杞精明目湯藥物血漿對結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞TSG-6和PTX3表達的影響

柯梅青，張興儒，項敏泓，李青松，王晗敏，周桂貞

·論著：實驗研究·

杞精明目湯藥物血漿對結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞TSG-6和PTX3表達的影響

柯梅青，張興儒，項敏泓，李青松，王晗敏，周桂貞

目的研究杞精明目湯藥物血漿對結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）和穿透素3（PTX3）表達的影響，探討結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機制及杞精明目湯對其影響作用。方法制備杞精明目湯藥物血漿和無藥血漿，分別用含20%、10%、5%藥物血漿或無藥血漿的細(xì)胞全培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞，4 h、24 h后分別提取mRNA和蛋白質(zhì)，采用實時熒光定量PCR（real time PCR）技術(shù)和Western blot法檢測細(xì)胞TSG-6、PTX3以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3的表達。結(jié)果20%和10%的含藥血漿均可有效上調(diào)結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞TSG-6mRNA和蛋白的表達，且作用接近（P＞0.05），而5%濃度的含藥血漿對TSG-6mRNA和蛋白的表達無明顯上調(diào)作用。三種濃度的含藥血漿對結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞PTX3mRNA和蛋白的表達無明顯作用。三種濃度的含藥血漿均可明顯抑制結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞MMP-1mRNA和蛋白的表達，其中20%和10%濃度對MMP-1mRNA抑制作用較強，效果接近（P＞0.05），其次為5%；20%濃度含藥血漿對MMP-1蛋白表達的抑制作用最明顯，10%和5%濃度對MMP-1蛋白表達的抑制作用無明顯差異（P＞0.05）。三種濃度的含藥血漿均可有效抑制MMP-3mRNA和蛋白的表達，其中對MMP-3mRNA及蛋白的抑制作用最顯著的均為20%濃度的含藥血漿，其次為10%。結(jié)論20%和10%濃度的杞精明目湯藥物血漿能有效上調(diào)TSG-6的表達；20%、10%、5%三種濃度的含藥血漿對PTX3的表達均無明顯作用；三種濃度的杞精明目湯藥物血漿均能有效抑制MMP-1、MMP-3的表達。

結(jié)膜松弛癥；杞精明目湯；腫瘤壞死因子α刺激基因6；穿透素3

結(jié)膜松弛癥（conjunctivochalasis,CCh）是過度松弛的球結(jié)膜堆積在瞼緣、內(nèi)、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學(xué)異常，并伴有眼部干澀、異物感、淚溢等不適癥狀的一種眼病[1-2]。目前認(rèn)為CCh是一種常見的年齡相關(guān)性老年性疾病，但該病病因及發(fā)病機制仍不明了。

臨床研究發(fā)現(xiàn)CCh的松弛結(jié)膜組織變薄，結(jié)膜基質(zhì)及結(jié)膜下Tenon’s囊菲薄甚至溶解消失；相關(guān)基礎(chǔ)研究證實CCh結(jié)膜基質(zhì)及Tenon’s囊的溶解、變薄可能與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP），尤其是MMP-1、MMP-3在結(jié)膜組織和淚液中的表達量增多、酶活性增強引起MMPs和金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor ofmetalloproteinase,TIMP）比例失衡有關(guān)[3-9]。國內(nèi)外多項研究證實，抗炎蛋白腫瘤壞死因子-α刺激基因6（tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6,TSG-6）和穿透素3（pentraxin3,PTX3）（又稱為TNF-α刺激基因14），在松弛結(jié)膜組織及體外培養(yǎng)的結(jié)膜成纖維細(xì)胞中均有較高表達[10-13]；TSG-6siRNA或PTX3siRNA下調(diào)結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞TSG-6或PTX3基因的表達后，均可使MMP-1、MMP-3的表達明顯增加，并且結(jié)膜成纖維細(xì)胞凋亡明顯增加；TSG-6和PTX3或通過抑制結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3的轉(zhuǎn)錄和活化及細(xì)胞凋亡限制結(jié)膜松弛癥的發(fā)病進程[12-13]。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，杞精明目湯藥物血漿可明顯抑制體外培養(yǎng)的松弛結(jié)膜成纖維細(xì)胞分泌MMPs并有效提高TIMPs的表達[14]，促進MMPs/ TIMPs平衡的恢復(fù)，延緩結(jié)膜松弛癥發(fā)病進程；故本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction,real time PCR）聯(lián)合Western blot法進一步檢測杞精明目湯藥物血漿對松弛結(jié)膜成纖維細(xì)胞胞內(nèi)MMP-1、MMP-3的影響，并首次研究杞精明目湯藥物血漿對兩種抗炎蛋白TSG-6、PTX3的調(diào)控作用，為探討CCh的臨床治療方案提供有價值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性SD大鼠24只，普通級（CV），體質(zhì)量（200± 20）g（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實驗室動物房提供）。杞精明目湯[15]成分：黃精20 g、麥冬20 g、旱蓮草15 g、枸杞子15 g、茯苓10 g、川芎3 g、炙甘草3 g。根據(jù)“人和動物之間按體表面積折算的等效計量比值”計算出與70 kg成人用藥量相當(dāng)?shù)?00 g大鼠的等效計量，將藥液濃縮為含生藥3.35 g/ml，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液（含0.02%EDTA）（美國Gibco公司）；胎牛血漿、成纖維細(xì)胞生長添加物（FGS）（美國ScienCell公司）；Trizol（日本Takara公司）；cDNA第一條鏈合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（瑞士羅氏公司）；引物、熒光探針（MMP-1、MMP-3、TSG-6、PTX3、GAPDH）（上海生工公司）；MMP-1單克隆抗體、MMP-3單克隆抗體（英國Abcam公司）；TSG-6單克隆抗體、PTX3單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、BeyoECLPlus（上海碧云天公司）；BSA（美國Sigma公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺（中國安泰公司）；低溫高速離心機、分光光度計、梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；熒光定量PCR儀ABI7300（美國ABI公司）；酶標(biāo)檢測儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO-RAD公司）；化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)儀（中國培清公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織標(biāo)本采集實驗所用結(jié)膜組織來自2015年1月—2015年6月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科行新月形松弛結(jié)膜切除術(shù)的患者，共6例6只眼，納入患者符合文獻[1]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并屬于結(jié)膜松弛癥手術(shù)適應(yīng)癥。本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，對所有樣本提供者進行知情同意并簽署知情同意書。

1.2.2 結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)參照韓竹梅[16]結(jié)膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法：將切取的球結(jié)膜組織用0.9%的生理鹽水漂洗3遍，用眼科顯微剪刀將組織剪成0.5～1mm2大小，平鋪于6孔板內(nèi)，將6孔板翻轉(zhuǎn)為底朝上，然后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，待組織塊周邊接近干燥（約1～3min）時將6孔板翻轉(zhuǎn)，于超凈臺中緩慢加入3ml含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血漿、1%雙抗和1%FGS的DMEM培養(yǎng)液，勿使組織浮起，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及培養(yǎng)情況，并對培養(yǎng)的細(xì)胞按照成纖維細(xì)胞鑒定方法鑒定[16]。

1.2.3 制備藥物血漿將24只SD大鼠編號，按隨機數(shù)字表分為杞精明目湯組和生理鹽水對照組，每組12只。杞精明目湯組給予杞精明目湯灌胃，每次2ml/只，每日2次，連續(xù)5 d；生理鹽水對照組給予生理鹽水灌胃，每次2m l/只，每日2次，連續(xù)5 d。于最后一次灌胃2 h后（灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥鈉，1.5m l/kg腹腔麻醉后，消毒，無菌操作下打開腹腔，腹腔動脈采血，靜置2 h，2000 r/min離心25min，無菌操作下分離出血漿，56℃水浴滅活30min，0.22μm過濾器過濾后-20℃下保存?zhèn)溆?。臨用前用含1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液配制成5%、10%、20%的含藥或無藥血漿。

1.2.4 杞精明目湯藥物血漿刺激實驗選擇3～6代80%融合的對數(shù)生長期CCh成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無血漿培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入無藥或含藥血漿終濃度分別為5%、 10%、20%的細(xì)胞全培養(yǎng)基，同時設(shè)PBS陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)至4 h分別提取各組的RNA用于real time PCR檢測，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至24 h提取各組的蛋白質(zhì)，用于Western blot實驗。

1.2.5 real time PCR測結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的表達采用Trizol法提取貼壁成纖維細(xì)胞mRNA，進行real time PCR檢測。以oligd（T）18為引物，mRNA模板1μg，合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR按20μl反應(yīng)體系進行：10×PCR緩沖液10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，熒光探針1μl，cDNA1μl，PCR級ddH2O 6μl。樣品和內(nèi)參均設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)無mRNA（空白）對照組和基因組（無逆轉(zhuǎn)錄酶），引物探針序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃1min，95℃30 s，60℃30 s，共40個循環(huán)，ABI7300全自動熒光定量PCR儀進行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為CT值；目的基因相對表達水平的計算采用樣品各自內(nèi)源控制物GAPDH的表達量來標(biāo)準(zhǔn)化加入的初始RNA量，即每個樣品靶基因的相對表達水平△CT值=靶基因CT值-GAPDH的CT值；通過比較不同組的△△CT值=△CT1-△CT2，計算2-△△CT值，間接反映各組模板的起始拷貝數(shù)之間的倍數(shù)關(guān)系（real time PCR實驗過程中所用到的耗材均用DEPC水滅活RNA酶）。

表1 目的基因引物序列及產(chǎn)物長度目的基因

1.2.6 Western Blot法檢測結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的表達RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度，并調(diào)整各組蛋白濃度至同一水平，蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：蛋白上樣量取50μg，上層膠5%，下層膠10%，上層膠電壓80 V，下層膠電壓100 V，垂直電泳1.5 h，半干式轉(zhuǎn)膜1 h，電壓15 V，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG/HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗分別室溫孵育對應(yīng)的一抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)儀拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J分析軟件對條帶進行半定量分析，以TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白灰度值進行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。本研究檢測指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢驗接近正態(tài)分布，以x軃±s進行統(tǒng)計描述，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗方差齊，各組目的基因、目的蛋白的差異總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組CCh結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相對表達量（軃±s）

表2 各組CCh結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相對表達量（軃±s）

注：組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。與對照組比較，①P<0.05；與20%含藥血漿比較，②P<0.05；與10%含藥血漿比較，③P<0.05 CCh：結(jié)膜松弛癥TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶1 MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

組別樣本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH對照組20%含藥血漿組10%含藥血漿組5%含藥血漿組20%無藥血漿組10%無藥血漿組5%無藥血漿組1.03±0.07 0.47±0.11①0.70±0.17①②0.75±0.12①②③0.97±0.14 0.93±0.12 0.89±0.22 F值P值6 6 6 6 6 6 6 1.07±0.11 1.70±0.20①1.53±0.24①0.97±0.14 1.02±0.10 0.99±0.13 1.03±0.11 1.02±0.12 1.17±0.17 1.07±0.25 0.90±0.25 1.10±0.13 1.00±0.20 0.91±0.14 1.03±0.07 0.40±0.04①0.50±0.06①0.80±0.12①②③1.12±0.14 0.98±0.09 1.01±0.15 22.176＜0.001 1.669 0.158 43.879＜0.001 5.820＜0.001

圖1 Western Blot法檢測各組CCh結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表達的電泳圖TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶1 MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2 結(jié)果

2.1 杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響

20%和10%的含藥血漿均可有效上調(diào)CCh成纖維細(xì)胞TSG-6mRNA的表達，且作用接近（P＞0.05），而5%濃度的含藥血漿對TSG-6 mRNA的表達無明顯上調(diào)作用；三種濃度的杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細(xì)胞PTX3 mRNA的表達無明顯影響；三種濃度的杞精明目湯含藥血漿均可明顯抑制體外培養(yǎng)的CCh成纖維細(xì)胞MMP-1 mRNA的表達，其中20%和10%濃度抑制作用較強，數(shù)值結(jié)果亦無明顯差異（P＞0.05）；20%、10%、5%濃度的藥物血漿均可有效抑制MMP-3mRNA的表達，其中20%的抑制作用最顯著，其次為10%（表2）。

2.2 杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響

不同濃度含藥血漿對CCh成纖維細(xì)胞各蛋白指標(biāo)表達的影響與前述對mRNA的影響大致相同。20%和10%的含藥血漿可有效上調(diào)CCh成纖維細(xì)胞TSG-6蛋白的表達。三種濃度的含藥血漿均可明顯抑制MMP-1蛋白、MMP-3蛋白的表達，對MMP-1蛋白，20%濃度抑制作用最明顯，10%與5%濃度的抑制作用無明顯差別；對MMP-3蛋白，20%作用最顯著，其次為10%。杞精明目湯含藥血漿對PTX3蛋白的表達無明顯影響（圖1，表3）。

表3 各組CCh結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相對表達量（軃±s）

表3 各組CCh結(jié)膜成纖維細(xì)胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相對表達量（軃±s）

注：組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。與對照組比較，①P<0.05；與20%含藥血漿比較，②P<0.05；與10%含藥血漿比較，③P<0.05 CCh：結(jié)膜松弛癥TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶1 MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

組別樣本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH對照組20%含藥血漿組10%含藥血漿組5%含藥血漿組20%無藥血漿組10%無藥血漿組5%無藥血漿組0.95±0.03 0.25±0.02①0.42±0.01①②0.62±0.05①②③0.91±0.03 0.92±0.04 0.96±0.08 F值P值6 6 6 6 6 6 6 0.877±0.07 1.13±0.09①1.04±0.11①0.93±0.05 0.94±0.04 0.93±0.11 0.89±0.10 1.11±0.05 1.11±0.14 1.08±0.12 1.07±0.16 1.06±0.10 1.09±0.03 1.04±0.11 0.99±0.05 0.10±0.01①0.42±0.10①②0.45±0.02①②0.96±0.11 1.00±0.05 0.96±0.03 6.784 0.003 0.276 0.945 191.236＜0.001 270.868＜0.001

3 討論

西醫(yī)對CCh的治療主要采取局部人工淚液滴眼和手術(shù)切除。人工淚液只能暫時緩解癥狀，且易反復(fù)；手術(shù)切除病變組織創(chuàng)傷大，患者不易接受。本研究著眼于中醫(yī)，在既往研究的基礎(chǔ)上，為杞精明目湯治療CCh提供理論依據(jù)。CCh可歸屬于中醫(yī)“白澀癥”范疇，臨床主要表現(xiàn)為眼內(nèi)干澀不爽，雙目頻眨，羞明畏光，白睛隱隱淡紅，久視后則諸癥加重，伴口燥咽干，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸軟，五心煩熱，夜寐不安，潮熱盜汗，舌紅少苔，脈沉細(xì)。病機多為肝腎陰虛，擬方精杞明目湯補腎養(yǎng)陰生津治療。方中枸杞子滋補肝腎，益精明目，黃精健脾益腎，補氣養(yǎng)陰，麥冬養(yǎng)陰生津，共同為君藥，滋補肝腎，養(yǎng)陰生津；脾胃為后天之本，茯苓、炙甘草健脾益氣，以助氣血生化之源；陰虛生熱，旱蓮草滋補肝腎，涼血止血，與茯苓共為臣藥；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛，引藥以上行頭目。全方共奏滋補肝腎，培補先天之精血，健脾益氣，以助氣血生化之源[15]。

本研究結(jié)果表明不同濃度的杞精明目湯藥物血漿對TSG-6和MMP-1、MMP-3基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達均有調(diào)控作用。其中20%和10%濃度的含藥血漿具有上調(diào)CCh成纖維細(xì)胞表達TSG-6的作用，而5%的含藥血漿對其影響作用不明顯；20%和10%的含藥血漿對MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用最顯著，其次是5%的含藥血漿；20%的含藥血漿對MMP-1蛋白表達的抑制作用最顯著，而10%和5%濃度對MMP-1蛋白表達的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義；三種濃度的含藥血漿對MMP-3均有抑制作用，最顯著的是20%含藥血漿，其次為10%；三種濃度的含藥血漿對CCh成纖維細(xì)胞PTX3的表達均無明顯調(diào)控作用。與前期基礎(chǔ)研究證實杞精明目湯藥物血漿可以有效抑制MMPs表達，同時能上調(diào)TIMPs的表達，促進MMPs和TIMPs之間平衡恢復(fù)[14]的結(jié)果一致。

松弛結(jié)膜堆積在瞼緣內(nèi)外眥部之間，不僅引起眼表淚液動力學(xué)異常，還可導(dǎo)致淚液中炎癥相關(guān)蛋白[白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、TNF-α、IL-6和α1酸性糖蛋白（α1-acid glycoprotein, A1AG）、鈣結(jié)合蛋白S100-A4、S100-A8等][17-18]凋亡，凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白[19]以及降解酶（MMP-9）[8]等表達亦明顯增加。研究表明炎性細(xì)胞因子（TNF-α或IL-1β）可明顯上調(diào)結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞MMPs及TSG-6、PTX3的表達[11-13]，同時siRNA干擾下調(diào)結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞TSG-6或PTX3基因的表達后，MMP-1、MMP-3的表達及細(xì)胞凋亡均明顯增多[12-13]。本研究結(jié)果顯示杞精明目湯藥物血漿能夠上調(diào)CCh成纖維細(xì)胞表達TSG-6，同時抑制MMPs的表達，提示杞精明目湯藥物血漿或能局限炎癥反應(yīng)作用，恢復(fù)局部炎性反應(yīng)蛋白及抗炎蛋白之間的平衡作用；而杞精明目湯藥物血漿對PTX3的表達影響不明顯，推測原因為TSG-6和PTX3在CCh發(fā)病機制中所發(fā)揮的作用不一致，PTX3的作用可能不在于炎癥保護方面，或與CCh細(xì)胞凋亡有關(guān)；這些推論還需進一步研究證實。

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Effects of Qijing M ingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctivochalasis

KE Meiqing,ZHANG Xingru,XIANG Minhong,et al.
Putuo Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai200062,China

OBJECTIVE To investigate the effects ofQijing Mingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctival fibroblastsof conjunctivochalasis(CCh).METHODS Differentconcentration(5%,10%,20%) ofdrug serum or drug free serum were prepared.Conjunctival fibroblastsofCCh were cultured with different concentration of drug serum or drug free serum for 4 or 24 hours before being harvested for total RNAs or proteins,respectively.The expressing levelsofmRNA and proteinsof TSG-6,PTX3,MMP-1 and MMP-3were detected by quantitative real time PCR(real time PCR)and western blot assay.RESULTS The 20%and 10%concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction effectively increased the expression of TSG-6 mRNA and protein,and their effectswere statistically similar(P>0.05);while the concentration of5%medicated serum had no significanteffecton theexpression of TSG-6mRNA and protein.The concentration of20%,10%and 5%medicated serum had no significanteffecton the expression of PTX3mRNA and protein.Three concentrations of drug serum all significantly reduced the expression ofMMP-1mRNA and protein.The inhibition effects of 20%and 10%medicated serum on MMP-1 mRNA were obvious,but of no significant difference (P<0.05),and both greater than it of 5%;Themost dramatic inhibition effect ofmedicated serum on MMP-1 protein was from 20%medicated serum,and there was no significant difference between effects of 10%and 5%concentration(P> 0.05).All three different concentrations of drug serum signifi-cantly reduced the expression of MMP-3 mRNA and protein.Themost obvious inhibitory effect of drug serum on MMP-3mRNA and protein was from 20%,the second effective concentration was 10%.CONCLUSIONS The 20% and 10%drug serum containing QijingMingmu decoction could up-regulate the expression of TSG-6 in fibroblasts of conjunctivochalasis.The three concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction had no significant effecton PTX3 but they could effectively inhibit theexpression ofMMP-1 and MMP-3.

conjunctivochalasis;Qijing Mingmu decoction;tumor necrosis factor alpha stimulated gene 6; pentraxin3

R777.3

A

1002-4379（2017）02-0087-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.005

上海市普陀區(qū)高層次人才科研創(chuàng)新資助項目（2014-A-22）；上海市醫(yī)學(xué)重點?？疲╖K2015A20）

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科，上海200062

張興儒，E-mail：zhangxingru928@163.com