猴B病毒抗體不同檢測(cè)方法的比對(duì)

李晉文，佟 巍，蔡 鵑，向志光，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

猴B病毒抗體不同檢測(cè)方法的比對(duì)

李晉文，佟 巍，蔡 鵑，向志光*，魏 強(qiáng)*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

目的 猴B病毒(monkey B virus，BV)，也稱猴皰疹病毒I型(Cercopithecineherpesvirus1)，是重要的人獸共患病原。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，猴B病毒作為抗原檢測(cè)抗體，但由于生物安全問(wèn)題，抗原制備受到很大限制，因此使用替代抗原進(jìn)行抗體血清學(xué)檢測(cè)并進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。方法 應(yīng)用2種ELISA方法(抗原分別為BV和HVP2)和1種免疫酶法EIA方法(抗原為HSV-1)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室135份送檢恒河猴血液樣品進(jìn)行篩查，對(duì)陽(yáng)性及可疑樣品再以免疫熒光法IFA和Western blot方法(抗原為HSV-1)以及以HSV-1 gC1純化糖蛋白為抗原的免疫印跡方法驗(yàn)證。結(jié)果 HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA陽(yáng)性檢出率分別為32.6%、37.8%和34.8%；3種方法檢測(cè)結(jié)果一致的樣品占91.1%(123/135)，陽(yáng)性結(jié)果可被IFA和WB確證；可疑樣品12份，33.3%(4/12)的樣品經(jīng)驗(yàn)證檢驗(yàn)為陽(yáng)性。結(jié)論 與BV抗原相比，替代抗原HSV-1的敏感性和特異性較HVP2更為接近；陽(yáng)性樣品及可疑樣品的確證檢驗(yàn)應(yīng)使用多種方法，避免漏檢。

猴B病毒；替代抗原；HSV-1；HVP2；ELISA；EIA；IFA；WB

猴B病毒屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，單純皰疹病毒屬。猴B病毒自然宿主為亞洲獼猴，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等[1，2]，動(dòng)物自然感染一般無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)，病毒感染后多潛伏在神經(jīng)組織[2]。然而病毒感染人后，可以導(dǎo)致腦炎、腦脊髓炎等嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀，甚至死亡[3，4]。因此猴B病毒是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物使用中必須排除的烈性病原體[5]?？焖贉?zhǔn)確地檢測(cè)猴B病毒對(duì)建立高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)猴群以及對(duì)高危人群進(jìn)行防護(hù)都有著非常重大的意義。

猴B病毒的檢測(cè)多采用血清學(xué)方法，但由于猴B病毒屬于一類病原，必須在生物安全四級(jí)(biosafety level 4，BSL-4)實(shí)驗(yàn)設(shè)施操作，從生物安全的角度考慮出發(fā)，目前國(guó)內(nèi)外多用與B病毒具有交叉抗原的替代病毒抗原檢測(cè)B病毒抗體。也有科學(xué)家利用重組抗原進(jìn)行BV血清學(xué)檢測(cè)[6-8]，但國(guó)內(nèi)外常用HSV-1、HVP2等作為抗原檢測(cè)猴B病毒[9-12]。

本實(shí)驗(yàn)室BV常用的檢測(cè)方法包括ELISA(抗原分別為BV和HVP2)，免疫酶法 (EIA)和，免疫熒光法 (IFA)(抗原為HSV-1)，Western Blot方法以及以HSV-1 gC1純化糖蛋白為抗原的免疫印跡方法，本文將應(yīng)用這些方法測(cè)試我單位近期送檢的135份樣品，對(duì)以上檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。

1 材料和方法

1.1 恒河猴樣本血清

HSV-1(ATCC VR-539)病毒抗原的制備參考既往方法[5]。恒河猴血清樣品送檢時(shí)間為2014年12月 ～ 2016年6月，本室保存。質(zhì)控陽(yáng)性血清為既往20份BV陽(yáng)性血清的混合物，這些血清排除了猴免疫缺陷病毒、猴逆轉(zhuǎn)D型病毒、猴T細(xì)胞趨向性病毒Ⅰ型和猴痘病毒抗體的存在[5]。質(zhì)控陰性血清為20份BV陰性血清混合物，同樣排除其他病原抗體。

1.2 HSV-1病毒抗原和EIA、IFA、Western blot方法

HSV-1病毒抗原的制備和HSV-1-WB方法[13]的參考既往方法，調(diào)整如下：抗原蛋白上樣量20 μg/道，恒河猴血清樣品稀釋比例為1∶100，二抗為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的兔抗猴IgG抗體。

IFA和EIA方法檢測(cè)參考本實(shí)驗(yàn)室既往方法[5]。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法

猴ELISA-BV(珠海海泰)和ELISA-HVP2(蘇州西山，VRA China)為市售商品試劑。ELISA-HVP2結(jié)果判定方法為：樣品OD值≥0.3，為陽(yáng)性；樣品OD值<0.3，為陰性；同時(shí)為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，對(duì)于OD值在0.25 ～ 0.35之間的樣本，建議復(fù)檢或其他方法進(jìn)一步復(fù)證。ELISA-BV結(jié)果判定方法為：樣品OD值>臨界對(duì)照OD均值×1.15，為陽(yáng)性；臨界對(duì)照OD均值×0.85≤樣品OD值≤臨界對(duì)照OD均值×1.15，為可疑；樣品OD值<臨界對(duì)照OD均值×0.85，為陰性。實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)ELISA-HVP2(蘇州西山，VRA China)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了調(diào)整，陽(yáng)性樣品判定標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整為：陽(yáng)性：樣品OD值>0.25；陰性：樣品OD值<0.35，；可疑：0.25≤樣品OD值≤0.35。

1.4 HSV-1 gC1純化糖蛋白為抗原的免疫印跡方法

親和層析純化的HSV-1糖蛋白C1(歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司，EUROIMMUN)用于免疫印跡檢測(cè)，為適應(yīng)猴血清樣品檢測(cè)作以下調(diào)整：酶結(jié)合物改為HRP標(biāo)記的兔抗猴IgG抗體(稀釋比例為1∶10000)；通用緩沖液清洗5次后，經(jīng)ECL曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 HSV-1病毒蛋白經(jīng)SDS-PAGE展示可顯示血清樣品中抗病毒抗體特異結(jié)合

經(jīng)差速離心分離的HSV-1病毒經(jīng)超聲處理后與含SDS的上樣緩沖液混合處理進(jìn)行凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至NC膜上。和B病毒抗體陰性的恒河猴血清共孵育無(wú)特異條帶(圖A，N泳道)；和B病毒抗體陽(yáng)性的恒河猴血清共孵育顯示出特異條帶(圖A，P泳道)，包括分子量115 kDa、分子量65 kDa和分子量58 kDa的條帶，符合猴B病毒糖蛋白gB、gC和gD的分子量大小，和文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

2.2 初篩檢測(cè)方法的比較

用HVP2-ELISA方法、BV-ELISA方法和HSV-l-EIA方法三種檢測(cè)方法對(duì)135份恒河猴血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為32.6%(44/135)、 37.8%(51/135)、34.8%(47/135)。3種方法檢測(cè)結(jié)果一致的樣品占91.1%(123/135)，其中，陽(yáng)性樣品結(jié)果一致的有42份，陰性樣品結(jié)果一致的有81份。而三種檢測(cè)方法結(jié)果不一致的樣品11份；三種方法均判定為可疑的樣品1份。因此，三種方法每一種均不能完全覆蓋其他樣品的陽(yáng)性檢出范圍。

隨后，我們對(duì)陽(yáng)性樣品和可疑樣品進(jìn)行了后續(xù)驗(yàn)證檢驗(yàn)。

2.3 可疑血清樣品的判定

以上三種檢測(cè)方法結(jié)果一致的陰性樣品81份，陽(yáng)性樣品42份，所有結(jié)果可被HSV-1 IFA、HSV-1 WB和HSV-1 gC1純化糖蛋白為抗原的免疫印跡方法確證。其余8.9%(12/135)為可疑陽(yáng)性樣品包括： 1份可疑樣品，三種檢測(cè)方法初篩為可疑樣品，經(jīng)多種方法確證為陰性；11份三種檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品，其中，HVP2 ELISA和BV ELISA方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品有7份，經(jīng)HSV-1 IFA、HSV-1 WB(圖1B)和HSV-1 gC1純化糖蛋白為抗原的免疫印跡方法確證，3份樣品被判定為陽(yáng)性，4份樣品被判定為陰性(如表1所示)。然而，其中2和7號(hào)樣品僅經(jīng)BV-ELISA判定為陽(yáng)性，經(jīng)多種驗(yàn)證方法均無(wú)法確證為陽(yáng)性，因此推測(cè)BV-ELISA方法檢測(cè)猴B病毒抗體并不完全可靠。此外，對(duì)HSV-1 EIA與BV ELISA方法比較，檢測(cè)結(jié)果不一致的其余3份樣品也進(jìn)行了確證，1份樣品被判定為陽(yáng)性，2份樣品被判定為陰性。因此，可疑樣品的驗(yàn)證檢驗(yàn)的陽(yáng)性率為33.3%(4/12)。

表1 HSV-1 IFA、HSV-l WB和HSV-1 gC1免疫印跡方法確證結(jié)果Tab.1 Confirmation results of HSV-1 IFA，HSV-l WB and HSV-1gC1 immunoblotting

注：UN表示無(wú)法做出陽(yáng)性或陰性判定的可疑樣品；帶“*”的樣品是被驗(yàn)證為陽(yáng)性的樣品。

Note. UN indicates the suspicious samples that can not be qualitified; The samples marked with“*” are confirmed as positive.

注：A：猴B病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照抗血清和仙臺(tái)病毒抗原雜交結(jié)果。雜交使用預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)(sm0671，F(xiàn)ermentas)。圖中N為陰性對(duì)照血清，P為陽(yáng)性對(duì)照血清。B：待檢可疑樣品免疫印記結(jié)果。1～7道依次為編號(hào)1 ～ 7檢測(cè)樣品。圖1 猴B病毒W(wǎng)estern blot檢測(cè)結(jié)果Note. A: Hybridization results of monkey BV positive serum and negative serum and Sendai virus antigen. Prestained molecular weight standard was used(sm0671, Fermentas). N: negetive serum; P: positive serum. B: Immunoblot results of suspicious samples. The lines 1～7 indicate the samples to be detected.Fig.1 Results of Western blot detection of the BV samples

3 討論

病原檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多方面因素影響包括：抗原的狀態(tài)、抗原來(lái)源以及質(zhì)控樣品以及臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)等。EIA和IFA檢測(cè)方法病毒抗原以細(xì)胞感染的狀態(tài)經(jīng)丙酮固定、干燥，附著于載玻片； ELISA方法病毒抗原蛋白通過(guò)電荷吸附的方式包被；WB方法病毒蛋白抗原通過(guò)變性還原成線性表位。每一種檢測(cè)方法展示的抗原表位可能存在差異，所有判定結(jié)果也會(huì)有不同。因此在猴B病毒抗體的檢測(cè)中有必要使用多種方法進(jìn)行檢測(cè)。

猴B病毒存在非常高的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，目前國(guó)內(nèi)外一般用HSV-1或HVP2等替代抗原檢測(cè)猴B病毒。而多個(gè)實(shí)驗(yàn)室比較各種抗原的檢測(cè)方法，認(rèn)為使用替代抗原檢測(cè)存在漏檢的可能[15-19]。本文HVP2-ELISA方法陽(yáng)性檢出率為32.6%，檢出率低于其他檢測(cè)方法，可能有漏檢的情況發(fā)生，適當(dāng)降低陽(yáng)性樣品的判定標(biāo)準(zhǔn)，將可疑樣品判定范圍下限值作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，三種方法結(jié)果較為一致。參考猴B病毒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，本文BV-ELISA方法由于未設(shè)置正?？乖瓕?duì)照，無(wú)法排除非特異結(jié)合的可能，導(dǎo)致將陰性樣品誤判為陽(yáng)性，因此BV-ELISA方法用來(lái)監(jiān)測(cè)猴B病毒感染的動(dòng)物并不完全可靠，還需要經(jīng)多種檢測(cè)方法驗(yàn)證。

在皰疹病毒中, 表面糖蛋白在決定細(xì)胞趨向性和致病性方面起著重要作用。猴B病毒與HSV-1糖蛋白氨基酸序列一致性平均高達(dá)62.5%，依次為gB(79.9%)，gD(57%)，gC(49.9%)，gE(46%)和gG(29.2%)[20]。由于血清抗gE抗體滴度低，而gG一般不能刺激產(chǎn)生抗體，因此gB、gD和gC是引起HSV-1病毒抗原和恒河猴抗血清發(fā)生抗原交叉反應(yīng)的主要成分[14]。其中BV與HSV-1gB的氨基酸序列一致性最高，抗gB抗體出現(xiàn)最早，抗體滴度最高；盡管如此，二者gB構(gòu)象結(jié)構(gòu)存在明顯差異，而相應(yīng)抗體的產(chǎn)生高度依賴于gB結(jié)構(gòu)構(gòu)象暴露的抗原表位，因此對(duì)于WB實(shí)驗(yàn)中展示的HSV-1 gB線性表位，相對(duì)于gD檢測(cè)猴抗血清抗體敏感性較弱[21]。此外，在WB和斑點(diǎn)印記實(shí)驗(yàn)中，血清抗gC抗體不能高效識(shí)別gC線性表位。所以，恒河猴血清抗gD抗體與HSV-1gD特異結(jié)合顯示58 kDa分子量大小的蛋白條帶是本文WB方法主要的判定依據(jù)，gB和gC顯示的115 kDa，65 kDa和80 kDa的蛋白條帶則作為參考依據(jù)，而以HSV-1 gC1為抗原的免疫印跡法僅作為輔助參考的檢測(cè)方法。在ELISA、IFA和EIA三種方法中由于抗原純度的限制而對(duì)某些感染情況難以判斷，但是在WB方法中可以較好的區(qū)分非特異雜交的背景和核心抗原條帶的雜交，如圖B所示的樣品，雖然存在一定的非特異背景，但是可以辨識(shí)出核心抗原條帶的陽(yáng)性雜交，因此可以判定為BV陽(yáng)性。

本文通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系現(xiàn)有的檢測(cè)方法進(jìn)行比較，先使用不同抗原作為檢測(cè)抗原所建立的ELISA和EIA方法篩查猴B病毒感染動(dòng)物，再使用WB方法確證，同時(shí)聯(lián)合IFA等其他方法，具有一定的實(shí)用價(jià)值和意義。而對(duì)于任意一種方法檢測(cè)出的陽(yáng)性以及可疑陽(yáng)性樣品，采用不同方法以做出診斷，無(wú)論對(duì)于繁育群體還是研究群體都是有重要意義的。

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Comparison of different detection methods of monkey B virus antibody

LI Jin-wen， TONG Wei， CAI Juan， XIANG Zhi-guang*， WEI Qiang*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy Of Medical Sciences；Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)

Objective Monkey B virus(BV), also known asCercopithecineherpesvirus1,is an important zoonotic pathogen. According to the national standard, antibodies are detected using BV as an antigen. However, the preparation of BV antigen is very stricted due to biosafety issues. Therefore, in this study, we used alternative antigens to detect the BV antibody by serological assay and verified their specifity and sensitivity. Methods A total of 135 blood samples from rhesus monkeys were tested by two ELISA method (BV and HVP2) and enzyme immunosorbent assay (EIA)method. The positive and suspicious samples were verified by immuno-fluorescence assay (IFA), Western blot and immunoblotting technique using HSV-1 gC1 purified glycoprotein as an antigen. Results The positive rates of HVP2-ELISA, BV-ELISA and HSV-1-EIA were 32.6%, 37.8% and 34.8%, respectively. Consistant result of the three detection method accounted for 91.1% (123/135), and the positive result were confirmed by IFA And WB.There were 12 suspicious samples,in which 33.3% (4/12) were verified to be positive. Conclusions Compared with BV antigen, the sensitivity and specificity of the alternative antigen HSV-1 are moe close than HVP2. Positive and suspicious samples should be verified by several method to avoid missed detection.

Monkey B virus; Alternative antigen; HSV-1; HVP2; ELISA; Enzyme immunosorbent assay, EIA; Immuno fluorescence assay, IFA; Western blot

協(xié)和青年基金(編號(hào)：3332015196)和衛(wèi)計(jì)委公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(編號(hào)：201302006)。

李晉文，女，碩士研究生，比較醫(yī)學(xué)。Email: elberra_ljw@163.com

向志光，Email: xiangzg@cnilas.org；魏強(qiáng)，Email: weiqiang0430@sohu.com.*共同通訊

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0029-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.006

2017-02-13