低氧增強骨髓間充質(zhì)干細胞增殖維持分化潛能

康少平，劉淑艷，李永升，李 萍*

(1.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.張家口市第二醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000)

低氧增強骨髓間充質(zhì)干細胞增殖維持分化潛能

康少平1，劉淑艷1，李永升2，李 萍1*

(1.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.張家口市第二醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000)

目的 觀察低氧增強人骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)體外增殖并維持其多向分化潛能的作用。方法 分離10例骨髓血標(biāo)本BMMSCs，分別進行低氧(低氧組)及常氧(常氧組)培養(yǎng)，觀察BMMSCs的形態(tài)、增殖能力及成骨、成脂分化能力。結(jié)果 低氧組BMMSCs保持其長梭形，魚群樣分布，增長狀態(tài)良好，常氧組BMMSCs形態(tài)呈多角形或扁平狀，低氧組BMMSCs數(shù)量及生長速率較常氧組增加(P< 0.05)，且低氧組BMMSCs具有成骨、成脂分化能力。結(jié)論 低氧能促進BMMSCs的體外增殖且維持其多向分化潛能。

低氧；骨髓間充質(zhì)干細胞；增殖；多向分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)是一種具有自我更新及向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及神經(jīng)細胞等多種類型的組織細胞分化能力的非造血干細胞[1]。近年來，BMMSCs已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括骨病的病理生理學(xué)研究、細胞和基因治療及骨再生組織工程等[2，3]。由于BMMSCs在骨髓單個核細胞中的比例非常小，僅占0.1%左右；盡管其在體外表現(xiàn)出一種獨特的增殖能力, 但仍然難以滿足組織工程和細胞治療的需要[4]。因此，探索理想的BMMSCs體外擴增條件具有重要的理論與臨床應(yīng)用價值。本研究通過對BMMSCs進行體外低氧培養(yǎng)，觀察其增殖及多向分化能力，從而建立理想的BMMSCs體外擴增方法，為BMMSCs的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

骨髓血標(biāo)本取自張家口市第二醫(yī)院骨科收治的10例新鮮股骨頸骨折患者，患者在行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中抽取骨髓血，分離獲得BMMSCs?；颊呔鶡o血液系統(tǒng)疾病和家族遺傳病史。該項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征得患者知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

倒置相差顯微鏡，德國Leica公司；三氣細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素(雙抗)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA，均購自美國Gibco公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒，上海貝博生物有限公司；人外周血淋巴細胞分離液(Percoll)，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；成骨誘導(dǎo)分化試劑盒、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、茜素紅染液、油紅O染液，均購自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1BMMSCs的分離與培養(yǎng)

手術(shù)過程中取5mL骨髓血標(biāo)本置于肝素抗凝管，輕輕混勻，與等量DMEM/F-12混合，1000r/min離心10min；棄上清及脂肪層，并用DMEM/F-12重懸細胞，以等體積比緩慢沿管壁疊加在Percoll液面上，2000r/min離心25min；吸取乳白色環(huán)狀細胞層即單個核細胞層，PBS洗滌2次，1000r/min離心10min；用細胞培養(yǎng)基(DMEM/F-12，10%FBS，1% 雙抗)重懸細胞，混勻后以1×106/mL接種至六孔板中，鏡下觀察細胞分布均勻；分別置于低氧(5%O2，低氧組)及常氧(21%O2，常氧組)下進行培養(yǎng)。細胞低氧培養(yǎng)是在三氣細胞培養(yǎng)箱中進行，即在充滿5%O2、5%CO2和90%N2的混合氣體，最終O2濃度為5%。48h更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細胞；以后每隔3d換液一次，細胞在培養(yǎng)箱外換液的時間不超過5min，以免低氧、復(fù)氧效應(yīng)發(fā)生。

1.3.2BMMSCs形態(tài)觀察

在進行高校學(xué)生黨建工作的過程中，重視理論教育非常重要，組織實踐活動也必不可少。但是，在目前高校學(xué)生黨建工作中，普遍存在著重視理論教育，忽視實踐活動的現(xiàn)象，同時高校對學(xué)生的考核過程中，僅僅進行基礎(chǔ)理論知識的考核，但是卻沒有對學(xué)生的實踐活動進行考核，從而導(dǎo)致學(xué)生只重視理論課程的學(xué)習(xí)，忽視實踐活動的重要性。

倒置相差顯微鏡下觀察低氧組及常氧組細胞生長狀況及形態(tài)特征。

1.3.3BMMSCs增殖測定

應(yīng)用CCK-8(CellCountingKit-8)法對BMMSCs進行增殖分析。收集第3代低氧或常氧組細胞分別以6.25×103、1.25×104、2.5×104、5×104、1×105/mL密度接種于96孔板，繪制一條以細胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將第3代低氧及常氧組細胞以3,000個/孔(100μL細胞懸液)接種于96孔板，分別置于低氧及常氧環(huán)境中培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d，培養(yǎng)終末時間每孔加入10μLCCK-8溶液孵育3h，使用酶標(biāo)儀測定450nm各孔的OD值。

1.3.4BMMSCs成骨誘導(dǎo)與鈣結(jié)節(jié)染色

將第3代低氧、常氧組細胞按3×104/cm2接種于6孔板中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F-12、10%FBS、1%雙抗)進行培養(yǎng)，24h后使用成骨細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(DMEM/F-12、10%FBS、1%雙抗、0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸、60μmol/L抗壞血酸)，分別置于低氧、常氧下進行成骨誘導(dǎo)，每隔2d換液1次，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14d使用茜素紅染液做鈣結(jié)節(jié)染色。PBS洗滌細胞2次，4% 冷甲醛固定15min，雙蒸水洗滌3次，茜素紅染液染色10min，雙蒸水洗滌2次。在低倍鏡下觀察每個視野中陽性鈣結(jié)節(jié)的個數(shù)，每孔隨機選取5個視野, 取其均數(shù)做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.5BMMSCs成脂誘導(dǎo)與脂滴染色

將第3代低氧、常氧組細胞按2×104/cm2接種于六孔板中,基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔2d換液一次，待細胞達到100% 融合后，使用成脂細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(DMEM/F-12、10%FBS、1%雙抗、1μmol/L地塞米松、10μg/mL胰島素、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，分別置于低氧、常氧下進行成脂誘導(dǎo)分化。每隔2d換液1次，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)第14d，使用油紅O染液進行脂滴染色。PBS洗滌細胞2次，4%中性甲醛固定60min，雙蒸水洗滌3次，待干，加入預(yù)配并過濾后的油紅O染液，染色15min，吸去多余染液，PBS洗滌2次。倒置相差顯微鏡下觀察形成的脂滴。

2 結(jié)果

2.1BMMSCs形態(tài)觀察

新分離的細胞在低氧條件下培養(yǎng)粘附性差，第3 ～ 5天，大部分細胞不貼壁，懸浮在細胞培養(yǎng)液中(圖1A)；但在常氧條件下培養(yǎng)24h內(nèi)即有貼壁細胞生長，3 ～ 5d后細胞呈圓形、細長梭型(圖1B)。因此，常氧培養(yǎng)所有新分離的細胞直到細胞生長達到第一次融合，將融合的BMMSCs消化傳代，傳代的細胞隨機分成兩組：低氧組與常氧組。當(dāng)細胞進行傳代培養(yǎng)至第3代，低氧組細胞形態(tài)均一，胞體小，核質(zhì)比大，細胞大多呈細長梭形，魚群樣分布，增長狀態(tài)良好(圖1C)。而常氧組細胞形態(tài)大小不一，細胞體積較大，胞漿量增多，形態(tài)呈多角形或扁平狀(圖1D)。

注：(A)低氧條件下體外新分離的細胞，(B)常氧條件下體外新分離的細胞； (C)低氧組第3代BMMSCs,(D)常氧組第3代BMMSCs。(200 ×)圖1 低氧組與常氧組BMMSCs形態(tài)觀察Note. BMMSCs Newly isolated in vitro under hypoxic (A) and normoxic (B) conditions; the 3rd passage of BMMSCs cultured in vitro under hypoxia (C) and normoxia (D).Fig.1 Morphological observation of BMMSCs in the hypoxia and normoxia groups

2.2 低氧對BMMSCs體外增殖的影響

采用CCK-8法對第3代常氧及低氧組BMMSCs進行增殖比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)第1 ～ 2天兩組BMMSCs數(shù)量差異無顯著性；但從第3 ～ 7天，低氧組BMMSCs數(shù)量及生長速率較常氧組明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)(圖2)。因此推斷低氧具有促進BMMSCs增殖的作用。

注：(A)一條以細胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(B)低氧及常氧組BMMSCs細胞生長曲線(橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間， 縱坐標(biāo)為細胞數(shù)量)；(C)低氧組BMMSCs在培養(yǎng)第3 ～ 7 d，生長速率較常氧組增加，差異有顯著性(*P< 0.05)。圖2 低氧組與常氧組BMMSCs體外增殖能力Note. A. Standard curve of cell number (horizontal axis) related to OD value (vertical axis). B. Cell growth curve of BMMSCs in the normoxia and hypoxia groups. The horizontal axis indicates culture time, and the vertical axis indicates cell number. C. Cell growth rate of BMMSCs in the hypoxia group was increased faster than the normoxia group after culture for 3～7 d, with a significant difference (*P< 0.05).Fig.2 Proliferation abilities of BMMSCs in the hypoxia and normoxia groups cultured in vitro

2.3 BMMSCs成骨、成脂分化能力測定

低氧組與常氧組BMMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后進行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察均可見紅色鈣結(jié)節(jié)(圖3A，B)。低倍鏡下觀察，低氧組每個視野可見(18.1 ± 3.3)個鈣結(jié)節(jié)，常氧組每個視野可見鈣結(jié)節(jié)數(shù)目為(16.5 ± 2.6)個, 兩組每個視野鈣結(jié)節(jié)數(shù)無明顯差異(P> 0.05)；兩組BMMSCs成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后進行油紅O染色，均可見紅色脂滴出現(xiàn)(圖3C，D)。結(jié)果表明低氧環(huán)境對BMMSCs具有成骨、成脂誘導(dǎo)分化的作用。

注：(A，B)低氧組與常氧組BMMSCs體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 d茜素紅染色；(C，D)低氧組與常氧組BMMSCs體外 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d油紅O染色。(200 ×)圖3 低氧組與常氧組BMMSCs體外成骨、成脂 細胞誘導(dǎo)Note. (A, B) Induction of osteoblast differentiation of BMMSCs after culture in vitro under hypoxia (A) and normoxia (B) for 14 d, Alizarin red staining. (C, D) Induction of adipocyte differentiation of BMMSCs after culture in vitro under hypoxia (C) and normoxia (D) for 14 d. Oil-red O staining.Fig.3 Induction of osteoblast and adipocyte differentiation of BMMSCs after culture under hypoxia and normoxia

3 討論

BMMSCs由于具有向多種類型的組織細胞分化的能力，因此被廣泛應(yīng)用于細胞和基因治療及骨再生組織工程等領(lǐng)域，而如何獲得大量純化并維持其干細胞特性(自我更新和分化潛能)的BMMSCs則成為臨床干細胞應(yīng)用成功的前提條件。目前國內(nèi)外學(xué)者致力于開發(fā)一種有效的BMMSCs擴增方法，包括通過改變體外細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、生長因子和緩沖液的pH值等[5，6]，但很少注意到氧氣濃度對細胞增殖的影響。BMMSCs在體外原代培養(yǎng)中的氧濃度(21%)往往不符合體內(nèi)生理狀態(tài)，正常人骨髓是一典型的低氧環(huán)境，氧濃度為1% ～ 7%[7]，即正常狀態(tài)下BMMSCs生存在相對缺氧的微環(huán)境中。本文通過比較低氧與常氧兩種不同體外培養(yǎng)條件對BMMSCs增殖的影響，從而建立理想的BMMSCs體外擴增方法。

本研究中，新分離的BMMSCs在低氧條件下貼壁黏附性差，但在常氧條件下細胞黏附性好，24 h內(nèi)即有貼壁細胞生長，推斷原代細胞的粘附性可能受到低氧張力的抑制，這種“不貼壁性”可能與其在低氧條件下保持相對“未分化狀態(tài)”從而維持自我更新的能力相關(guān)。D’Ippolito G等[8]證明，低氧環(huán)境下細胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、SSEA-4(胚胎階段特異性抗原-4)mRNA的表達比常氧下高，端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性增加，推斷低氧是保持干細胞“未分化狀態(tài)”的重要因素。常氧培養(yǎng)所有新分離的細胞直到細胞生長達到第1次融合，將細胞傳代分組，我們發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)至第3代，低氧組細胞保持均一形態(tài)，大多呈細長梭形，魚群樣分布，增長狀態(tài)良好，而常氧組細胞顯示多角形或扁平狀形態(tài)。Colter等[9]證實 BMMSCs至少有兩種不同形態(tài)細胞，分別為 RS 細胞(spindle-shaped cells)及扁平狀細胞，這兩種細胞亞群在細胞傳代的過程中數(shù)量不同，隨著傳代次數(shù)增加，細胞可出現(xiàn)明顯的衰老標(biāo)志，形態(tài)由梭形變?yōu)樯煺贡馄綘睢Ｒ虼?，本結(jié)果提示低氧培養(yǎng)可起到防止細胞衰老的作用，可以用于長期的體外擴增并維持其干細胞潛能。與我們的研究相似，Tsai等也證實1%氧濃度培養(yǎng)BMMSCs可以減緩衰老[10]。之后，我們采用CCK-8法對第3代BMMSCs在常氧及低氧環(huán)境下進行增殖比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧組BMMSCs在培養(yǎng)第3 ～ 7天細胞數(shù)量及生長速率較常氧組增加，提示低氧具有促進BMMSCs增殖的作用。同時對兩組BMMSCs進行成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，均可見紅色鈣結(jié)節(jié)及紅色脂滴形成，推斷低氧并未改變BMMSCs向成骨、成脂細胞誘導(dǎo)分化的能力。

關(guān)于低氧如何調(diào)節(jié)BMMSCs的增殖及分化，其機制尚不清楚，大多數(shù)研究認為與低氧誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的低氧誘導(dǎo)因子通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，Sox2和Nanog的表達有關(guān)[11]。然而，由于間充質(zhì)干細胞的來源不同、細胞接種密度不同、低氧濃度的不同及低氧培養(yǎng)時間不同，低氧對間充質(zhì)干細胞的增殖效率的報道結(jié)果也不盡相同。一些研究發(fā)現(xiàn)低氧有明顯的抑制細胞增殖作用[12，13]，也有發(fā)現(xiàn)低氧增加增殖能力或延長壽命[14，15]。本研究選擇5%氧濃度、持續(xù)長時間的培養(yǎng)及合適的細胞接種密度證實低氧對BMMSCs增殖起促進作用。

總之，我們的研究結(jié)果證實低氧在促進BMMSCs的增殖及維持其多向分化潛能中起著至關(guān)重要的作用。另一方面，低氧反映干細胞增殖與分化的真實微環(huán)境，通過體外模擬BMMSCs體內(nèi)的低氧環(huán)境，可以更好地了解細胞生物學(xué)特性及其再生潛能，這將為BMMSCs的大量獲取及其作為種子細胞應(yīng)用于細胞、基因治療及組織工程提供參考依據(jù)。

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Hypoxia promotes proliferation of bone marrow mesenchymal stemcells and maintains their potential of differentiation

KANG Shao-ping1， LIU Shu-yan1， LI Yong-sheng2， LI Ping1*

(1.College of Laboratory Medicine, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China； 2.Department ofOrthopedics, The Second Hospital of Zhangjiakou, Zhangjiakou 075000)

Objective To observe the promoting effect of hypoxia on proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and maintaining their potential of multi-directional differentiationinvitro.MethodsBMMSCswereisolatedfrombonemarrowbloodsamplesofpatientswithbonefracture,andculturedunderhypoxic(groupA)ornormoxic(groupB)conditions.Themorphology,proliferationandosteogenicandadipogenicpotentialoftheBMMSCswereobserved.ResultsBMMSCsinthegroupAshowedalongspindleshapeandafishshoal-likedistribution,andwerewell-grown,whilethemorphologyofcellsinthegroupBappearedpolygonalorflat.ThequantityandgrowthrateofBMMSCsinthegroupAwereincreasedcomparedwiththegroupB(P< 0.05),withanosteogenicandadipogenicpotential.ConclusionsHypoxiacanpromotetheproliferationofBMMSCsin vitroandmaintaintheirmulti-directionaldifferentiationpotential.

Hypoxia;Humanbonemarrowmesenchymalstemcells;Proliferation;Multidirectionaldifferentiation

張家口市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(1321052D)。

康少平(1981-)，女，講師，研究方向：干細胞。Email: kang_shao_ping@163.com

李萍(1969-)，女，教授，研究方向：干細胞。 Email: zjkliping@163.com

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0070-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.013

2016-12-14