一種增加畢赤酵母生產(chǎn)胰島素前體的方法

梁晨晨，王立，羅秋玲，吳靜

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一種增加畢赤酵母生產(chǎn)胰島素前體的方法

梁晨晨1,2，王立1,2，羅秋玲2，吳靜1

1 江南大學藥學院，江蘇無錫 214122 2 江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122

梁晨晨,王立, 羅秋玲, 等. 一種增加畢赤酵母生產(chǎn)胰島素前體的方法. 生物工程學報, 2017, 33(7): 1178–1189.Liang CC, Wang L, Luo QL, et al. A method to increase the production of insulin precursor in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1178–1189.

為了提高胰島素前體 (PI) 的產(chǎn)量，構(gòu)建了pPIC9K-PI表達載體并電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株GS115中，在濃度為4.0 mg/mL的G418抗性平板上篩選到了1株拷貝數(shù)為12的菌株CL012。將SNAREs (可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子受體蛋白) 組分中的SNC2和SNC2-SSO2分別轉(zhuǎn)入菌株CL012中，并在搖瓶和5 L發(fā)酵罐水平上檢測SNAREs對PI產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：搖瓶水平上，甲醇誘導96 h后，菌株CL012的PI產(chǎn)量為1.53 mg/L；表達SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI產(chǎn)量分別為1.89 mg/L和2.21 mg/L，分別比菌株CL012提高了23.53%和44.44%。在5 L發(fā)酵罐上進行高密度發(fā)酵，甲醇誘導96 h后菌株CL012的PI產(chǎn)量為53 mg/L，是搖瓶水平的34.64倍；表達SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI產(chǎn)量分別達到64 mg/L和78 mg/L，分別比菌株CL012提高了20.75%和47.17%。由此得出結(jié)論SNAREs可以促進胰島素前體的分泌，從而提高在畢赤酵母中的異源表達。

畢赤酵母，胰島素前體，SNAREs，異源表達

作為重要蛋白表達宿主，畢赤酵母廣泛應(yīng)用于不同來源 (人、動物、植物、真菌和病毒) 和不同類型(分泌型和非分泌型) 重組蛋白的高效生產(chǎn)[1-2]。但是，并不是所有的重組蛋白都能有效地分泌，這是因為重組蛋白的高水平表達面臨著基因劑量[3]、mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工折疊[4]以及在胞質(zhì)中的運輸?shù)戎T多制約其產(chǎn)量的關(guān)鍵瓶頸。其中，重組蛋白的分泌運輸是制約其高效生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。重組蛋白在畢赤酵母中的分泌過程主要包括新生蛋白從核糖體上合成后到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊、蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運輸[5]以及蛋白從高爾基體到質(zhì)膜的運輸。分泌路徑中的每一步都可能成為蛋白分泌的限速步驟，從而影響目標蛋白的有效分泌。其中新生蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運輸分為兩種：共翻譯運輸[6]和翻譯后運輸[7]；運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)的新生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊蛋白的作用下進行折疊加工[8]；緊接著蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)礁郀柣w進行進一步加工，加工成熟的蛋白質(zhì)離開高爾基體運輸?shù)郊毎|(zhì)膜。蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體以及高爾基體到細胞質(zhì)膜的運輸需要運輸囊泡的作用[9-11]。運輸囊泡和靶膜之間的相互作用需要SNAREs的作用，SNAREs (可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著型蛋白受體)是一種Ⅱ型膜蛋白，在運輸囊泡和靶膜的膜融合過程中促使膜融合[12]，促進蛋白的運輸。

SNAREs分為兩種：一種存在于靶膜上，被稱為v-SNAREs；另一種存在于運輸囊泡上，被稱為t-SNAREs。v-SNAREs和特定靶膜上的t-SNAREs相互作用形成復合體SNAREs，稱為SNAREpin[13]。SNAREpin由3種成分組成：Sso1/2、Sec9和Snc1/2。其中SNAREs復合體由Snc1/2和Sso1/2的各一個α螺旋區(qū)域和Sec9的兩個螺旋區(qū)域組成。SNAREs已經(jīng)被確定存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜、液泡/溶酶體、質(zhì)膜以及從這些膜衍生出的運輸囊泡的膜上[14]。在促進蛋白運輸?shù)倪^程中，SNAREs在不同的囊泡和質(zhì)膜之間的膜融合運輸中扮演著重要的角色。van Zyl等[15]通過過表達釀酒酵母中SNC1將來自埃默森籃狀菌的纖維二糖水解酶的產(chǎn)量提高71%，過表達SSO1將來自扣裹腹膜酵母的β-葡糖苷酶的產(chǎn)量提高43.8%。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中過表達SSO1可以將來自里氏木霉的纖維二糖水解酶的產(chǎn)量提高10%。Gasser等[17]通過在畢赤酵母中過表達SSO2將人免疫抗體Fab的產(chǎn)量提高20%。Hou等[11]發(fā)現(xiàn)過表達SNAREs蛋白的輔助蛋白SM蛋白中的組分SEC1可以使α-淀粉酶的產(chǎn)量提高16%。

除了優(yōu)化畢赤酵母中高爾基體到質(zhì)膜的分泌路徑，人們還常常使用以下策略用來提高畢赤酵母中異源蛋白的生產(chǎn)，如：增加拷貝數(shù)[18]、優(yōu)化密碼子[19]、使用強啟動子[20]、選擇利于分泌的信號肽[21]，以及共表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中幫助新生蛋白的正確折疊的分子伴侶PDI[22]和BiP[7]等。Zhu等[23]通過將豬胰島素前體基因的拷貝數(shù)增加到12，使得豬胰島素前體的產(chǎn)量提高12.5倍，達到181 mg/L。Ben等[1]利用密碼子優(yōu)化的序列使得狂犬病毒糖蛋白的產(chǎn)量增加了2.1倍。Ben等[24]利用組成型啟動子GAP替換AOX1啟動子將狂犬病毒糖蛋白的產(chǎn)量增加了1.22倍。Vadhana等[25]利用自身信號肽代替α信號肽將南極假絲酵母脂肪酶B的產(chǎn)量提高了2倍。Shen等[26]在畢赤酵母中共表達PDI使得白細胞介素-1受體拮抗劑 (IL1ra) 的產(chǎn)量增加了2.4倍。Damasceno等[8]在畢赤酵母中共表達BiP使A33單鏈抗體 (A33scFv) 的產(chǎn)量提高了3倍。

本研究中為了提高胰島素前體的產(chǎn)量，以胰島素前體作為模式蛋白檢測SNAREs對胰島素前體從高爾基體到細胞質(zhì)膜運輸?shù)淖饔谩为毰c同時共表達來自釀酒酵母的SNAREs，增加胰島素前體的分泌。本實驗中，首先在畢赤酵母中成功表達并分泌胰島素前體基因 (PI)，然后通過整合SNARE組分的SNC2和SSO2，提高胰島素前體的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

pMD19-T-simple (TakaRa公司)；pPICZα載體，pPIC9K載體，大腸桿菌JM109，畢赤酵母GS115，本實驗室保存。pPIC6α載體，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所高新老師惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ、RⅠ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ、DNA marker DL10000、DNA marker DL2000，購自大連寶生物工程公司；蛋白marker、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、Lyticase、引物合成、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒，購自上海生工生物工程公司；博萊霉素 (Zeocin)、遺傳霉素 (G418)、殺稻瘟菌素(Blasticidin)，購自Invitrogen公司；酵母基因組試劑盒，購自天根公司；iUniversal SYBR Green Supermix，購自Bio-rad 公司；PCR、QPCR擴增儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀Green Pulser、核酸電泳儀、蛋白電泳儀，購自Bio-rad公司；Diode Array Bio Photometer U-0080D核酸濃度測定儀，購自HITACHI公司；5 L發(fā)酵罐，購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

低鹽LB、YPD、YPDS、MD、BMGY、BMMY、BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、PTM1微量元素液的組成與配置參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2 表達載體的構(gòu)建

將含胰島素前體基因PI的質(zhì)粒pUC57-PI經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切連接至相同雙酶切的pPIC9K質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化JM109后，進行菌落PCR驗證。根據(jù)伴侶蛋白SNC2、SSO2基因序列設(shè)計寡核苷酸鏈，合成引物 (表1)，通過PCR技術(shù)利用引物SNC2-F和SNC2-R、SSO2-F和SSO2-R分別以釀酒酵母的基因組為模板擴增出SNC2和SSO2基因序列，兩端均分別含有Ⅱ和Ⅰ酶切位點。PCR產(chǎn)物純化后將SNC2和SSO2的成熟片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，涂布于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，將長出的單菌落進行PCR驗證，驗證正確的菌株送測序，將測序正確的菌株提取質(zhì)粒后使用Ⅱ和Ⅰ雙酶切后進行膠回收，與使用同樣酶切的畢赤酵母表達載體pPICZα、pPIC6α相連接，構(gòu)建克隆載體 (α信號肽已除) pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2和pPIC6-SSO2。

1.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建

用Ⅱ線性化的表達載體pPIC9K-PI電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115后，涂布到MD固體平板上，將長出的單菌落接入YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至對數(shù)期，提取酵母基因組，以5′AOX1和3′AOX1為引物 (表1)，PCR條件：95 ℃2 min；95 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，檢測表達載體pPIC9K-PI是否整合進酵母基因組中。

表1 PCR引物序列列表

1.4 重復電轉(zhuǎn)化制備不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母

將MD平板上長出并且驗證正確的菌株作為出發(fā)菌株，進行下一輪電轉(zhuǎn)化。以選出的出發(fā)菌制作酵母感受態(tài)細胞，利用Ⅰ線性化的pPIC9K-PI對其再次電轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布到含不同濃度的G418的YPDS平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，G418的濃度梯度為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL，將長出的菌落再次劃線于含相同濃度G418的YPDS 平板上，并以出發(fā)菌作對照，以5′AOX1和3′AOX1為引物，驗證制備的不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母。

1.5 定量PCR確定PI基因拷貝數(shù)

質(zhì)粒的構(gòu)建：提取X-33菌株基因組，以GAP-F和GAP-R為引物 (表2) 從X-33基因組中擴增出GAP基因片段，將擴增出的GAP片段連接pMD19-simple-T載體，送測序，將測序正確的T載體命名為pMD19-GAP，制作內(nèi)參的標準曲線；含有PI序列的表達載體pPIC9K-PI制作目的基因的標準曲線。

PI基因拷貝數(shù)的測定：待測酵母菌株接種于YPD中，30 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，收集約1×107個細胞，先用酵母細胞壁裂解酶 (Lyticase) 進行破壁處理30 min，再按照酵母基因組提取試劑盒說明進行操作。使用Beacon Designer 軟件設(shè)計定量PCR引物 (表2)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Premix Ex，1 μL 10 μmol/L正向和反向引物，2 μL質(zhì)粒 (制作標準曲線) 或待測重組畢赤酵母基因組為模板，6 μL水；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。熒光信號在每個循環(huán)延伸結(jié)束時采集，擴增后，融解曲線按儀器默認程序進行，即65–95 ℃，0.5 ℃/s，測定待測重組畢赤酵母PI基因的拷貝數(shù)[27]。

1.6 含SNAREs畢赤酵母菌株的構(gòu)建

以Ⅰ線性化表達載體pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2 后電轉(zhuǎn)化含PI拷貝數(shù)最高的畢赤酵母，分別涂布在100 μg/mL的含博萊霉素的抗性平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，將長出的菌落再次劃線于含相同濃度博萊霉素的YPDS平板上，將長出的菌落進行基因組驗證，以5′AOX1和3′AOX1為引物，驗證含伴侶蛋白的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建。將基因組驗證正確的含SNC2的重組畢赤酵母菌株制作感受態(tài)，以Ⅰ線性化表達載體pPIC6-SSO2后電轉(zhuǎn)化之，涂布在400 μg/mL含殺稻瘟菌素的抗性平板上。30 ℃倒置培養(yǎng)2–5 d，將長出的菌落再次劃線于含相同濃度殺稻瘟菌素的YPDS平板上，將長出的菌落進行基因組驗證，驗證含兩個SNAREs組成的SNC2、SSO2的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建。

1.7 重組蛋白的誘導表達和Tricine-SDS-PAGE檢測

將重組菌株GS115/pPIC9K-PI和分別整合分子伴侶的SNC2、SSO2、SNC2-SSO2的GS115/pPIC9K-PI的單菌落接種于50 mL生長培養(yǎng)基BMGY/500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；將上述生長培養(yǎng)基中的菌液以4 000 r/min離心10 min后棄掉上清液，用30 mL BMMY培養(yǎng)基重新懸浮菌體，加入100%甲醇至終濃度為1% (/)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h補加100%甲醇至終濃度為1% (/) 進行誘導；甲醇誘導96 h后，12 000 r/min離心5 min，保留上清液，進行Tricine-SDS-PAGE或RP-HPLC。

1.8 重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵

接1 mL重組畢赤酵母甘油管菌液于100 mL YPD/500 mL三角瓶中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)20 h；然后以10%接種量接入到2 L BSM培養(yǎng)基/5 L罐中進行發(fā)酵，用30%的氨水維持pH 5.5，當甘油耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加甘油(控制溶氧大于10%)，6 h后停止，待甘油再次耗盡并饑餓菌體2 h后，開始流加甲醇，并通過調(diào)節(jié)其流速維持培養(yǎng)基中的甲醇濃度在 2 g/L[28]。

表2 定量PCR引物序列

胰島素前體濃度的測定：發(fā)酵液于12 000×離心10 min，保留上清液，將上清用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，利用液相進行分析。使用Dionex UltiMate 3000 system，色譜柱為Vydac Grace C18 (4.6 mm×250 mm) 色譜柱，柱溫30 ℃，檢測波長214 nm，進樣量20 μL，采用梯度洗脫進行分析，流動相A為0.1% TFA水，B為0.1% TFA乙腈，梯度為20%–35% B (0–30 min)，35%–70% B (30–35 min)，70%–20% B (35–36 min)，20%–20% B (36–46 min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多拷貝重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建和表達

用Ⅱ線性化表達載體pPIC9K-PI后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布到MD平板上，將MD平板上長出并且驗證正確的菌株作為出發(fā)菌株，進行下一輪電轉(zhuǎn)化：以選出的出發(fā)菌株制作酵母感受態(tài)細胞，利用Ⅰ線性化的pPIC9K-PI對其再次電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液涂布到含有1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL G418的YPDS固體平板上 (圖1A)。將不同濃度G418平板上篩選出的突變株進行基因組PCR驗證，驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的菌株都可以擴增出2.2 kb (醇氧化酶基因) 和927 bp (表達載體上目的片段) 的片段 (圖1B)。GAP (3′-磷酸甘油醛脫氫酶基因) 在酵母基因組中拷貝數(shù)為1，通過計算待測重組畢赤酵母基因組中目的基因總拷貝數(shù)與GAP總拷貝數(shù)的比值，確定出目的基因的拷貝數(shù)。對pMD19-GAP和表達載體pPIC9K-PI進行系列稀釋，從而獲得目的基因PI和內(nèi)參基因GAP的標準曲線。然后將從1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL G418平板上篩選獲得的突變菌株進行拷貝數(shù)測定，測定的拷貝數(shù)分別為2、3、6、7、12，將對應(yīng)的菌株分別命名為CL002、CL003、CL006、CL007和CL012 (表3)。進一步將5株菌株分別進行甲醇誘導表達，胞外上清進行Tricine-SDS-PAGE分析 (圖2)，結(jié)果表明在6.7 kDa處有一明顯條帶，其中菌株CL012的條帶最為明顯。

圖1 多拷貝重組畢赤酵母的構(gòu)建

2.2 含SNAREs重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建

將Ⅰ線性化的表達載體pPICZ-SSO2、pPICZ-SNC2電轉(zhuǎn)化畢赤酵母CL012，涂布在100 μg/mL的含博萊霉素的抗性平板上，將長出的菌落進行基因組驗證，將驗證正確的菌株分別命名為CL0121和CL0122。以Ⅰ線性化表達載體pPIC6-SSO2后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母CL0122，涂布在400 μg/mL的含殺稻瘟菌素的抗性平板上，將長出的菌落進行基因組驗證，將驗證正確的菌株命名為CL0123。表達載體的構(gòu)建過程如圖3A所示。以5′AOX1和3′AOX1為引物進行基因組驗證 (圖3B)，結(jié)果表明：菌株CL0121、CL0122和CL0123中都含有大小為2.2 kb (醇氧化酶基因) 和927 bp (表達載體pPIC9K-PI上的目的片段) 的片段，由于畢赤酵母表達載體pPICZα/pPIC6α自身可以擴增出588 bp (醇氧化酶基因) 大小的片段，而pPICZα/pPIC6α中信號肽的大小為266 bp且已經(jīng)被切除，所以pPICZα/pPIC6α應(yīng)該擴增出322 bp大小的片段，由于SNC2片段大小為348 bp，SSO2的大小為888 bp，所以表達載體pPICZ-SNC2、pPICZ-SSO2和pPIC6-SSO2擴增出的大小分別為670 bp、1 210 bp和1 210 bp的片段。

表3 不同濃度G418平板上篩選出的菌株P(guān)I基因拷貝數(shù)的測定

圖2 不同拷貝數(shù)重組蛋白PI表達上清的Tricine-SDS-PAGE分析

2.3 搖瓶水平檢測SNAREs對PI表達的影響

將菌株CL012、CL0121、CL0122和CL0123經(jīng)甲醇誘導96 h后，保留上清液，進行Tricine-SDS-PAGE (圖4A) 和RP-HPLC。其中CL012菌株作為對照菌株，發(fā)現(xiàn)對照菌株CL012的產(chǎn)量為1.53 mg/L，菌株CL0121、CL0122和CL0123的產(chǎn)量分別為1.58 mg/L、1.89 mg/L和2.21 mg/L，比對照菌株CL012提高了3.27%、23.53%和44.44% (圖4B)。菌株CL012的生產(chǎn)能力為0.015 mg/(L·h)，CL0121、CL0122和CL0123的生產(chǎn)能力分別為0.016 mg/(L·h)、0.019 mg/(L·h) 和0.023 mg/(L·h)(圖4C)，比對照菌株CL012提高了6.67%、26.67%和53.33%。

圖3 含SNAREs的重組畢赤酵母的構(gòu)建

2.4 高密度發(fā)酵水平檢測SNAREs對PI表達的影響

選取重組畢赤酵母CL012、CL0121、CL0122和CL0123在5 L發(fā)酵罐上以甘油為碳源進行分批補料發(fā)酵，20 h甘油耗盡，繼續(xù)流加甘油6 h，待溶氧陡然升高后再饑餓菌體2 h，然后流加甲醇開始誘導培養(yǎng)，并維持培養(yǎng)液中甲醇濃度為2 g/L，共誘導96 h。發(fā)酵液上清進行Tricine-SDS-PAGE分析 (圖5)，高密度發(fā)酵數(shù)據(jù)如圖6所示，相關(guān)發(fā)酵參數(shù)計算并總結(jié)于表4。其中CL012是對照菌株，結(jié)果表明：在 5 L發(fā)酵罐上進行高密度發(fā)酵，甲醇誘導96 h后菌株CL012的600達到567，甲醇誘導96 h后菌株CL0121、CL0122和CL0123的600分別為502、460和470，比菌株CL012分別降低了12.95%、23.26%和20.64% (圖6A)。對照菌株CL012的產(chǎn)量為53 mg/L，菌株CL0121、CL0122和CL0123的產(chǎn)量分別為54 mg/L、64 mg/L和 78 mg/L (圖6B)，比對照菌株CL012提高了1.89%、20.75%和47.17%。5 L發(fā)酵罐上進行高密度發(fā)酵，CL012的600達到567，產(chǎn)量為 53 mg/L，是搖瓶水平的34.64倍。CL0121、CL0122和CL0123的罐上產(chǎn)量分別是搖瓶水平的34.18倍、33.86倍和35.29倍。高密度發(fā)酵可以大幅度提升菌體的密度，增加胰島素前體的產(chǎn)量。5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵周期是124 h，對照菌株CL012單位時間內(nèi)生產(chǎn)胰島素前體的生產(chǎn)能力為0.43 mg/(L·h)，菌株CL0121的生產(chǎn)能力也是0.43 mg/(L·h)，CL0122和CL0123的生產(chǎn)能力分別為0.52 mg/(L·h)和0.63 mg/(L·h)，比對照菌株CL012提高了20.93%和46.51%。

圖4 搖瓶水平檢測SNAREs對PI表達的影響

圖5 Tricine-SDS-PAGE分析發(fā)酵罐水平上SNAREs對PI的影響

圖6 高密度發(fā)酵檢測SNAREs對胰島素前體產(chǎn)量的影響

表4 甲醇誘導階段重組畢赤酵母細胞生長和PI的合成情況

3 討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)是一種成熟的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于分泌路徑的瓶頸導致很多外源蛋白留在胞內(nèi)，不能有效地運輸?shù)桨鈁9]。本文通過共表達SNAREs中的組分SNC2和SSO2希望可以增加目的蛋白從高爾基體到細胞質(zhì)膜的運輸，增加目的蛋白的分泌。本文以胰島素前體 (PI) 作為模式蛋白，研究SNAREs在畢赤酵母中促進異源蛋白從高爾基體到細胞質(zhì)膜的運輸作用。SNAREs通過和其輔助蛋白SM相互作用，SM蛋白結(jié)合到t-SNARE的突觸區(qū)域，促進t-SNARE和運輸囊泡上的v-SNARE結(jié)合，t-SNARE和v-SNARE結(jié)合后就會引起構(gòu)型改變，在靶膜上形成融合孔，促進目的蛋白的釋放[13]。在5 L發(fā)酵罐上單獨表達SNC2可以使PI的產(chǎn)量提高20.75%，同時PI的生產(chǎn)能力也增加了20.93%，說明表達SNC2可以促進胰島素前體更多釋放，也和SNC2本身可以促進目的蛋白從高爾基體到細胞質(zhì)膜的運輸作用相一致。單獨表達SSO2對PI的產(chǎn)量沒有影響，不能促進更多的胰島素前體從高爾基體到細胞質(zhì)膜的運輸。但是同時共表達SNC2和SSO2可以進一步提高胰島素前體的產(chǎn)量，使PI的產(chǎn)量提高47.17%，對PI的生產(chǎn)能力提高46.51%。SNC2屬于v-SNARE，SSO2屬于t-SNARE，說明SNC2和SSO2在促進PI于畢赤酵母中的運輸過程中具有協(xié)同作用，將兩者共表達時可以進一步促進胰島素前體的運輸，提高胰島素前體的產(chǎn)量。蛋白伴侶之間經(jīng)常存在著這種協(xié)同作用，如陳飛等[22]利用PDI和Ero1之間的協(xié)同作用將灰蓋鬼傘過氧化物酶的酶活提高2.62倍。Shusta等[29]利用PDI和BIP之間的協(xié)同作用將單鏈抗體片段的產(chǎn)量提高了8倍。

本文通過共表達促進高爾基體到細胞質(zhì)膜的SNAREs組分，提高了畢赤酵母分泌異源蛋白的能力，尋找到了一種可以提高異源蛋白在畢赤酵母中表達的方法，為促進其他外源蛋白在畢赤酵母中的分泌提供了新的方法和思路，同時也找到了一種可以提高胰島素前體產(chǎn)量的新方法。

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(本文責編 郝麗芳)

A method to increase the production of insulin precursor in

Chenchen Liang1,2, Li Wang1,2, Qiuling Luo2, and Jing Wu1

1 College of Pharmacy, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122,Jiangsu,China

To improve the yield of insulin precursor (PI), we constructed a recombinant expression vector pPIC9K-PI and transformed it intoGS115 using electroporation. After screening, a mutant strain CL012 with 12 copies was obtained on the YPDS plate containing 4.0 mg/mL G418. Then, the components of SNAREs (Soluble-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor proteins), SNC2 and SNC2-SSO2, were expressed in the strain CL012 to explore the effect of SNAREs on the yield of PI. In shake flask culture, the strains expressing SNC2 and SNC2-SSO2 yielded PI of 1.89 mg/L and 2.21 mg/L after methanol induction for 96 h, which were improved by 23.53% and 44.44% compared to that of strain CL012 (1.53 mg/L), respectively. Further, in a 5-L bioreactor, the yield of PI with strain CL012 was 53 mg/L for high-density fermentation, after 96 h of methanol induction, which was 34.64-fold higher than that of shake culture. The strains expressing SNC2 and SNC2-SSO2 yielded the PI of 64 mg/L and 78 mg/L, which were respectively increased by 20.75% and 47.17%, compared to that of strain CL012. This work indicated that SNAREs components promoted the secretion of PI to improve its heterologous expression in.

, insulin precursor, SNAREs, heterologous expression

January 11, 2017; Accepted:March 24, 2017

Jing Wu. Tel: +86-510-85197873; E-mail: wujing@jiangnan.edu.cn

Supported by:Key Technologies R&D Program of Jiangsu Province (No. BE2014652), National Natural Science Foundation of China (No. 21576117), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BE2015307, BK20131103).

江蘇省科技支撐計劃社會發(fā)展項目 (No. BE2014652)，國家自然科學基金 (No. 21576117)，江蘇省自然科學基金 (Nos. BE2015307, BK20131103) 資助。