中醫(yī)不同治法對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼、骨骼肌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)含量影響的比較研究

金成日 姜奧 楊芳

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110100 2. 沈陽(yáng)市第五人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110023 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥將會(huì)越來(lái)越引起人們的重視。中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松癥方面具有副作用小、費(fèi)用低、遠(yuǎn)期療效較佳的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)改善全身情況以提高患者的生活質(zhì)量。臨床上常用的中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥的方法有補(bǔ)腎方法、健脾方法、活血化瘀方法等。

本研究采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)研究骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨骼、骨骼肌甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathyroid hormone-related peptide，PTHrP)含量變化，觀察補(bǔ)腎方法、健脾方法、活血化瘀方法對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治效果和作用機(jī)制的異同。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)Wistar雌性大鼠60 只，體重(200±50)g，4～5月齡，未曾交配，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)：1100170659。

先將術(shù)前大鼠按照隨機(jī)分組的方法分為正常組(8只)、手術(shù)組。摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。術(shù)后7d 將手術(shù)組存活的大鼠隨機(jī)分為4組(每組8只)，即：模型組、補(bǔ)腎方法組(簡(jiǎn)稱補(bǔ)腎組)、健脾方法組(簡(jiǎn)稱健脾組)、活血方法組(簡(jiǎn)稱活血組)。

1.2 藥品

補(bǔ)腎組用藥左歸丸，制備方法：按大鼠每千克體重一日藥量計(jì)算，熟地2.52 g，山藥1.26 g，枸杞子1.26 g，山茱萸1.26 g，川牛膝1.26 g，菟絲子1.26 g，鹿角膠(河南老君堂制藥有限公司) 1.26 g，龜板膠(河南老君堂制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字241020792) 1.26 g，打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 mL 水。健脾組用藥補(bǔ)中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司)?；钛M用藥身痛逐瘀湯(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)。

1.3 主要試劑

PTHrP試劑盒(AMEKO 公司)內(nèi)含：96微孔板、一抗液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體液、底物稀釋液、洗滌液。

1.4 主要儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200)、低溫高速離心機(jī)(型號(hào)：MR1822)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 造模：用10%的水合氯醛將實(shí)驗(yàn)大鼠肌肉注射麻醉，麻醉后的大鼠采用俯臥位姿勢(shì)固定于手術(shù)臺(tái)上，從腰背部脊柱兩側(cè)做縱行切口切開(kāi)皮膚及肌肉，摘除兩側(cè)卵巢組織后逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。正常組不手術(shù)。

1.5.2 給藥：術(shù)后7 d開(kāi)始給藥，每日上午灌胃1次，連續(xù)灌胃12 w。上述補(bǔ)腎組、健脾組和活血組的大鼠每日用藥量按成人用藥量的6.3倍計(jì)算。正常組和模型組以等量0.9%的氯化鈉溶液灌胃。灌胃期間，每周一對(duì)大鼠稱重一次，按照體重調(diào)整給藥劑量。

1.5.3 取材：實(shí)驗(yàn)大鼠在第12 周灌胃后，禁食24 h 后取材。實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛肌肉注射麻醉后取材。無(wú)菌條件下，取大鼠右后肢股骨，剔除附著的肌肉筋膜，保留骨膜，生理鹽水沖洗后，用生理鹽水浸潤(rùn)后的醫(yī)用紗布包裹，再用預(yù)先準(zhǔn)備的錫紙包裹后置-70℃冰箱凍存，待骨密度測(cè)定。取大鼠右后肢腓腸肌的白肌部分和左右后肢的全股骨，并放入高壓滅菌的EP管內(nèi)，做好標(biāo)記，放入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

應(yīng)用XR-26型雙能X線骨密度儀(美國(guó)NORLAND公司)，及其所附帶的“The Small Subject Scout Scan”軟件，測(cè)定大鼠離體股骨上1/3的骨密度(g/cm2)。

采用ELISA 法檢測(cè)大鼠骨骼、骨骼肌PTHrP含量，用酶聯(lián)儀在450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸收度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)各組大鼠左后肢股骨骨密度結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠離體股骨上1/3骨密度極顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各治療組大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度的升高(P<0.01)，其中以補(bǔ)腎中藥組升高最為顯著。見(jiàn)表1。

2.2 檢測(cè)各組大鼠骨組織PTHrP含量結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠骨骼的PTHrP含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)腎組、健脾組、活血組骨骼的PTHrP含量明顯升高(P<0.01)，其中補(bǔ)腎組升高程度比較明顯。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠離體股骨上1/3骨密度值比較±s)Table 1 Comparison of bone mineral density at the 1/3 region of the isolated femur of rats in each group(±s)

注：與正常組比較：*P<0.01；與模型組比較：▲P<0.01。

表2 各組大鼠骨組織PTHrP含量±s)Table 2 Comparison of bone tissue PTHrP content of±s)

注：與正常組比較：*P<0.01；與模型組比較：▲P<0.01。

2.3 檢測(cè)各組大鼠骨骼肌PTHrP含量結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠骨骼肌的PTHrP含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)腎組、健脾組、活血組骨骼肌的PTHrP含量明顯升高(P<0.01)，其中健脾組升高程度比較明顯。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠骨骼肌PTHrP含量±s) Table 3 Comparison of skeletal muscle PTHrP content of±s)

注：與正常組比較：*P<0.01；與模型組比較：▲P<0.01。

3 討論

3.1 中醫(yī)學(xué)對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的認(rèn)識(shí)

根據(jù)骨質(zhì)疏松癥的腰脊疼痛、脛膝酸軟、易骨折、足跟疼痛等臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“骨痿”、“骨痹”的范疇。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，首載“骨痿”之病名，《素問(wèn)·痿論》中提到：“腎主身之骨髓……腎氣熱、則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！薄澳I者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿?！笨梢钥闯瞿I虛是骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制的關(guān)鍵，從腎論治骨質(zhì)疏松癥是中醫(yī)治療本病的基本原則。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾腎相關(guān)”，而骨骼與肌肉關(guān)系密切，腎藏精主骨，脾主四肢肌肉。若脾胃虧虛，水谷精微化生不足，肌肉得不到水谷精微的充養(yǎng)，而腎失所藏，后天之精又不得滋養(yǎng)，腎精不足，筋骨失養(yǎng)，則骨骼與肌肉協(xié)調(diào)性下降而骨痿不用?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中的《靈樞·經(jīng)脈》篇就提到：“足少陰氣絕，則骨枯。少陰者，冬脈也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，則肉不能著也；骨肉不相親，則肉軟卻；肉軟卻，故齒長(zhǎng)而垢，發(fā)無(wú)澤；發(fā)無(wú)澤者，骨先死?！笨梢钥闯黾∪怵糗洘o(wú)力，影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，可導(dǎo)致骨枯髓減而發(fā)病為“骨痿”。

清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中提到：“元?dú)饧忍?，必不能布于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”。說(shuō)明老年人腎精不足，血液運(yùn)行不暢，容易形成病理產(chǎn)物之瘀血，疼痛是瘀血致病的典型癥狀之一，骨質(zhì)疏松癥患者最常見(jiàn)的癥狀便是疼痛，因此血瘀也被認(rèn)為是本病發(fā)生的常見(jiàn)因素之一。

3.2 PTHrP含量的變化對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響

PTHrP可表達(dá)于皮膚、骨髓、腦、心血管、甲狀腺、甲狀旁腺和骨等多種組織，通過(guò)自分泌、旁分泌等方式發(fā)揮不同的生理作用。PTHrP的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，可以由激素原轉(zhuǎn)化酶家族加工為3個(gè)功能片斷，即氨基酸末端PTHrP(1-36)、中間片斷的PTHrP(38-94)、以及羧基端的PTHrP(107-139)[1]。目前PTHrP在骨細(xì)胞代謝、惡性腫瘤及心血管疾病中的作用研究相對(duì)較多。

PTHrP可保持軟骨細(xì)胞增殖和延遲軟骨細(xì)胞分化和程序性死亡，促進(jìn)髁突生長(zhǎng)發(fā)育。Ihh 通過(guò)促進(jìn) PTHrP的表達(dá)，同時(shí) PTHrP 也可通過(guò)自分泌或旁分泌細(xì)胞內(nèi)因子激活其受體保持細(xì)胞增殖，降低有增殖潛能的軟骨細(xì)胞向肥大的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因而抑制軟骨細(xì)胞的終末分化。當(dāng) PTHrP不足以刺激軟骨細(xì)胞增殖時(shí)，軟骨細(xì)胞開(kāi)始分泌Ihh，從而反饋性上調(diào) PTHrP 的表達(dá)水平，該反饋環(huán)路協(xié)調(diào)軟骨細(xì)胞的增殖和成熟[2-4]。有研究表明PTHrP(1-36)是PTHrP的保守分泌形式，可以促進(jìn)腎臟鈣的重吸收和延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生[5]。相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，PTH/PTHrP的短暫作用會(huì)使成骨細(xì)胞的Runx2 無(wú)論在蛋白水平還是mRNA 水平都升高，而Runx2是一個(gè)重要的促進(jìn)間葉細(xì)胞向成骨細(xì)胞家族轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子[6-8]。也有相關(guān)研究表明，PTH 在骨合成代謝中主要起凋亡抑制作用，每天給予成年小鼠一定劑量PTH，之后觀察到股骨的干骺端成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程下降。上述內(nèi)容可以看出，PTHrP對(duì)成骨細(xì)胞的分化和抑制成骨細(xì)胞的凋亡具有一定的作用[9-10]。

3.3 中醫(yī)不同治法對(duì)骨質(zhì)疏松癥治療效果的比較研究

通過(guò)對(duì)各組大鼠骨密度的檢測(cè)結(jié)果分析，與正常組比較，模型組大鼠離體股骨上1/3骨密度極顯著降低，說(shuō)明去卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型成功。本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)腎方法組用藥左歸丸，出自《景岳全書(shū)》，具有滋陰補(bǔ)腎，填精益髓的功效。健脾方法組用藥補(bǔ)中益氣顆粒，出自《脾胃論》，具有補(bǔ)中益氣，升陽(yáng)舉陷的功效?；钛椒ńM用藥身痛逐淤湯，出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有活血祛瘀，祛風(fēng)除濕，通痹止痛的功效。檢測(cè)各組大鼠骨組織、骨骼肌中PTHrP含量，與模型組相比，中醫(yī)不同方法治療組大鼠的骨組織、骨骼肌中PTHrP含量均有不同程度的升高，其中補(bǔ)腎組大鼠骨組織PTHrP含量升高趨勢(shì)最為明顯，其次為健脾組；健脾組大鼠骨骼肌PTHrP含量升高趨勢(shì)最為明顯，其次為補(bǔ)腎組。說(shuō)明補(bǔ)腎方法可以通過(guò)提高骨組織的PTHrP含量，減緩成骨細(xì)胞的凋亡過(guò)程，延緩骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)一步發(fā)展；健脾方法提高骨骼肌的PTHrP含量，可以提高肌肉的收縮和舒張能力，進(jìn)一步改善肌肉與骨骼的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，增加骨骼的物質(zhì)代謝，從而增加骨質(zhì)的彈性及韌性，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了中醫(yī)學(xué)中“腎藏精主骨”、“脾主運(yùn)化主四肢肌肉”、“脾腎相關(guān)”的理論，同時(shí)也可以看出補(bǔ)腎填精方法是中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的根本方法，健脾方法從一定方面也能有效防治骨質(zhì)疏松癥，是防治骨質(zhì)疏松癥的另一重要方法。