兩種FISH試劑盒檢測羊水染色體的比較

劉柯伶?賈蓓

[摘要] 目的 應(yīng)用兩種熒光原位雜交（FISH）試劑盒檢測羊水染色體，比較兩者在臨床的應(yīng)用效果。 方法 采用北京金菩嘉和美國雅培Vysis生產(chǎn)的FISH試劑盒對(duì)30例未培養(yǎng)的羊水進(jìn)行染色體檢測，比較兩者在信號(hào)強(qiáng)度和雜交率的差異。 結(jié)果 30例樣本均獲得FISH檢測結(jié)果，且兩種試劑臨床診斷符合率達(dá)到100%，雜交率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Vysis試劑21/13染色體熒光雜交信號(hào)較強(qiáng)，金菩嘉試劑18染色體信號(hào)清楚，不易融合。 結(jié)論 Vysis與金菩嘉兩種FISH檢測試劑應(yīng)用染色體異常產(chǎn)前診斷均可達(dá)到同樣的臨床診斷效果。

[關(guān)鍵詞] 熒光原位雜交；產(chǎn)前診斷；染色體非整倍體

[中圖分類號(hào)] R714.53 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）10-242-04

Comparative study on application of two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits for inspecting amniotic fluid chromosomes

LIU Keling1 JIA Bei2

1.Department of Obstetrics Baoan District People's Hospital，Shenzhen 518101，China；2.Department of Obstetrics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510512，China

[Abstract] Objective Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits were utilized to inspectamniotic fluid chromosomes，to compare the both kits in clinical application. Methods Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits from Beijing GPmedical and Abbott were utilized to inspect 30 samples of amniotic fluid chromosomes.Their differences in respect of signal intensityand hybridizing were compared. Results All samples of the 30 cases were successfully detected by the both FISH kits.The hybridizing ratethere was no significant difference （P>0.05）.Vysis kits 21/13 chromosome fluorescent hybridization signal was stronger than the GP kits.The GP kits 18 chromosomes signal was clear and not easy to fuse. Conclusion the FISH kits from the Beijing GPmedical and Abbott Vysis can make the same prenatal diagnosis for the chromosome abnormality.

[Key words] Fluorescence in situ hybridization；Prenatal dignosis；Chromosomal aneuploid

熒光原位原位雜交技術(shù)（FISH）基于分子細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展的學(xué)科，始于1998年，至今在臨床研究中廣泛應(yīng)用，在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域更是不斷完善和推廣[1-3]。由于商業(yè)試劑盒應(yīng)用方便、高效、穩(wěn)定且專業(yè)化，臨床上更青睞采用FISH商業(yè)試劑盒進(jìn)行產(chǎn)前診斷[4]，如美國雅培Vysis公司（美國），其試劑以極高的靈敏度及可重復(fù)性在臨床應(yīng)用中極受歡迎。目前我國金菩嘉公司（中國）自行研發(fā)成功FISH商業(yè)試劑盒可滿足產(chǎn)前診斷系列使用。本課題通過雅培Vysis公司和金菩嘉公司分別研制的FISH試劑盒進(jìn)行臨床應(yīng)用比較，以便國產(chǎn)FISH商業(yè)試劑盒的優(yōu)化，增強(qiáng)市場競爭力。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2009年3～10月在南方醫(yī)院行產(chǎn)前診斷的高危孕婦30例，年齡18～44歲，平均（30.4±5.3）歲。孕周17～37周，平均（23.1±4.4）周。產(chǎn)前診斷指征包括：（1）孕婦年齡≥35歲10例；（2）母血清唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)15例；（3）超聲篩查異常，指羊水過多、心室強(qiáng)光點(diǎn)、腹部雙泡征、雙側(cè)脈絡(luò)叢多回聲區(qū)等共3例；（4）多項(xiàng)指征，符合前面任意兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上者1例；（5）IVF-ET術(shù)后且極度焦慮孕婦1例。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。選擇這30例的液氮凍存的未培養(yǎng)的羊水標(biāo)本，結(jié)合其核型分析進(jìn)行兩種FISH診斷試劑（金菩嘉及雅培Vysis）的檢測。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑盒 采用美國 VysisFISH檢測試劑盒及北京金普嘉公司FISH試劑盒。

1.2.2 儀器 采用OLYMPUS公司（BX-51）的熒光顯微鏡、OLYMPUS公司的顯微照相機(jī)、Thermobrite原位雜交儀及VideoTest公司的FISH2.0分析軟件。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)染色體核型分析 30例產(chǎn)前診斷孕婦在超聲指導(dǎo)下無菌抽取羊水20mL，其中15mL行常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)其新生兒或引產(chǎn)的死胎進(jìn)行臍血或外周血的細(xì)胞培養(yǎng)以核實(shí)異常的染色體核型。將這些培養(yǎng)的細(xì)胞均進(jìn)行G顯帶，染色體核型分析，分析3個(gè)分裂相，嵌合體計(jì)數(shù)100個(gè)分裂相。染色體核型分析根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN1995）命名。

1.3.2 FISH檢測 （1）FISH標(biāo)本預(yù)處理，5mL羊水在1500rpm離心去上清，加5mL KCL低滲液，37℃水浴后固定3次后去上清至1mL滴片室溫過夜老化。將老化玻片加入37℃胃蛋白酶溶液消化放入2×SSC溶液漂洗2次，取出玻片依次置于70%、85%、100%乙醇梯度脫水后室溫自然干燥。按照商業(yè)試劑盒程序配備各自探針備用。

1.3.2.2 DNA變性、雜交及洗滌 （1）Vysis公司FISH試劑盒：參照試劑盒說明書進(jìn)行，在步驟上作根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行改進(jìn)：將探針滴于雜交區(qū)域，放入雜交儀73℃變性1min，37℃雜交16h。雜交后放入（73±1）℃的0.4×SSC/0.3% NP-40液洗滌2min轉(zhuǎn)至室溫2×SSC/0.1% NP-40液，再洗滌15～30s，放入70%乙醇3min取出暗處自然干燥。（2）金菩嘉公司FISH試劑盒甲酰胺變性程序：參照試劑盒說明書進(jìn)行，在步驟上作根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行改進(jìn)：將玻片放入（73±1）℃的70%的甲酰胺/2×SSC液變性5min，將玻片依次置于-20℃的70%、80%、100乙醇進(jìn)行梯度脫水。玻片自然干燥在45～50℃烤片機(jī)與變性好的探針雜交，42℃下雜交16h。雜交玻片依次放入46±1℃的50%甲酰胺/2×SSC，2×SSC，2×SSC/0.1NP-40洗滌各10min，轉(zhuǎn)至2×SSC液洗滌5～10min。再轉(zhuǎn)至2×SSC/0.1%NP-40液洗滌5min。70%乙醇固定取出暗處自然干燥。（3）復(fù)染與鏡檢：每個(gè)雜交區(qū)域加DAPI復(fù)染劑封片后室溫暗處放15～20min。每張片隨機(jī)分析計(jì)數(shù)50～100個(gè)間期核，并記錄雜交信號(hào)。（4）在熒光顯微鏡下觀察間期核FISH檢測信號(hào)，常規(guī)隨機(jī)對(duì)每組探針計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，排除相互重疊及彌散雜交信號(hào)、雜交不均勻區(qū)域。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)，對(duì)30例雜交率進(jìn)行定量配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 30例樣本間期核的兩種FISH試劑檢測與核型分析符合率

金菩嘉及雅培Vysis兩種FISH試劑檢測的產(chǎn)前診斷符合率為100%，見表1。

2.2 臨床隨訪確診情況

3例21-三體胎兒和1例18-三體胎兒引產(chǎn)后，臍血染色體核型證實(shí)均與羊水核型分析結(jié)果一致。26例羊水染色體正常者均追蹤檢查其新生兒，與新生兒外周血染色體核型分析一致。

2.3 30例樣本間期核FISH檢測雜交率比較

兩種FISH試劑雜交率的比較有顯著差異（21/13試劑盒P<0.01；8xy試劑盒，P<0.01）。Vysis公司生產(chǎn)的探針雜交率高于金菩嘉公司，見表2。

2.4 金菩嘉及Vysis兩種FISH試劑檢測信號(hào)圖

熒光顯微鏡觀察下Vysis18信號(hào)異常明亮且彌散，金菩嘉18信號(hào)同樣明亮但容易判讀（圖1）。

3 討論

FISH技術(shù)是一種非放射性原位雜交技術(shù)，原理是在已知單鏈核酸上標(biāo)記熒光后作為探針，按照堿基互補(bǔ)原則，與檢測標(biāo)本的目標(biāo)單鏈核酸特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察雜交后的熒光信號(hào)，判斷結(jié)合的染色體區(qū)域異常與否[5-6]。FISH的產(chǎn)前診斷應(yīng)用探針，可以針對(duì)性的檢測細(xì)小的單一序列（位點(diǎn)特異性序列LSI）、著絲粒特異性序列（CEP）和整條染色體。LSI探針可識(shí)別目標(biāo)DNA的特異序列，CEP根據(jù)識(shí)別染色體著絲粒及靠近著絲粒區(qū)域的重復(fù)DNA序列來檢測染色體數(shù)目。市場上銷售的商業(yè)探針與配置好的阻滯劑結(jié)合融于雜交液里，遵循應(yīng)用說明書上的規(guī)定的濃度和雜交參數(shù)才能得到最好的臨床應(yīng)用效果。自用及商用FISH試劑盒根據(jù)在臨床應(yīng)用的反饋和各個(gè)領(lǐng)域的探索推廣，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室均會(huì)對(duì)探針的類型、制備工藝和使用方案進(jìn)行不斷優(yōu)化和完善[7]。本研究中的兩種探針在檢測羊水染色體的操作程序上，最大的區(qū)別是雜交儀的使用情況。Vysis探針配備自己研發(fā)的FISH專用雜交儀和其自動(dòng)預(yù)處理系統(tǒng)，極大的節(jié)約人工和試劑成本，減少有害溶液的用量，嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和環(huán)境濕度，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)效率和改善實(shí)驗(yàn)環(huán)境。相比之下，金菩嘉探針要想取得最佳的檢測效果，仍需人工甲酰胺變性、雜交及雜交后的洗滌這一系列傳統(tǒng)步驟，這將是國產(chǎn)探針急需改進(jìn)的技術(shù)環(huán)節(jié)。

本研究表明兩種試劑盒的與核型分析的診斷符合率為100%（見表1），與文獻(xiàn)報(bào)道的相似[8-9]，具有靈敏度高及特異性強(qiáng)[10]，達(dá)到產(chǎn)前診斷應(yīng)用要求。但兩種FISH試劑雜交率存在差異（見表2）。Vysis公司探針雜交率優(yōu)于金菩嘉，特別是21/13探針。Vysis 18信號(hào)明亮但彌散（圖1），閱片計(jì)數(shù)時(shí)一部分難以判別信號(hào)個(gè)數(shù)（一個(gè)或者兩個(gè)），對(duì)異常標(biāo)本信號(hào)觀察可發(fā)生假陽性可能；而金菩嘉18探針信號(hào)觀察清晰、容易判別（圖1）。18xy探針的設(shè)計(jì)堿基配對(duì)部位定在DNA的著絲粒部位[11-12]，產(chǎn)生的信號(hào)較為集中而明亮，方便識(shí)別和計(jì)數(shù)。而18探針信號(hào)出現(xiàn)彌散的原因，是因?yàn)楫?dāng)一些羊水細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞周期S期時(shí)會(huì)出現(xiàn)類似G2期的配對(duì)信號(hào)，即一條染色體分裂成兩條染色體單體時(shí)，臨近細(xì)小信號(hào)就會(huì)出現(xiàn)連續(xù)信號(hào)，這時(shí)閱片時(shí)計(jì)數(shù)為一個(gè)信號(hào)[13]。因探針熒光著色是根據(jù)DNA單鏈的螺旋排序呈縱向，所以有時(shí)著絲粒探針或較長的基因組探針產(chǎn)生的信號(hào)可呈連續(xù)性，這時(shí)也以一個(gè)信號(hào)計(jì)數(shù)。因此探針選取的適宜目標(biāo)DNA堿基對(duì)和細(xì)胞核所處于的細(xì)胞周期是獲取分離且明亮的FISH信號(hào)的重要因素[7]。

閱片中發(fā)現(xiàn)21、13號(hào)染色體探針信號(hào)遠(yuǎn)不如18號(hào)染色體探針信號(hào)明亮，這是由于21/13探針是針對(duì)特異性重復(fù)序列設(shè)計(jì)（串聯(lián)重復(fù)alpha-衛(wèi)星序列探針）的，存在個(gè)體的差異性，促成FISH探針顯示的信號(hào)不穩(wěn)定，甚至遇到雜交序列太短形成的信號(hào)較弱，即使在熒光顯微鏡下卻無法觀察，就會(huì)出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致21號(hào)染色體非整倍的漏診[14-16]。

21/13及18XY探針與熒光素標(biāo)記的技術(shù)含量不同，導(dǎo)致檢測信號(hào)強(qiáng)度及分辨率不同，這也是商業(yè)試劑盒的競爭核心所在。本研究提示國產(chǎn)探針臨床應(yīng)用與世界一流的商業(yè)探針雖存在一定差距，但仍不乏亮點(diǎn)，我們需要總結(jié)經(jīng)驗(yàn)完善探針質(zhì)量，在不斷改進(jìn)中提升自身競爭力。

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（收稿日期：2017-02-29）