改良的兩步復(fù)合酶消化法制備大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞

周玥華，劉 星，張艷軍，汪 辛，陳渝萍*

(1.西南交通大學(xué)材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，成都 610031； 2.西南交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

改良的兩步復(fù)合酶消化法制備大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞

周玥華1,2，劉 星1,2，張艷軍1,2，汪 辛1,2，陳渝萍1,2*

(1.西南交通大學(xué)材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，成都 610031； 2.西南交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

目的 本文報道一種基于復(fù)合酶消化法進行改良的大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞的分離方法。方法 采用膠原酶、胰肽酶復(fù)合酶對胸主動脈進行初步消化去除內(nèi)外膜、再對中膜進行二次消化釋放血管平滑肌細胞。結(jié)果 細胞分離后貼壁生長，多具梭形形態(tài)，呈現(xiàn)典型的“峰-谷”生長狀態(tài)，1周可進行傳代；多種收縮型血管平滑肌細胞的分子標記基因均在所分離培養(yǎng)的細胞中高表達；超過95%的細胞為alpha smooth muscle actin(α-SMA)和myosin-II顯著陽性。結(jié)論 本分離方法簡捷易行、重復(fù)性好，所得細胞活性佳、純度高，可確保短時間內(nèi)獲得大量收縮型血管平滑肌細胞。

血管平滑肌細胞；復(fù)合酶；兩步消化法

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)參與了高血壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄等疾病的發(fā)生發(fā)展[1-4]，關(guān)于VSMC的研究是心血管疾病細胞分子病理學(xué)的重要內(nèi)容，而其開展的前提是獲得結(jié)構(gòu)功能良好的VSMC。

目前VSMC 體外分離培養(yǎng)方法大致分為組織塊貼壁法、酶消化法兩大類。前者使用器械剝離內(nèi)外膜、并將血管剪成小塊進行貼壁培養(yǎng)，最后VSMC從組織塊爬出[5-9]。該方法費用低廉，是目前國內(nèi)較為通用的VSMC分離方法。但是其缺點顯而易見：1)組織塊極易漂浮而造成分離失敗[2,10]。2)內(nèi)外膜容易有殘留、中膜層容易被易刮傷。因此，使用該方法分離出的VSMC活力欠佳，需要2 ～ 4周(甚至7周)才可傳代；且細胞純度低，傳代培養(yǎng)5代左右才能達到98%純度[2,11,12]。更有研究顯示，使用該方法所分離的VSMC的收縮表型特征明顯減弱[13]，不能滿足多種收縮型VSMC的研究工作[3,14]。

自1978年Ives等[15]人采用蛋白酶直接消化血管組織來制備VSMC以來，先后有人嘗試了膠原酶、胰酶和胰肽酶等蛋白酶[16-21]。傳統(tǒng)的酶消化法用酶單一，消化時間可從幾個小時長至幾天。組織的消化不均勻，細胞產(chǎn)量少。除此之外，胰酶對VSMC有損傷。后期進一步發(fā)展出多種蛋白酶聯(lián)合消化的方法來改善細胞產(chǎn)量和活性以提高分離的成功率和穩(wěn)定性[22-24]。但是，迄今報道的各種復(fù)合酶消化方法中，所使用的酶的種類及數(shù)量較多，操作步驟繁瑣冗長，污染率較高。而且，因酶制品的差異，消化時間不能得到統(tǒng)一。這些問題的存在使得該方法難以為初學(xué)者掌握、分離效果不一，尚未為國內(nèi)研究者大量采用[16]。因此，尚待建立一種成功率高、且更簡便易行的VSMC分離制備方法，以滿足現(xiàn)今VSMC研究工作進行的需要。

為此，我們考察了國內(nèi)外各種VSMC分離方法[16,17,25,26]，對實驗細節(jié)反復(fù)摸索和優(yōu)化，建立了一種改良的復(fù)合酶消化法，并成功地應(yīng)用該方法進行了大鼠VSMC的分離制備。和報道的其它VSMC分離制備方法相比，該方法操作簡捷易行，操作時間短。分離的重復(fù)性極好、成功率很高，可確保所獲得的VSMC的數(shù)量、活性、純度及其收縮型表型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

含鈣鎂HBSS、不含鈣鎂的PBS、DMEM-F12高糖培養(yǎng)基均來自Hyclone；0.25%的胰酶細胞消化液、雙抗和胎牛血清來自Gibco；二型膠原酶(collagenaseⅡ)、胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)和胰肽酶E(elastase)來自Worthington Biochem；DMSO和細胞計數(shù)試劑盒CCK8分別購自Sigma和北京莊盟；RNA分析試劑包括Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNase I(Thermofisher，美國)和定量PCR試劑(Bio-Rad，美國)；基因引物于上海生工合成，各基因的特異序列見表1；免疫分析試劑包括DAPI和RIPA(Sigma，美國)、正常兔IgG(Santa Cruz，美國)、α-SMA、myosin-II和β-tubulin的兔抗(Abcam，美國)及Alexa Fluor 594羊抗兔二抗購自(Invitrogen，美國)。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.1.2 實驗儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備集團)；氣浴恒溫振蕩器(金壇市鴻科儀器廠)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國)；倒置顯微鏡(Leica DMIL，美國)；熒光顯微照相設(shè)備(Leica，美國)；Image Lab(Bio-Rad，美國)；Real-time quantitative PCR detecting system(CFX96，Bio-Rad，美國)；Power Pac Universal(Bio-Rad，新加坡)。

1.1.3 實驗動物

健康的SPF級別SD雄性大鼠，體重90～100 g，購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所【SCXK(川)2013-15】。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合酶液的配制

實驗開始前以HBSS新鮮配制復(fù)合酶消化液(二型膠原酶，1 mg/mL；胰蛋白酶抑制劑，1 mg/mL；胰肽酶，7.08 μL/mL)。配制好的酶液置于37℃、搖速60 r/min的氣浴恒溫振蕩器里預(yù)熱(備注：一條大鼠的胸主動脈約用2 mL的復(fù)合酶液)。

1.2.2 原代VSMC的分離

取乙醚麻醉大鼠，轉(zhuǎn)至無菌動物手術(shù)臺，用75%的酒精噴濕大鼠的胸腹部，剖開胸腹腔充分暴露胸主動脈血管。小心剔除粘附在血管上的組織和粘膜，迅速剪取胸主動脈置于高壓滅菌、預(yù)冷的生理鹽水中并轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)室的超凈工作臺；反復(fù)沖洗血管表面的血污，用2 mL的注射器吸取生理鹽水進一步?jīng)_洗管腔內(nèi)的凝血塊等(3次左右)。在保證不傷害血管的前提下，小心剔凈其表面黏附的纖維組織，立即放入含1 mL復(fù)合酶液的4 mL離心管中，在37℃的氣浴恒溫振蕩器里消化45 min，搖速60 r/min。隨后將血管置于預(yù)冷的、帶雙抗的DMEM中，用彎頭和直頭眼科小鑷子輕柔剝離血管外膜；漂洗后再用彎頭的小剪刀縱向剪開血管，以彎頭小鑷輕輕刮除內(nèi)膜，最后以HBSS漂洗剝離的中膜層。

將中膜層置于干凈的培養(yǎng)皿，以彎頭眼科剪快速剪成1 ～ 2 mm3小塊，轉(zhuǎn)入放有1 mL復(fù)合酶液的6孔板，轉(zhuǎn)移到孵箱中，37℃，5% CO2，消化1 h；每消化20 min后取出孔板輕輕晃動；消化50 min后開始觀察細胞從組織碎塊游離的情形。待多數(shù)組織塊中的細胞開始脫落時加入預(yù)熱過的含20% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化。隨后用10 mL注射器抽打組織消化液以幫助細胞進一步從組織殘片中脫離(大致10 ～ 20次)，再用40 μm的細胞篩過濾懸液到6孔板的另一個孔內(nèi)，獲得VSMC細胞懸液。取濾網(wǎng)上的組織、重復(fù)抽打和過濾1次，將2次過濾后的細胞懸液一起轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管里，1 000 r/min離心5 min收集細胞。最后取含20%FBS和抗生素的DMEM-F12重新懸浮細胞，種入6孔板進行培養(yǎng)(P0代)，靜置48 h后開始觀察。

1.2.3 原代VSMC的傳代培養(yǎng)和凍存

一周后P0代細胞基本長滿孔板(90%)，以0.25%胰蛋白酶液消化VSMC，重懸于含20%FBS 的DMEM，并于直徑10 cm培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)(P1代)。細胞再次長滿后進行同樣的消化傳代(P2代)，從P2代開始進行VSMC凍存。P5代以后的VSMC以含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)進行培養(yǎng)。

1.2.4 VSMC的細胞形態(tài)學(xué)觀察

VSMC分離培養(yǎng)2 d后開始以倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)狀態(tài)下細胞的形態(tài)和生長情形。

1.2.5 VSMC的生長活力測定

將P2代細胞以每孔約1000個細胞/100 μL培養(yǎng)基接種于96孔板，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以CCK-8試劑盒定期分析孔內(nèi)細胞數(shù)量，檢測細胞生長情形。每次測定6孔，連續(xù)測3 d。

1.2.6 VSMC的ICC(細胞免疫熒光)

分析將P2代細胞接種于內(nèi)置細胞爬片的24孔板中培養(yǎng)1 d。取出爬片，以4% PFA于室溫固定20 min，后以甲醇于-20℃透膜10 min，然后用封閉液(1%BSA，4%羊血清，0.1% Tween20，0.1 mol/L甘氨酸)在室溫下封閉45 min。分別與α-SMA一抗 (1∶500)、Myosin-II一抗(1∶100)和相應(yīng)等量的正常兔IgG在4℃孵育過夜，然后再和Alexa Fluor 594偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶1000)于室溫避光孵育1 h。每一步孵育前樣品均以PBS 漂洗三遍。最后以DAPI染核，并于熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 VSMC的收縮型表型基因的表達分析

取Trizol試劑分別裂解P2代VSMC和大鼠肝星狀細胞株T6細胞，提取總RNA；RNA定量后以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA、隨后進行定量PCR反應(yīng)以分析細胞中各表型基因的RNA表達水平；并以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段。以RIPA液裂解P2、P3、P4代細胞、T6細胞和Hela細胞，分別制備細胞總蛋白；定量蛋白濃度后進行Western Blot分析，定量檢測α-SMA、myosin-II和β-tubulin蛋白在細胞中的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 VSMC的分離制備

為獲得高產(chǎn)量、高活性的VSMC，我們采用復(fù)合酶二步消化的方法進行VSMC的分離制備。胸主動脈在以復(fù)合酶液初步消化45 min后，外、內(nèi)膜可被輕松剝離和刮除，順利獲得完整的中膜。對剪碎的中膜組織塊進一步進行二次消化，可解除內(nèi)外彈性膜對VSMC的束縛。圖1A了顯示中膜組織碎塊在兩步酶消化結(jié)束時在顯微鏡下觀察的情形?？梢娊M織碎塊中多個細胞正在逃逸膠原等蛋白纖維的束縛，呈葡萄串狀貼附于組織塊。將分離后的P0代細胞接種于6孔板，起初細胞呈球狀(圖1B)；12 h后貼壁的細胞開始拉長，并呈明暗交替分布；培養(yǎng)2 d后細胞逐漸鋪展開，初顯VSMC形態(tài)，呈梭形、長條形和三角形生長(圖1C)。接種7 ～ 8 d后P0代細胞接近長滿，密集生長處細胞重疊生長，可觀察到明顯的峰-谷生長態(tài)勢(圖1D)。隨后以胰酶消化細胞、傳代于10 cm培養(yǎng)皿中，約1周后P1代細胞再次長滿，數(shù)量可達約100萬。

注：(A)酶消化結(jié)束時被蛋白纖維纏繞的VSMCs；(B)分離接種于6孔板的P0代VSMCs； (C)培養(yǎng)兩天的VSMCs；(D)體外培養(yǎng)1周后的VSMCs。圖1 VSMC的分離和培養(yǎng)Note.(A) VSMCs tangled with protein fibers at the end of digestion; (B) Isolated P0 VSMCs in 6-well plate; (C) VSMCs after cultured for two days; (D) VSMCs were cultured for a week in vitro.Fig.1 Isolation and culture of VSMCs

2.2 VSMC的生長活力

為了檢測所分離的VSMC的生長能力，我們?nèi)2代VSMC接種于96孔板，持續(xù)培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)期間定時取細胞以CCK8試劑盒處理、檢測孔內(nèi)生長的活細胞數(shù)。如圖2所示，在培養(yǎng)的96 h內(nèi)，細胞數(shù)量逐漸增多。細胞在經(jīng)過接種初期的適應(yīng)后，其增長開始顯著加快，生長旺盛，顯示出極佳的增殖活力。表明我們所分離的細胞具有良好的活力。

圖2 第二代VSMCs的增殖分析Fig.2 Proliferation analysis of the P2VSMCs

2.3 VSMC的ICC分析(細胞免疫熒光)

取培養(yǎng)的P2代VSMC細胞作免疫熒光分析，進一步對所分離的VSMC細胞進行鑒定。我們首先檢測了α-SMA這一最常用的SMC分子標記蛋白。其次，考慮到近期研究發(fā)現(xiàn)一系列傳統(tǒng)的SMC分子標記(包括α-SMA，SM22，h1-calponin和smoothelin等)在其它類型細胞中也有較高表達，我們還選擇了檢測myosin-II這一目前公認的更特異的SMC分子標記[3]。如圖3顯示，α-SMA和myosin-II蛋白抗體均在所分離的P2代VSMC細胞中產(chǎn)生了清晰的紅色熒光信號，表明細胞表達收縮型VSMC的特征性蛋白。熒光顯微鏡下可見α-SMA肌動蛋白絲狀纖維與細胞長軸平行、向兩頭成放射分散，胞質(zhì)均勻、細胞核輪廓清晰可見；尤其是myosin-II 免疫熒光信號在細胞中也非常顯著，意味著該蛋白在細胞內(nèi)水平很高(圖3)。對兩個平行培養(yǎng)孔內(nèi)各4處視野里的細胞進行計數(shù)和統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)ICC檢測α-SMA和myosin-II蛋白陽性細胞的比率可達95%，表明在傳至P2代時所分離的細胞中收縮型VSMC的純度已經(jīng)達到95%。這些結(jié)果說明使用本方法主要獲得的是高純度的收縮型VSMC。

注：(A)蛋白α-SMA；(B)對應(yīng)(A)的細胞核DAPI染色；(C)合并A & B；(D)蛋白myosin-II； (E)對應(yīng)(D)的細胞核DAPI染色；(F)合并D & E。圖3 細胞免疫熒光Note. (A) α-SMA; (B) DAPI-stained cell nucli of (A); (C) Merge of A & B; (D) Myosin-II; (E) DAPI-stained cell nuclei of (D); (F) Merge of D & E.Fig.3 Immunofluorescence assay of the P2 VSMCs

2.4 VSMC的mRNA和蛋白的表達分析

我們對分離培養(yǎng)的VSMC表型基因的表達情形還進行了RNA和蛋白的定量分析。首先以實時定量PCR分析了所分離的細胞中各類收縮型VSMC典型性狀基因的表達情形。如圖4A所示，兩次單獨分離的P2代VSMC細胞均高水平表達一系列VSMC收縮型表型標記物基因，如Acta2、Myh11、Tagln等；且控制這些表型基因表達的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Myocardin的基因也在細胞中表達[27]。較T6這種肌纖維化樣的肝星狀細胞，分離的VSMC中Acta2和Tagln的表達水平明顯增高，表明這些細胞維持更強的收縮型VSMC基因表達。以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)它們均為單一條帶(圖4B)，說明基因擴增的特異性。

注：(A)P2代VSMCs各基因RNA水平的定量PCR分析；(B)PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖4 VSMCs的mRNA表達分析Note. (A)Quantitative PCR analysis of RNA levels of genes in the P2 VSMCs; (B) Results of 2% agarose gel electrophoresis of the PCR products.Fig.4 mRNA expression analysis of the VSMCs

隨后取P2 ～ P4代VSMC、T6和HeLa細胞總蛋白進行Western blot，定量分析細胞中α-SMA和myosin-II的蛋白表達情形。如圖5所示，兩種蛋白在所有被檢細胞中都有一定表達，但在分離的VSMC中的表達水平顯著高于T6和HeLa細胞，說明所分離的VSMC在傳至P4代時仍然維持極好的收縮型VSMC表型性狀。

圖5 VSMCs的蛋白表達分析Fig.5 Protein expression analysis of the VSMCs

最后，鑒于分離的原代VSMC在培養(yǎng)過程中逐漸從收縮型表型向合成型表型轉(zhuǎn)變，我們比較了培養(yǎng)至P4代和P8代時，所分離的VSMC中表型基因表達情形的差異。從圖6可以清楚地看見，較P4代VSMC， P8代細胞中Myh11的RNA水平急劇下降，α-SMA的RNA表達也下調(diào)但幅度小。圖6還顯示了myocardin和Kruppel-like factor 4這對調(diào)控SMC收縮表型基因表達的正負轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達情形。它們的RNA表達水平在P4代和P8代分別逆轉(zhuǎn)，前者水平由高變低，后者水平從低到高，共同調(diào)控著細胞從收縮型表型向合成型表型的轉(zhuǎn)變。

注：(A)收縮表型基因；(B)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因。圖6 P4和P8代VSMC的RNA表達水平比較Note. (A) contractile gene; (B) the gene of transcription regulatory factors.Fig.6 Comparison of RNAs expression levels between the P4 and P8 VSMCs

3 討論

在實驗中我們對傳統(tǒng)的復(fù)合酶消化方法進行了反復(fù)摸索改良，精確調(diào)制了復(fù)合酶的配制和消化時間以提高消化效果，獲得了很好的分離效果；同時還對每一步操作細節(jié)加以細化，使其可為初學(xué)者輕松掌握。主要的改進點為：(1)選擇90 ～ 100 g的大鼠作為胸主動脈取材對象，既保證了VSMC的增殖分化潛能，又滿足了操作要求；(2)選取膠原蛋白酶和胰肽酶配制復(fù)合酶，保證中膜層中VSMC的釋放；(3)在酶消化液中添加了胰酶抑制劑，改善所分離細胞的活力；(4)利用空氣搖床震蕩進行初步消化，促使血管內(nèi)外膜充分接觸混合酶液、消化時間減少為45 min，利于內(nèi)外膜的剝離，減少內(nèi)外膜與中膜層的牽拉，提高了細胞活性和細胞純度；(5)將剝離的中膜層剪成組織碎塊，轉(zhuǎn)入6孔板在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行再消化，每間隔20 min略加晃動，充分保證酶的消化效果，消化時間也被縮短為1 h；(6)接種P0細胞到6孔板、長滿后傳至10 cm培養(yǎng)皿進行P1代VSMC培養(yǎng)。這樣的接種密度可以使得VSMC維持較好的增殖速率。經(jīng)過這些改進，可在2周左右獲得百萬量的P1代收縮型VSMC、P2代時純度高達95%以上。

我們在摸索過程發(fā)現(xiàn)，確保所分離的VSMC活力的關(guān)鍵是維持中膜層的完整。在剝離外膜時，動作要輕柔；在刮除內(nèi)膜時，用力要均勻，一般兩次刮除就足夠了。過多刮除會損壞中膜層，降低細胞產(chǎn)量和活力。使用我們建立的復(fù)合酶配方及其作用條件進行初步酶消化，可適當降解內(nèi)外膜組織間的蛋白成分、使得內(nèi)外膜的去除輕松易行，對中膜層的損傷大為降低。二步消化的設(shè)計不僅可以較好地消除內(nèi)外膜中其它細胞成分的污染、提高分離的VSMC細胞純度，還可以大大縮短制備VSMC的時間[5,19]。

有研究者發(fā)現(xiàn)，以組織塊貼壁法制備VSMC雖然所獲得的細胞數(shù)量較多，但多為合成型表型；而采用酶消化法制備的VSMC則保留了收縮型表型[3,13，14]。為了確定使用我們的改良方法所分離的細胞的表型，我們考察了P2-P4代細胞中多個收縮型表型分子標記基因及收縮表型調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的RNA和蛋白表達情形，證實細胞均高水平地表達這些標記基因。進一步分析傳至P8代的細胞，我們確定典型的收縮型VSMC分子標記和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達水平隨培養(yǎng)時間增長而下降，尤其是myosin-II這一分子標記，其RNA水平的降低幅度遠超α-SMA基因，是較α-SMA更為準確的SMC分子標記。因此，使用我們改良的方法可分離制備高純度的收縮型大鼠VSMC。

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Preparation of rat thoracic aortic vascular smooth muscle cells bymodified enzyme double digestion

ZHOU Yue-hua1, 2， LIU Xing1, 2， ZHANG Yan-jun1, 2， WANG Xin1, 2， CHEN Yu-ping1, 2*

(1.Key Lab for Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China；2.School of Materials Science And Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031)

Objective This paper reports a modified method for the isolation of rat thoracic aortic vascular smooth muscle cells based on combined enzyme double digestion. Methods An enzyme mixture containing collagenase II, soybean trypsin inhibitor and elastase was prepared and used to remove the aortic tunica intima and tunica adventitia, and then the tunica media was subjected to second digestion using the same enzyme mixture and to isolate vascular smooth muscle cells. Results The isolated VSMCs were cultured in vitro and the growing cells had an elongated spindle-shape, reached confluence within a week, and displaying a typical "hill-and-valley" pattern. After 1 week, the cells were passaged. Contractile smooth muscle markers(α-SMA, myosin-II and β-tubulin) were highly expressed in the isolated cells. More than 90% of the cells significantly expressed alpha smooth muscle actin and myosin-II. Conclusions Themethod established in this study has advantages of simple and easy to operate, and good reproducibility, with a high activity and purity of the separated cells. It can ensure to obtain a large amount of contraction-type vascular smooth muscle cells within a short time.

Vascular smooth muscle cells; Complex enzyme; Two step digestion

國家自然科學(xué)基金(編號：81371675，81330031)。

周玥華(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)：材料工程。Email: 734173594@qq.com

陳渝萍(1970-)，女，教授。Email: yupingc@home.swjtu.edu.cn

研究報告

A

1671-7856(2017) 07-0017-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.004

2016-12-05