié)論 通過制作遺傳圖譜以及小鼠基因芯片，證明AQP4在先天性腦積水發(fā)病機制中有重要的作用。

先天性腦積水;AQP4;基因芯片

(ChinJLabDiagn,2017,21:1252)

先天性腦積水(congenital hydrocephalus)是多發(fā)于嬰幼兒的遺傳性疾病，對患兒的神經(jīng)系統(tǒng)功能損害比較嚴重。腦脊液由大腦各腦室內(nèi)脈絡叢分泌，經(jīng)腦脊液循環(huán)通路，最后經(jīng)蛛網(wǎng)膜顆粒吸收進入血液。相關研究表明，腦脊液的產(chǎn)生和吸收回流的動態(tài)平衡、腦水腫的形成和消除的調(diào)控，均與水通道蛋白介導的高效跨膜和跨細胞水轉(zhuǎn)運有著密切關系。水通道蛋白4(Aquaporins-4，AQP4)是中樞系統(tǒng)的水通道之一，且對水分子轉(zhuǎn)運過程意義重大[1]。我們需要進行深入研究，明確先天性腦積水的發(fā)生機理，從根本上解決問題。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 巴比妥鈉、肝素鈉、EDTA(超級純，BBI)，K3PO4、NaHCO3、KCL(BBI)，Oligotex Direct mRNA kit(QIAGEN)，BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit(ENZO)。

1.2 實驗儀器 組織勻漿機(Fisher Scinertific)，電熱恒溫水浴鍋(上海之信)，電泳槽(北京六一廠)，凝膠成像儀(Beckman)，PTC100PCR儀(MJ Reseach)

1.3 探究AQP4遺傳規(guī)律 實驗設計按照于翔[1]的試驗方法來研究其遺傳規(guī)律，分析其遺傳家譜可以得出腦積水形成是由多種因素作用產(chǎn)生的常染色體遺傳疾病，且 AQP4基因的敲除可形成腦積水。

1.4 腦組織總RNA提取 取處于發(fā)病初期的AQP4-/-腦積水小鼠和相同年齡的AQP4+/+、野生小鼠各一只，過量巴比妥鈉麻醉，并按0.1 ml/只劑量腹腔注射0.1%肝素鈉，進行全身肝素化，用PBS經(jīng)左心室動脈全身灌流，取大腦一分為二，將其中一半放入15 ml離心管中，按TRIzol說明書加入裂解液。用組織勻漿器勻漿。另一半大腦-80℃保存并做好標記。將其余勻漿液勻分到5個eppendorf管中，按TRIzol說明書操作。

非變性瓊脂糖凝膠檢測所得RNA電泳后，凝膠成像儀掃描后觀察結(jié)果。測定總RNA在280 nm和260 nm的光吸收值，評價所得RNA的純度。1.5 基因芯片制作 本論文所用芯片為Affymetrix mouse430 2.0基因表達譜芯片，具體操作如下。

1.5.1 真核靶片段制備 純化總RNA，用QIAGEN’S Oligotex Direct mRNA kit從總RNA中提取mRNA，在Poly(A)+mRNA分離過程都會導致得到產(chǎn)物較稀濃，所以在cDNA合成前需對其進行濃縮。

1.5.2 雙鏈cDNA合成及純化 根據(jù)QIAGEN’S Oligotex Direct mRNA kit試劑盒說明書操作。

1.5.3 生物素標記cRNA合成 參考BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit說明書操作。

1.5.4 純化和質(zhì)控體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 采用QIAGEN RNeasy Columns純化，根據(jù)說明書進行實驗操作。

1.5.5 片段化cRNA 按說明書進行操作，將產(chǎn)物放置冰上,變性凝膠電泳鑒定。

1.5.6 雜交 根據(jù)AFFYMETRIX基因芯片說明書操作。

1.5.7 洗脫、染色、掃描芯片 具體步驟按AFFYMETRIX基因芯片說明書進行操作。

1.5.8 數(shù)據(jù)處理 讀取、處理數(shù)據(jù)用GCOS1.2應用軟件。

2 實驗結(jié)果

2.1 RNA電泳結(jié)果分析 分別取腦積水小鼠、AQP4-/-和AQP4+/+小鼠新鮮大腦組織提取大腦總RNA后，用1%非變性瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果表明有28S、18S和5S三條電泳帶(如圖1所示)，即所獲得的RNA是完整的。測定總RNA在280 nm和260 nm的光吸收值，OD260/280為2.0，可用于大腦全基因組芯片的制作。

A:Hydrocephalus B:AQP4-/- C:AQP4+/+

2.2 本論文完成3張Affymetrix mouse430 2.0基因表達譜芯片，包括腦積水-野生型(如圖2)，腦積水-AQP4-/-(如圖3)，野生型-AQP4-/-(如圖4)。散點圖的X軸代表對照組的信號值，Y軸為實驗組的信號值，紅色的點為實驗組和對照組該基因的Detection均為P，藍色的為兩組中有一個值不是P的,而黃色的點為兩組均為A ?；蛐酒Y(jié)果分析，腦積水小鼠與AQP4野生和AQP4-/-比較，腦部基因組的表達發(fā)生較大變化，具體見表1-表4。

圖2 腦積水小鼠與野生型小鼠基因表達

圖3 腦積水小鼠與AQP4-/-小鼠基因表達

圖4 野生型小鼠與AQP4-/-小鼠基因表達

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatiogliamaturationfactor，beta20．8-4．2RIKENcDNA4732486I23gene38．1-2．5hypotheticalproteinA230091H2325．4-3．3RIKENcDNA1700047I17gene54．1-2．3

3 討論

本實驗研究 AQP4 敲除小鼠在遺傳性腦積水作用，研究結(jié)果揭示了 AQP4 在先天性腦積水發(fā)病的相關性，且在遺傳規(guī)律中起著重要作用，并為進一步研究水通道蛋白在先天性腦積水發(fā)病機制中有重大意義。

目前，國際上關于AQP4與先天性腦積水的相關研究比較少，但本實驗結(jié)果與劉軍[2]研究結(jié)果相符合，證明了AQP4在腦積水發(fā)病機理中有重要的作用。引起先天性腦積水的遺傳因素和發(fā)病機理都比較復雜，目前關于遺傳學層次研究發(fā)現(xiàn)了多個相關基因，但已被確認與人類腦積水相關的只有一個[3]。腦積水的產(chǎn)生原因有很多，如代謝產(chǎn)物過多對顱內(nèi)血管壁有一定傷害，影響腦脊液的重吸收和彌散，發(fā)生腦積水[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤、壓力過大等發(fā)生的腦積水中，AQP4 基因敲除后，腦水腫清除將增加難度[5]。AQP4 也被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)易感性方和細胞遷移面起作用[6]。但是目前對其發(fā)病機制仍然沒有定論。AQP4 影響神經(jīng)興奮性的機制尚不清楚,但可能與AQP4 和細胞外間隙容量或者星形膠質(zhì)細胞中鉀離子通道的改變有關[7]。

表2 與野生型小鼠相比較，腦積水腦部表達水平上調(diào)較大(Signal Log Ratio>2.0)的主要基因

表3 與AQP4敲除無腦積水表型小鼠相比較，腦積水腦部表達水平下調(diào)較大(Signal Log Ratio<-2.0)的主要基因

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatiogliamaturationfactor，betaDNAsegment，Chr2，Brigham&Women＇s20．8-4．5Genetics1356expressed36．2-2．9hypotheticalproteinA230091H2325．4-3．6

表4 與AQP4敲除無腦積水表型小鼠相比較，腦積水腦部表達水平上調(diào)較大(Signal Log Ratio>2.0)的主要基因

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatioRIKENcDNA1700001C02gene22734．1cysteine?richhydrophobicdomain15051．9Transcribedlocus193．92．3atonalhomolog1(Drosophila)318．92．4RIKENcDNA2310007B03gene182．71．5LOC4338127247．53．4

本研究證明AQP4基因與先天性腦積水具有相關性。對小鼠全基因芯片中腦積水表型與無腦積水表型的AQP4敲除小鼠大腦差異基因表達進行分析發(fā)現(xiàn)了若干在腦積水大腦顯著上調(diào)和下調(diào)的基因。而這些基因并無與腦積水相關報道，因此，與AQP4敲除背景下腦積水表型的關系需要進一步研究。

綜上所述，AQP4在先天性腦積水發(fā)病機理中起到了重要作用，希望通過本篇研究能為先天腦積水的進一步研究和治療提供有利的依據(jù)，對科研和醫(yī)療工作者有所幫助。

[1]于 翔.AQP4在先天性腦積水發(fā)病機理中的作用[D].吉林：吉林大學，2013.

[2]劉 軍.水通道蛋白在先天性腦積水和腦水腫發(fā)病機理中的作用[D].吉林：東北師范大學，2007.

[3]Joute M，F(xiàn)eldman E，Yates J，et al.Refining the genetic location of the gene for X linked hydrocephalus within Xq28[J].J Med Genet,1993,30(3):214.

[4]劉黎黎，侯新琳，周叢樂，等.以腦積水起病的甲基丙二酸尿癥合并同型半胱氨酸血癥1例報道[J].中國當代兒科雜志，2013，15:313．

[5]Papadopoulos MC,Manley GT,Krishna S,et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema[J].FASEB J,2004,18:1291.

[6]Saadoun S,Papadopoulos MC,Hara-Chikuma M,et al.Impairment of angiogenesisand cell migration by targeted aquaporin-1 genedisruption[J].Nature,2005,434(7034):786.

[7]BinderDK,PapadopoulosMC,Haggie PM,et al.In vivomeasure-ment ofbrain extracellular space diffusion by cortical surface pho-tobleachin[J].J Neurosci,2004,24(37):8049.

The research of AQP4 and congenital hydrocephalus

QIAOXiao-fang,ZHAOHong-mei,WANGHai-liang，etal.

(1.TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China;2.TheSecondHospitalofChangchunCity,Changchun130062,China)

Objective To study the water channel protein 4 (Aquaporins-4,AQP4) in the genetic rule of hydrocephalus rats,to explore the role of AQP4 inherited in hydrocephalus.Methods By randomly selecting not seen hydrocephalus AQP4 knockout mice AQP4 knockout female mating,with its F1,F2,F3 generations to establish genetic map,genetic study on its rule.Extracting total RNA of brain tissue,making its role in the genetic gene chip research.Results In the phenotype of AQP4 knockout is heritable and has nothing to do with sex,at the same time is not a single gene heredity,and for euchromosome inheritance;Entirely on gene chip showed that AQP4 knock out mice under the background of the occurrence of hydrocephalus phenotype with the participation of other genes.Conclusion By making genetic map and gene chip in mice,prove that AQP4 has important role in the pathogenesis of congenital hydrocephalus.

Congenital hydrocephalus,AQP4,gene chip

1007-4287(2017)07-1252-04

R651.1

A

2016-05-21)