針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨折的預(yù)防作用

羅成斌 蔣春彥 朱珠 嚴(yán)晶 沈黎 李金艷 陳穎 趙榮*

1. 大理州中醫(yī)醫(yī)院，云南 大理 671000 2. 云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650000 3. 昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是危害婦女身心健康的常見病，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種由內(nèi)分泌、營養(yǎng)、免疫、遺傳等多種復(fù)合因素引起的代謝性疾病，是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加、易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。其所導(dǎo)致的骨折為脆性骨折，多發(fā)于脊柱、髖部和腕部，其中髖部骨折具有很高的致死率和致殘率。目前用于防治OP的藥物均存在一定的副作用[2]。越來越多的證據(jù)[3]顯示，生物物理干預(yù)可能提供一種安全、有效抑制并逆轉(zhuǎn)OP的方法，使骨量增加而不破壞骨重建過程。研究[4]表明針刺能夠防治骨質(zhì)疏松癥，但對(duì)于針刺防治骨質(zhì)疏松性骨折仍缺乏針對(duì)性強(qiáng)、證據(jù)確鑿的研究。我們前期的研究通過試驗(yàn)證實(shí)了以足三里、腎俞、大杼為主穴的針刺方法能夠通過影響雌激素、骨鈣素、降鈣素等骨代謝指標(biāo)來改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨顯微結(jié)構(gòu)[5,6]；通過臨床證實(shí)以足三里、腎俞、大杼為主穴的針刺方法能夠明顯改善骨質(zhì)疏松患者的生存質(zhì)量，而且在研究當(dāng)中通過實(shí)驗(yàn)記錄和隨訪記錄，我們發(fā)現(xiàn)針刺能夠明顯地干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生[7]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制備

200只220～280 g 6月齡雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠(購自昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。大鼠自由攝食和飲水，控制溫度在22±1℃和光照為12/12(光/暗)。所有大鼠在麻醉下進(jìn)行卵巢切除術(shù)(腹腔注射200 g/L的烏拉坦胺1.0 mL/100 g，中國醫(yī)療化學(xué)有限公司提供)。在相同條件下飼養(yǎng)3個(gè)月，檢測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型成功后，將大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(C，n=35)，阿侖膦酸鈉組(AS，n=35)和針刺組(A，n=35)。實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作指南(所有試驗(yàn)均征得相關(guān)動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)和使用協(xié)會(huì)同意)。

1.2 阿侖膦酸鈉和針刺治療方法

上午8:00-12:00，阿侖膦酸鈉組大鼠皮下注射阿侖膦酸鈉。阿侖膦酸鈉(10 mg/片，默克公司，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20130557)，在PBS溶液中分解。按照200 μg/kg劑量換算的原則，阿侖膦酸鈉10 mg/片溶于5mLPBS溶液中，0.1 mL/kg皮下注射，每日1次，持續(xù)6個(gè)月。

上午8:00-12:00點(diǎn)，針刺組大鼠針刺雙側(cè)“足三里”、“大杼”、“腎俞”，留針3 min。每日1次，連續(xù)6個(gè)月。針具采用特制針(中國醫(yī)療設(shè)備有限公司提供)，直徑0.22 mm，長為10 mm，刺入時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)的壓力。腧穴定位根據(jù)Experiment Hcupunctwrology標(biāo)準(zhǔn)(林和王，1999)。足三里位于下肢的外側(cè)，外踝上大約1 mm；腎俞位于第二腰椎旁2 mm；大杼位于第一胸椎旁2 mm。所有大鼠均在自然狀態(tài)下，操作時(shí)研究人員以手輕輕固定，治療過程中大鼠無明顯疼痛或不適，可以自由活動(dòng)。

1.3 指標(biāo)檢測方法

1.3.1 在體股骨骨折最小外力檢測：治療6個(gè)月后，各組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行在體股骨骨折最小外力檢測實(shí)驗(yàn)。大鼠麻醉(腹腔注射麻醉)后，將右側(cè)下肢股骨上下兩端固定，應(yīng)用在體股骨骨折最小外力檢測裝置(昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自制設(shè)備)，依次通過遞增鐵片高度，鐵片(長70 cm，寬1 cm，重3.95 kg)自由墜落，從距離大鼠下肢1 cm高度開始自由落體向下落在大鼠股骨上段處(鐵片下端邊緣落在股骨中點(diǎn)處)。高度每次增加1 cm，直到大鼠股骨出現(xiàn)骨折為止。用小型X光機(jī)(云南省中醫(yī)學(xué)院提供)攝片觀察骨折的情況，并記錄發(fā)生骨折的情況和大鼠股骨出現(xiàn)骨折時(shí)鐵片墜落的高度。計(jì)算重力勢能(J=9.8×鐵片重量×高度)。

1.3.2 骨密度(BND)檢測：麻醉后，用DFDE-X骨密度儀 (昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供) 掃描大鼠的右側(cè)股骨。掃描參數(shù)是1.0 mm×1.0 mm，60 mm/s，12.00 cm，REV.3.9.3/2.1.0。對(duì)所有標(biāo)本均進(jìn)行分析并計(jì)算出平均水平。

1.3.3 新鮮股骨形態(tài)學(xué)檢測：治療6個(gè)月，完成在體股骨骨折最小外力檢測和骨密度檢測后，安樂死處死所有動(dòng)物，立即剝?nèi)⊥暾覀?cè)股骨全長，剔除皮膚、肌肉，取股骨，除凈附著骨上的肌肉和軟組織，快速稱重后，用生理鹽水紗布包裹，置于-20℃保存。用感量為0.1 g的電子天平秤(云南省計(jì)量測試技術(shù)研究院提供)稱量股骨的重量。用精確度為0.02 mm游標(biāo)卡尺(云南省計(jì)量測試技術(shù)研究院提供)測定其長度及近、中、遠(yuǎn)三點(diǎn)的橫徑。三點(diǎn)橫徑測量點(diǎn)：股骨遠(yuǎn)端(遠(yuǎn)端股骨髁上至股骨髁)、中端(股骨干中點(diǎn)內(nèi)外側(cè))、近端(股骨頭至股骨轉(zhuǎn)子下)。

1.3.4 力學(xué)性能檢測：實(shí)驗(yàn)電子機(jī)械測試機(jī)(昆明理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)材料中心提供)從日本島津公司購進(jìn)，機(jī)械性能測定標(biāo)準(zhǔn)選用中國標(biāo)準(zhǔn)，取大鼠股骨做壓縮、拉伸中的最大值載荷、最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)載荷、斷裂點(diǎn)應(yīng)力等系數(shù)測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結(jié)果

各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結(jié)果±s，n=5)Table 1 The measurement results of the minimal external force in rats of each group(±s，n=5)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

針刺組和阿侖膦酸鈉組在體股骨骨折最小外力均高于對(duì)照組(P<0.05)；針刺組和和阿侖膦酸鈉組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠股骨BMD檢測結(jié)果

各組大鼠股骨BMD檢測結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠股骨BMD檢測結(jié)果±s)Table 2 Detection results of BMD in the femur of ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

針刺組和阿侖膦酸鈉組股骨骨密度均高于對(duì)照組(P<0.05)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠新鮮股骨骨形態(tài)學(xué)測試結(jié)果

各組大鼠新鮮股骨骨形態(tài)學(xué)測試結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠新鮮股骨骨形態(tài)學(xué)測試結(jié)果±s)Table 3 Morphological test results of fresh femoral bone in rats of each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與阿侖膦酸鈉組比較，#P<0.01

針刺組股骨近端橫徑明顯變短與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與阿侖膦酸鈉組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4.1 壓縮

各組大鼠股骨壓縮生物力學(xué)指標(biāo)檢測見表4。

表4 股骨壓縮生物力學(xué)指標(biāo)±s)Table 4 ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與針刺組比較，#P<0.05

阿侖膦酸鈉組最大值載荷、最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)載荷、斷裂點(diǎn)應(yīng)力均高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)載荷、斷裂點(diǎn)應(yīng)力均高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；阿侖膦酸鈉組最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)應(yīng)力均高于針刺組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

2.4.2 拉伸

各組大鼠股骨拉伸生物力學(xué)指標(biāo)檢測見表5。

表5 股骨拉伸生物力學(xué)指標(biāo)±s)Table 5 ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與針刺組比較，#P<0.01

與對(duì)照組比較，阿侖膦酸鈉組和針刺組的最大值載荷、斷裂點(diǎn)載荷均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，阿侖膦酸鈉組和針刺組最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)應(yīng)力有均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表5)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)中將之歸于“骨痿”范疇，《素問·痿論》中記載：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”。其病因病機(jī)主要為腎虧、脾虛和骨枯。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論“腎主骨”、“脾主肌肉”、“骨會(huì)大杼”，我們選取了具有健脾益腎強(qiáng)骨作用的足三里、腎俞、大杼；根據(jù)其證型多為虛證，采用行針手法中的捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，并將這種用于治療骨質(zhì)疏松癥的針刺治療方法稱為“健脾益腎強(qiáng)骨針法”。根據(jù)骨的生長代謝周期，將治療時(shí)間定為6個(gè)月。股骨骨折是骨質(zhì)疏松癥一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，它不僅導(dǎo)致功能喪失，而且有較高的致殘率和致死率。在我們前期關(guān)于骨質(zhì)疏松癥研究的基礎(chǔ)上，在針刺治療6個(gè)月后，我們進(jìn)行了在體股骨骨折最小外力、新鮮股骨骨形態(tài)學(xué)、骨密度和骨力學(xué)性能等測試，并探討了針刺療法對(duì)骨質(zhì)疏松性股骨骨折的干預(yù)機(jī)制。

3.1 在體股骨骨折最小外力的測試

通過表1可以看出，與對(duì)照組相比，針刺組、阿侖膦酸鈉組在體股骨抗外力的作用增強(qiáng)。但這個(gè)結(jié)果不能表明是股骨的抗外力能力增強(qiáng)，因?yàn)檫€有皮毛和肌肉的作用。針刺增強(qiáng)了在體股骨抗外力的作用究竟是通過肌肉還是骨，亦或是兩者共同所起的作用？目前的研究主要是集中在對(duì)離體股骨的檢測上，在體股骨抗骨折能力檢測應(yīng)是今后研究針刺防治骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)方向。

3.2 新鮮股骨骨形態(tài)學(xué)測試

骨是有生命的器官，這是它同工程材料相比最大的特點(diǎn)，為了適應(yīng)不斷變化的力學(xué)環(huán)境，骨在不斷地進(jìn)行結(jié)構(gòu)的優(yōu)化和重建，骨具有功能適應(yīng)性，即：骨總是以最少的材料，最合理的形狀、尺寸和最佳的材料成分比來承擔(dān)最大的載荷。根據(jù)Wolff定律：骨的生長、吸收、重建都與骨的受力狀態(tài)有關(guān)。通過表2可以看出，與對(duì)照組相比，針刺能夠促進(jìn)股骨適應(yīng)性形態(tài)學(xué)的改變，近端股骨頭橫徑變小，表明其受力，從力學(xué)的角度來講，發(fā)生骨折的可能性變小。反映了股骨作為有生命的器官適應(yīng)性力學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。

3.3 骨密度

骨密度(BMD)能間接反映骨量多少，是目前用于診斷骨質(zhì)疏松癥、預(yù)測脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)的最佳定量指標(biāo)[8]。何勁等[9]研究發(fā)現(xiàn)，針刺可在一定程度上提高骨密度。通過表3可以看出，與對(duì)照組相比，針刺能夠提高骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨密度。針刺可以在一定程度上提高骨密度，其臨床作用機(jī)制可能是針刺一方面通過對(duì)局部穴位的刺激，改善局部血液循環(huán)，同時(shí)通過對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)、器官的生理、病理狀態(tài)進(jìn)行影響和調(diào)整，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從多種途徑阻止OP的發(fā)展，體現(xiàn)了針刺法對(duì)機(jī)體的影響是整體全面的調(diào)節(jié)。

3.4 力學(xué)性能

骨生物力學(xué)是對(duì)骨質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)的可靠方法[10]，生物力學(xué)參數(shù)是評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松的重要指標(biāo)[11]。李晶等[12]研究發(fā)現(xiàn)針刺與艾灸對(duì)去勢后大鼠的骨生物力學(xué)指標(biāo)有良性調(diào)整作用。針刺可以提高SAMP6小鼠股骨最大載荷量、彈性載荷和彈性撓度，增強(qiáng)骨的強(qiáng)度[13]。通過表4、表5可以看出，與對(duì)照組相比，針刺能升高股骨最大值載荷、最大值應(yīng)力、斷裂點(diǎn)載荷、斷裂點(diǎn)應(yīng)力。

4 結(jié)論與展望

“健脾益腎強(qiáng)骨針法”具有預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨骨折的作用。其作用機(jī)制可能與針刺促進(jìn)股骨的形態(tài)適應(yīng)，提高骨密度，增加股骨的抗拉伸能力以提高股骨的抗外力性能相關(guān)。針刺療法與阿侖膦酸鈉均能提高實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠在體股骨骨折最小外力，但針刺療法的作用機(jī)制與阿侖膦酸鈉不完全相同。針刺療法預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨骨折的作用可能還與針刺療法對(duì)肌肉的影響有關(guān)。在體股骨抗骨折能力檢測應(yīng)是今后研究針刺防治骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)方向。同時(shí)，大鼠不能像人類一樣直立行走，股骨受力狀態(tài)與人類有較大差異，此研究結(jié)果能否為臨床防治骨質(zhì)疏松性股骨骨折提供依據(jù)，仍需要更多的證據(jù)。