雌激素與尾懸吊法導(dǎo)致雄性C57小鼠骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究

程強(qiáng) 康文博 孟嘉 李碩 劉剛 趙建寧*

1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210046； 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部藥理學(xué)教研室，陜西 西安 710032

骨質(zhì)疏松以骨含量下降，骨結(jié)構(gòu)退化為基本特征，往往引發(fā)疼痛和骨折[1]。目前大多數(shù)研究集中于卵巢切除和絕經(jīng)后導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，男性骨質(zhì)疏松方面的研究較少。男性在青年時(shí)期可比女性獲得更高的骨量峰值，并且男性出現(xiàn)骨量丟失的開始時(shí)間遲于女性，但骨質(zhì)疏松性骨折給男性患者造成損傷絲毫不遜于女性[2]。過去的觀點(diǎn)認(rèn)為雄激素水平下降在男性原發(fā)性骨質(zhì)疏松過程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，雄激素完全不敏感綜合征患者仍具有正常生長體形和骨骼成熟，且單一的雄激素不能彌補(bǔ)由于雄激素受體功能喪失的骨質(zhì)丟失[4]，表明雄激素在維持骨量過程中的作用可能沒有我們想象中的那么強(qiáng)大。在雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松模型中，雌激素比雄激素更能有效地反映骨轉(zhuǎn)化水平和骨密度[5,6]。臨床研究證實(shí)雌激素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有良好的治療作用，這一過程主要是通過雌激素受體 (ER)α和β實(shí)現(xiàn)對骨骼代謝的調(diào)節(jié)[7,8]，但是其具體作用機(jī)制尚未完全明確。

尾懸吊是一種研究失重與廢用的方法，最早在1979年由Morey等[9]提出，廣泛運(yùn)用于研究微重力環(huán)境下動物肌肉萎縮和骨質(zhì)疏松方面的研究。不同年齡，性別以及基因背景骨質(zhì)疏松程度差異性較大，目前以SD或者Wistar大鼠最為常用，但在藥物效應(yīng)評價(jià)方面，大鼠骨皮質(zhì)重建活性較低不利于于評價(jià)[10]，同為嚙齒類動物的小鼠也很常見，其中以個(gè)體差異性較小、適應(yīng)性佳的C57小鼠最為常用[11]，處于生長期的小鼠對尾懸吊最敏感[12]。

為了進(jìn)一步了解雌激素以及雌激素受體在尾懸吊導(dǎo)致的小鼠骨質(zhì)疏松中的作用，本文在前期建立C57小鼠骨質(zhì)疏松模型基礎(chǔ)上，通過給予雌激素以及雌激素受體拮抗劑ICI182,780干預(yù)，探討雌激素對雄性C57小鼠骨質(zhì)疏松的作用及其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組和造模

32只10周齡雄性C57BL/6J小鼠22～23 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后按照隨機(jī)數(shù)表法分為4組，即對照組(control，C)，模型組(model，M)，雌激素組(estrogen，E2)，雌激素+雌激素受體抑制劑組(estrogen+ICI182,780，E+I)。根據(jù)之前的方法除對照組外建立小鼠尾懸吊模型[13]，所用試劑溶于10%乙醇溶液中，C和M組分別皮下注射10%乙醇溶液50 μL/d天，E2組給予雌激素1 μg/d，E+I組分別給予雌激素1 μ和ICI182,780 100 μg/d，持續(xù)兩周。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動物使用遵守“第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例”。

1.2 主要試劑

獸用雌二醇注射液(杭州動物藥品廠)，小鼠麻醉劑(5%水合氯醛溶液)，雌激素ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，小鼠TRAP，OPG，NMDA免疫組化染色試劑盒(中杉金橋)，ICI182,780(北京樂博生物科技有限公司)，小鼠NR2A、Runx2-抗(美國abcam公司)，小鼠來源二抗(西安壯志生物科技有限公司)。

1.3 標(biāo)本采集

所用實(shí)驗(yàn)動物于第15d脫頸致死，取小鼠眼球血后離心得血清置于-20℃保存，用于ELISA試劑盒檢測血清中雌激素水平，取雙側(cè)股骨用0.9%氯化鈉注射液浸潤的紗布包裹，保存于-70℃。

1.4 Micro CT掃描及重建分析

顯微CT是一種非侵入性評估手段，為骨質(zhì)疏松程度提供準(zhǔn)確的定性及定量分析[14]。每組取4根右側(cè)股骨，用小動物顯微CT(Inveon，德國西門子公司)掃描重建。選取股骨髁生長板近端0.5～1.5 mm處和股骨正中1.0 mm區(qū)域作為興趣區(qū)(region of interest，ROI)分析小梁骨相對體積(bone volume/total volime，BV/TV)、小梁骨數(shù)量(trabecular bone number，Tb.N)、小梁骨分離度(trabecular bone separation，Tb.Sp)、小梁骨厚度(trabecular bone thickness，Tb.Th)，皮質(zhì)骨BMD(bone mineral density)，表長度(cortical area，Ct.Ar)、厚度(cortical thickness，Ct.Th)等指標(biāo)。采用Mimics軟件(版本10.0，美國Materialise公司)建立ROI三維圖像。

1.5 生物力學(xué)檢測

每組取4根左側(cè)股骨，利用電子三點(diǎn)彎曲疲勞試驗(yàn)機(jī)(型號ELF3520，美國BOSE公司)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測試，測試股骨中段生物力學(xué)性能。參數(shù)設(shè)置：速度1.2 mm/min，跨距8 mm至股骨斷裂。隨后使用游標(biāo)卡尺量取斷端內(nèi)外徑以及皮質(zhì)骨厚度，重復(fù)3次取平均值。直接記錄最大載荷(nax loading)，根據(jù)檢測結(jié)果繪制載荷-變形曲線計(jì)算彎曲彈性模量(Elastic modulus)[13]。

1.6 形態(tài)學(xué)檢查

取各組剩余的右側(cè)股骨，固定于4%多聚甲醛溶液中，EDTA脫鈣，石蠟包埋[13]，沿冠狀面切片進(jìn)行OPG、TRAP以及NMDA免疫組化染色，分別觀察成骨、破骨細(xì)胞形態(tài)以及NR2A受體表達(dá)情況。每根股骨各選取三張400倍鏡染色圖片，使用Image Pro Plus圖像分析軟件(版本6.0，美國Cybernetics公司)統(tǒng)計(jì)骨表面成骨細(xì)胞數(shù)(N.Ob/BS)以及破骨細(xì)胞數(shù)(N.Oc/BS)并取平均值，測量三張片子NR2A平均光密度值。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blotting)

取各組剩余的左側(cè)股骨，選定股骨遠(yuǎn)端1.5 mm區(qū)域的骨，剔除骨膜，PBS沖洗骨髓腔，用錫箔紙包裹后置于-70℃保存12 h后置于液氮中。用研磨方法提取骨蛋白[15]，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶洗封閉，NR2A、Runx2一抗孵育過夜，抗鼠二抗孵育1 h以上。β-actin作為內(nèi)參，將對照組β-actin的光密度值設(shè)為1，使用Tanon 5200全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍攝和分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

小鼠一般狀態(tài)良好，無意外死亡，體重及血清雌激素變化見表1，尾懸吊小鼠3 d后體質(zhì)量達(dá)到最低點(diǎn)，隨后緩慢上升，至14 d時(shí)M組小鼠體重仍顯著低于C組(P<0.05)，但是與E+I組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。M組小鼠血清雌激素水平較C組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而E+I和E組小鼠血清雌激素含量顯著高于C和M組。

表1 不同組小鼠體質(zhì)量與雌激素水平±s)Table 1 Changes of mice body weight and estrogen level in different groups(±s)

與C組比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01，下同。

2.2 顯微CT掃描

顯微CT掃描結(jié)果見表2，M組小梁骨多數(shù)參數(shù)下降，與C組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E組各項(xiàng)參數(shù)顯著改善并好于M組，與C組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E+I組各參數(shù)水平與M組類似。M組皮質(zhì)骨BMD較C組下降明顯，E組皮質(zhì)骨有部分指標(biāo)好于C組。E+I組的皮質(zhì)骨指標(biāo)較C組和E組明顯下降，但是與M組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1可見M組和E+I組股骨遠(yuǎn)端骨小梁區(qū)域較C組破壞，空洞明顯，各組皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)完整但M組和E+I組明顯變薄。

表2 不同組小鼠小梁骨和皮質(zhì)骨參數(shù)±s)Table 2 Changes of trabecular bone parameters in different groups(±s)

圖1 不同組小鼠股骨ROI三維重建圖像示意圖Fig.1 3D pictures of ROI of the femur in different groups

2.3 生物力學(xué)檢測

生物力學(xué)檢測結(jié)果見表3，尾懸吊導(dǎo)致M組和E+I組的生物學(xué)指標(biāo)顯著下降，其中最大載荷、彈性模量等指標(biāo)較C組顯著下降，M組與E+I組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 形態(tài)學(xué)變化

圖3為不同組股骨遠(yuǎn)端形態(tài)學(xué)示意圖，統(tǒng)計(jì)各組單位長度內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)(表5)，發(fā)現(xiàn)M組顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而E組成骨細(xì)胞數(shù)較M組顯著上升，使用雌激素抑制劑干預(yù)之后，成骨細(xì)胞數(shù)目明顯下降；統(tǒng)計(jì)各組單位長度內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)(表5)，M組中破骨細(xì)胞數(shù)較對照組增多，而E組和E+ICI組中破骨細(xì)胞數(shù)無明顯變化。統(tǒng)計(jì)不同組NR2A平均光密度值(表5)，M組較C組顯著下降，雌激素干預(yù)后E組顯著上升，應(yīng)用雌激素受體抑制劑后上升勢頭得到抑制。

表3 不同組小鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)±s)Table 3 Mechanical properties of the femur in different groups(±s)

2.5 WB

圖3A是不同組小鼠骨蛋白的表達(dá)示意圖，可見尾懸吊2 w后，M組NR2A(圖3B)以及Runx2蛋白(圖3C)表達(dá)顯著降低，E組表達(dá)升高，使用雌激素受體抑制劑后，上述蛋白表達(dá)水平受到抑制。

圖2 不同組小鼠股骨遠(yuǎn)端形態(tài)學(xué)示意圖(n=4，比例尺：200 μm)Fig.2 Morphological changes of the distal femur in different groups (n=4, scale bar: 200 μm)

表5 不同組小鼠骨小梁成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)±s)Table 5 Number of osteoblasts and osteoclasts in the trabecular bone in different groups(±s)

圖3 不同組小鼠骨相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of osteogenesis-associated proteins in different groups

3 討論

尾懸吊兩周就能引起小鼠骨質(zhì)的顯著丟失，其具體機(jī)制尚未完全清楚。雌激素作為一種內(nèi)源性激素，具有較好的耐受性，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等高代謝型骨質(zhì)疏松有較好的治療效果[16]。研究發(fā)現(xiàn)雌激素在雄性體內(nèi)具有重要作用，且這一過程與雌激素受體的表達(dá)水平密切相關(guān)[17]。性激素主要來源于睪丸，卵巢，少部分來源于腎上腺。嚙齒類動物因其特殊的生理構(gòu)造，懸尾狀態(tài)下雄鼠的睪丸會回縮進(jìn)入腹腔，造成睪酮合成水平下降[18]，而雄鼠體內(nèi)的雌激素大部分由睪酮轉(zhuǎn)化而來，因而懸尾的直接后果導(dǎo)致了體內(nèi)雌激素水平的明顯下降，這與本文的研究結(jié)果相符，懸尾兩周后M組小鼠雌激素水平較C組下降了50%左右。

雌激素是脂溶性且易被胃酸分解，本文中將雌激素溶于花生油中，并通過皮下注射的方式進(jìn)行給藥，既提高了藥物吸收率又避免肌肉注射引起局部組織壞死。在劑量選擇方面參照文獻(xiàn)[19]，該生理劑量的雌激素已經(jīng)被證實(shí)具有較好的骨量、骨顯微結(jié)構(gòu)保護(hù)作用。ICI182,780是一種非特性雌激素受體抑制劑，能夠無差別阻斷ERα和β[20]。研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體缺陷患者，其體內(nèi)雌激素水平正常，但是骨質(zhì)流失現(xiàn)象卻十分嚴(yán)重[21]，而在芳香化酶缺陷的患者中，雄激素正常而雌激素水平偏低，同樣也存在此現(xiàn)象，此外ERα、β基因敲除小鼠也出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松[22]。本文發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充外源性雌激素之后，能較好地抑制骨質(zhì)流失，較對照組并未出現(xiàn)顯著骨容量下降。使用雌激素受體抑制劑干預(yù)后骨質(zhì)流失并未得到顯著改善，表明在此過程中雌激素通過雌激素受體發(fā)揮骨保護(hù)作用。

谷氨酸是一種突觸興奮性遞質(zhì)，通過調(diào)節(jié)cbfa1/Runx2信號通路促進(jìn)骨組織中成骨細(xì)胞的增殖和分化[23]，介導(dǎo)谷氨酸釋放的離子型谷氨酸受體NMDA受體的亞型2A(NR2A)表達(dá)十分活躍[24]。本文中發(fā)現(xiàn)尾懸吊2w后，M組小鼠股骨遠(yuǎn)端NR2A表達(dá)量顯著下降，E組表達(dá)水平明顯回升并超過C組，E+I組的NR2A仍處于較低水平。反映成骨細(xì)胞增殖分化活性的重要分子Runx2，其表達(dá)趨勢與NR2A基本一致，表明雌激素與雌激素受體結(jié)合后，可能參與了促進(jìn)NMDA受體激活和谷氨酸釋放的過程，最終引發(fā)成骨細(xì)胞增殖。

男性隨著年齡增長體內(nèi)雄激素水平逐漸下降，但是雌激素水平在青年與老年時(shí)期差別大不，這部分解釋了老年男性發(fā)生發(fā)生骨質(zhì)疏松的概率低于老年女性[25]，因此將雌激素水平作為判定骨質(zhì)疏松的指標(biāo)比雄激素更加具有說服力。本文發(fā)現(xiàn)使用雌激素受體抑制劑之后，雌激素抗骨質(zhì)疏松的效應(yīng)基本喪失，說明雌激素受體在抗骨質(zhì)疏松中過程中起關(guān)鍵作用，雌激素和雌激素受體兩者作用相輔相成，缺一不可。但是長期運(yùn)用雌激素來的不良反應(yīng)，大大限制了其在臨床的運(yùn)用。本文發(fā)現(xiàn)雌激素發(fā)揮骨質(zhì)疏松作用，可能是通過促進(jìn)NR2A受體表達(dá)刺激谷氨酸釋放來實(shí)現(xiàn)的，這就為將來尋找新型抗骨質(zhì)疏松藥物提供了思路：直接調(diào)節(jié)NMDA受體的藥物可能具有類雌激素效應(yīng)，同時(shí)也避免了運(yùn)用雌激素帶來的不良反應(yīng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在尾懸吊導(dǎo)致的雄性小鼠骨質(zhì)疏松模型中，雌激素通過雌激素受體，可能參與激活骨組織中的NR2A表達(dá)升高，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，發(fā)揮骨保護(hù)的作用。本文進(jìn)一步確認(rèn)了雌激素在雄性小鼠抗骨質(zhì)疏松過程中的重要作用，同時(shí)為未來尋找適合的骨質(zhì)疏松藥物提供了一個(gè)新的思路。