掌葉半夏凝集素蛋白刺激巨噬細胞的致炎作用研究

毛善虎+郁紅禮+吳皓+王衛(wèi)+李曉楠

[摘要] 為探索掌葉半夏凝集素蛋白（PPL）刺激巨噬細胞誘導(dǎo)炎癥的作用與炎癥小體NLRP3的相關(guān)性。采用凝膠色譜純化掌葉半夏凝集素蛋白并采用SDS-PAGE凝膠電泳分析其純度；采用ELISA法以IL-1β為指標考察PPL刺激巨噬細胞釋放炎癥因子的影響；采用熒光探針DCFH-DA熒光酶標儀檢測PPL刺激巨噬細胞后活性氧ROS的水平變化；以ROS抑制劑NAC（N-乙酰半胱氨酸）預(yù)處理巨噬細胞，考察PPL刺激ROS的過量生成與炎癥因子IL-1β大量釋放的相關(guān)性；采用Western Blot方法檢測PPL對炎癥小體生成相關(guān)的Caspase-1 p20，NLRP3，TXNIP，ASC等蛋白的表達水平變化。結(jié)果顯示分離純化的PPL達到電泳純；PPL刺激巨噬細胞后引起ROS過量釋放，引起強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，胞內(nèi)炎癥因子IL-1β含量顯著升高；NAC可抑制PPL導(dǎo)致的ROS過量生成，且IL-1β釋放也顯著降低。同時PPL可誘導(dǎo)胞內(nèi)Caspase-1 p20，NLRP3，ASC蛋白表達升高，TXNIP表達顯著降低。研究結(jié)果表明，PPL刺激巨噬細胞可導(dǎo)致強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時能夠激活炎癥小體NLRP3，導(dǎo)致IL-1β大量生成釋放，即PPL能夠通過ROS-TXNIP-NLRP3-IL-1β信號通路促進IL-1β的成熟和分泌，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 掌葉半夏；凝集素；炎癥；ROS；NLRP3；IL-1β；NAC

[Abstract] To investigate the mechanism of lectin from Pinellia pedatisecta（PPL） on macrophage-induced inflammation and its association with inflammatory corpuscles NLRP3. Lectin from P. pedatisecta was isolated and purified by gel chromatography， and its purity was analyzed by using SDS-PAGE gel electrophoresis. ELISA was used to investigate the effect of PPL on inflammatory cytokines released by macrophages， with IL-1β as indicators；and fluorescence probe DCFH-DA fluorometer was used to determine changes in active oxygen ROS of macrophages after application of lectin from P. pedatisecta.RAW264.7 cells were pre-treated with ROS inhibitor N-acetylcysteine （NAC） to investigate the effect on ROS and the release of inflammatory factor IL-1β from macrophages to research the relationship between them. The protein levels of NLRP3， Caspase-1 p20， ASC and TXNIP were determined by Western blot.The results showed that isolated and purified PPL could reach electrophoretic purity；PPL stimulated macrophages and induced the excessive release of ROS， leading to strong oxidative stress reaction， and the levels of intracellular inflammatory factorsIL-1β were significantly increased. NAC could inhibit PPL-induced ROS excessive production and significantly reduce the release of IL-1β. In addition， PPL could induce the increase in protein expression levels of Caspase-1 p20， NLRP3 and ASC， and significantly reduce TXNIP expression. The results showed that PPL could cause a strong oxidative stress response by stimulating macrophages， activate inflammatory corpuscles NLRP3， and result in large amount of IL-1β release. That is， PPL could lead to inflammatory cascade reaction by promoting the maturation and secretion of IL-1β through ROS-TXNIP-NLRP3-IL-1β signaling pathway.

[Key words] Pinellia pedatisecta；lectin；inflammation；ROS；NLRP3；IL-1β；NAC

掌葉半夏為天南星科植物掌葉半夏Pinellia pedatisecta Schott.的干燥塊莖[1]，為有毒中藥，對口腔、咽喉等具有強烈的刺激性，甚者可致人死亡[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凝集素蛋白為其致炎的主要成分[3]，且其誘導(dǎo)炎癥的作用與巨噬細胞介導(dǎo)密切相關(guān)[4]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，天南星科凝集素蛋白能夠刺激巨噬細胞誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS（reactive oxygen species）大量生成與IL-1β（interleukin-1β）過量釋放[5]。文獻研究發(fā)現(xiàn)ROS是調(diào)控 NLRP3 （NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3）炎性小體活化的關(guān)鍵信號分子[6]。NLRP3的活化可促進白介素1β的剪切成熟，IL-1β進一步與細胞受體結(jié)合，促進炎癥發(fā)生發(fā)展[7]。故PPL促進ROS的水平變化，可能進一步激活炎癥小體NLRP3，活化炎癥因子IL-1β，從而誘導(dǎo)強烈的炎癥刺激。本研究在細胞分子水平對天南星科有毒中藥掌葉半夏的致炎作用與ROS水平及炎性小體活化相關(guān)性進行深入研究，探索其產(chǎn)生刺激性炎癥毒性作用的機制，為天南星科有毒中藥炮制方法的改進與創(chuàng)新提供理論支持。

1 材料

1.1 藥材

掌葉半夏鮮品藥材，購自河南省禹州市，經(jīng)江蘇省食品藥品檢驗所胡浩彬主任藥師鑒定為天南星科植物掌葉半夏P. pedatisecta的新鮮塊莖，冷藏備用。

1.2 細胞株

RAW264.7細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.3 試劑

乙醇（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硫酸銨（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；填料：Phenyl Sepharose^TMHigh Performance、Q Sepharose^TMHigh Performance（美國GE公司）；胎牛血清（美國WISENT 公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液、Phosphate Buffered Saline（PBS）（美國Hyclone公司）；胰蛋白酶（美國Promega公司）；LPS（美國SIGMA公司）；活性氧ROS檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司）；IL-1β ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（碧云天生物技術(shù)研究所）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5x）（碧云天生物技術(shù)研究所）；NLRP3（武漢BOSTER公司）、Caspase-1 p20（美國SANTA公司）、ASC（美國CST公司）、TXNIP（美國CST公司）、GAPDH、Goat Anti-Rabbit lgG（H+L）HRP、Goat Anti-Mouse lgG（H+L）HRP（南京翼飛雪生物科技有限公司）、TEMED（美國Biosharp公司）；BlueRAYPrestained Protein Ladder 10-170kD（美國Thermo公司）；Immobilon-P Transfer Membranes，Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（美國Millipore公司）；Tris-HCl，Tween-20（南京翼飛雪生物科技有限公司），其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；LDZ-2（Y）低速離心機（北京京立有限公司）；AKTA Purifier 900D（瑞典GE公司）；Labconco冷凍干燥儀（美國Labconco公司）；LEICA MPS 60 DM顯微鏡系統(tǒng)（德國萊卡公司）；高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；CO₂細胞培養(yǎng)箱（德國Memmer公司）；倒置熒光電子顯微鏡（日本尼康公司）；熒光酶標儀（美國Bio-tek公司）；垂直凝膠電泳儀、濕轉(zhuǎn)裝置、凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 PPL的提取純化及SDS-PAGE分析

2.1.1 PPL的提取純化 取鮮品掌葉半夏適量，去皮切碎后勻漿；離心（8 000 r·min^-1，30 min）后取上清液，計算體積，緩慢加飽和硫酸銨，磁力攪拌，至硫酸銨飽和度為45%；再離心（8 000 r·min^-1，15 min），取沉淀，得到PPL粗提產(chǎn)物；加入0.6 mol·L^-1的硫酸銨溶液至完全溶解離心取上清，重復(fù)3～4次。疏水色譜（流速2 mL·min^-1，每次上樣量5～10 mL，洗脫劑：60 min內(nèi)0.6～0 mol·L^-1的硫酸銨溶液）后收集主峰；再經(jīng)離子交換色譜（洗脫劑：60 min內(nèi)0～1 mol·L^-1的氯化鈉溶液，流速為2 mL·min^-1）后收集主峰。透析后凍干，即得純化的PPL。

2.1.2 PPL的電泳分析 使用15%的凝膠配方配制SDS-PAGE凝膠。上樣時蛋白Marker上樣8 μL，PPL上樣量為30 μg，根據(jù)BCA測定濃度調(diào)整上樣體積；恒壓100 V至Marker條帶基本分離為止。

2.2 PPL對巨噬細胞ROS生成的影響

RAW264.7細胞以1×10⁴個/mL的密度接種于48孔培養(yǎng)板中，PPL用PBS配成溶液，ROS熒光探針使用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋3 000倍。細胞分為6組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，其中4組分別給予相同體積不同濃度的PPL溶液（使其終濃度為6.25，12.5，25，50 mg·L^-1），1組給予LPS 溶液（質(zhì)量濃度為5 mg·L^-1）作為陽性對照組組，另1組給予相同體積的PBS緩沖液作為空白組。輕輕晃動混勻后于37 ℃，5%CO₂環(huán)境中孵育1 h，棄上清；加入ROS熒光探針孵育30 min，100放大倍數(shù)下觀察ROS的生成情況并拍攝照片。隨機使用熒光酶標儀（激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm）定量檢測探針發(fā)光量，并扣除空白孔吸收本底值。

2.3 PPL對巨噬細胞IL-1β釋放的影響

巨噬細胞RAW264.7以1×10⁶個/mL的密度接種于48孔培養(yǎng)板中，分組、給藥同2.2項。收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒操作方法對培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β的水平進行檢測。

2.4 PPL刺激巨噬細胞后胞內(nèi)ROS水平與IL-1β釋放的相關(guān)性研究

2.4.1 NAC對PPL刺激巨噬細胞后細胞內(nèi)ROS水平的影響 細胞培養(yǎng)、處理及分組同2.2項。預(yù)先用不同濃度（濃度分別為0.1，0.5，2.5，12.5 mmol·L^-1）的ROS清除劑NAC預(yù)處理0.5 h后，每組加入相同體積相同濃度的PPL（50 mg·L^-1），其余操作同2.2項。

2.4.2 NAC對PPL刺激巨噬細胞后細胞內(nèi)IL-1β釋放的影響 細胞培養(yǎng)、處理及分組同2.3項。預(yù)先用不同濃度（濃度分別為0.1，0.5，2.5，12.5 mmol·L^-1）的ROS清除劑NAC預(yù)處理0.5 h后，每組加入相同體積相同濃度的PPL（50 mg·L^-1），其余操作同2.3項。

2.5 Western blot 法測定PPL刺激后巨噬細胞內(nèi)Caspase-1 p20，NLRP3，ASC，TXNIP蛋白水平表達變化

2.5.1 分組 分組同2.2項。

2.5.2 提取細胞總蛋白 PPL刺激巨噬細胞1 h后，棄上清，PBS溶液清洗2次，刮下細胞，1 200 r·min^-1離心5～6 min，加入相同體積裂解液（RIPA-PMSF 100∶1），吹打均勻，4 ℃冰上振蕩1 h，16 000×g離心10 min以上，取上清液即得。經(jīng)BCA蛋白含量測定，調(diào)節(jié)上樣體積保證各組上樣量一致。

2.5.3 蛋白樣品的制備 取40 μL總蛋白，加入10 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），100 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.4 電泳 同2.2項下操作，樣品按各自上樣量分別上樣。

2.5.5 轉(zhuǎn)膜與免疫雜交 轉(zhuǎn)膜：采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（恒壓100 V，60 min）。封閉：5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h。免疫雜交：在適當?shù)奈恢脤VDF膜剪開，將目標蛋白和內(nèi)參GAPDH的分開，并分別進行免疫雜交。孵一抗：用5%BSA溶液對所需抗體進行稀釋，將一抗、內(nèi)參GAPDH一抗以及羊抗兔二抗分別稀釋成1 000，1 500，7 500倍；含有目標蛋白的PVDF膜分別加入目標蛋白一抗和內(nèi)參GAPDH一抗，4 ℃冰箱孵育過夜；PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10 min。孵二抗：分別加入二抗，置于搖床，室溫孵育2 h。PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10 min。

2.5.6 程序曝光并計算灰度值 將曝光顯色劑按比例配制，搖勻備用。將PVDF膜平鋪于潔凈皿中，加入曝光液采用凝膠成像系統(tǒng)進行程序曝光。采用Quality one軟件對曝光條帶進行分析，扣除背景，測定灰度值，并計算目的蛋白/內(nèi)參的比值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件 SPSS 16.0 進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 PPL的定量及鑒定

PPL經(jīng)BCA試劑盒檢測，蛋白純度為75.61%；再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測，PPL達到電泳純，實驗結(jié)果見圖1。

3.2 PPL對巨噬細胞ROS釋放的影響

PPL對巨噬細胞ROS釋放的影響見圖2。結(jié)果顯示，PPL（質(zhì)量濃度為6.25，12.5，25，50 mg·L^-1）刺激巨噬細胞1 h后，與空白組比較，ROS的表達明顯增強（P<0.01），且呈一定的劑量依賴性；結(jié)果表明，PPL刺激巨噬細胞可以引起強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放大量的ROS。

3.3 PPL對巨噬細胞釋放IL-1β的影響

PPL對巨噬細胞釋放IL-1β的影響見圖3。結(jié)果顯示不同濃度的PPL（質(zhì)量濃度為6.25，12.5，25，50 mg·L^-1）刺激巨噬細胞1 h后，與空白組相比，IL-1β的含量顯著增加（P<0.01），并呈劑量依賴性。

3.4 NAC對PPL刺激巨噬細胞后ROS生成與IL-1β釋放水平的影響

3.4.1 NAC預(yù)處理后PPL刺激巨噬細胞引起胞內(nèi)ROS水平的變化 不同濃度的NAC（濃度為0.1，0.5，2.5，12.5 mmol·L^-1）對PPL刺激巨噬細胞后細胞內(nèi)ROS的影響見圖4。結(jié)果顯示，NAC中高劑量組能夠顯著抑制PPL刺激巨噬細胞引起的細胞內(nèi)活性氧ROS的大量生成（P<0.01）。

3.4.2 NAC預(yù)處理后PPL刺激巨噬細胞引起胞內(nèi)IL-1β水平的變化 NAC預(yù)處理后PPL刺激巨噬細胞引起胞內(nèi)IL-1β水平的變化見圖5。結(jié)果顯示，NAC中高劑量組能夠顯著抑制PPL刺激巨噬細胞引起的炎癥因子IL-1β的大量釋放（P<0.01）。

3.5 PPL刺激巨噬細胞胞內(nèi)NLRP3，Caspase-1 p20，ASC，TXNIP等蛋白水平表達的變化

PPL（質(zhì)量濃度為6.25，12.5，25，50 mg·L^-1）刺激巨噬細胞后，對胞內(nèi)NLRP3，Caspase-1 p20，ASC，TXNIP等蛋白水平表達的影響見圖6。不同濃度的PPL刺激巨噬細胞1 h后，與空白組相比，Caspase-1 p20，NLRP3及表達上升，ASC表達升高，均呈劑量依賴性；TXNIP表達下降，中高劑量有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，PPL刺激巨噬細胞1 h后，細胞內(nèi)Caspase-1被活化，表明NLRP3炎性小體被激活。

4 討論

掌葉半夏為臨床有毒中藥，誤服可致人體強烈的炎癥毒性反應(yīng)，故臨床多用其炮制品。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，PPL刺激巨噬細胞引起ROS的大量生成與IL-1β的大量釋放。文獻研究發(fā)現(xiàn)二者與NLRP3存在相關(guān)性。NLRP3是一種存在于細胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，依賴 Caspase-1的分子平臺促進IL-1β的成熟和釋放，并引起炎癥反應(yīng)[8]。ROS是調(diào)控NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵信號。當ROS增加時，硫氧還蛋白（TRX）充當氧化物的清道夫，發(fā)生自身氧化，而硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（TXNIP）與氧化的TRX分離后結(jié)合至NLRP3 上，從而募集ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain）和胱天蛋白酶（caspase-1）前體完成炎性小體的組裝活化，促進caspase-1活化，進而促進炎癥因子白介素1β（Interleukin-1β）的剪切成熟[9-11]。IL-1β進一步與細胞IL-1受體結(jié)合，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進炎癥發(fā)生發(fā)展。

本文研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的PPL刺激巨噬細胞能夠引起巨噬細胞生成過量的ROS和釋放大量的IL-1β；不同濃度的ROS抑制劑NAC預(yù)處理巨噬細胞后，PPL刺激導(dǎo)致的ROS和IL-1β過量生成均顯著下降，表明NAC抑制PPL導(dǎo)致的ROS過量生成，進一步會抑制IL-1β的釋放，即PPL誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β大量釋放與ROS生成相關(guān)。研究同時發(fā)現(xiàn)，不同濃度的PPL刺激巨噬細胞后胞內(nèi)與炎癥小體相關(guān)的蛋白Caspase-1 p20，NLRP3，ASC蛋白表達升高、TXNIP表達顯著降低。NLRP3炎性小體相關(guān)的蛋白表達變化及IL-1β的釋放降低，表明PPL可激活炎癥小體，且ROS過量生成可能參與了PPL激活NLRP3炎癥小體的過程。

上述研究表明，掌葉半夏塊莖中毒針晶引起強烈的炎癥刺激，除了與其所含的針晶引起的物理損傷有關(guān)，還與其所含的凝集素蛋白激活ROS-TXNIP-NLRP3-IL-1β信號通路，促進IL-1β的成熟和分泌，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致強烈的炎癥刺激有關(guān)。

本論文的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了PPL致炎與NLRP3炎癥小體信號通路的相關(guān)性，進一步闡明了天南星科有毒中藥掌葉半夏引起炎癥毒性的機制，將為天南星科有毒中藥炮制方法的改進與創(chuàng)新提供一定的借鑒，為有毒中藥臨床安全使用提供依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]