錐型束CT評(píng)價(jià)茶多酚對(duì)放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道愈合的療效

羅敬中，黃柏隆，劉 奕，徐秋榮

龍門(mén)縣人民醫(yī)院1口腔科,2耳鼻喉科，廣東 惠州 516800;3河源市人民醫(yī)院口腔科，廣東 河源 517000

錐型束CT評(píng)價(jià)茶多酚對(duì)放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道愈合的療效

羅敬中1，黃柏隆2，劉 奕3，徐秋榮2

龍門(mén)縣人民醫(yī)院1口腔科,2耳鼻喉科，廣東 惠州 516800;3河源市人民醫(yī)院口腔科，廣東 河源 517000

目的通過(guò)錐型束CT及竇道造影評(píng)價(jià)茶多酚對(duì)放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道愈合的效果。方法收集放射性頜骨骨髓炎術(shù)后伴有口腔黏膜竇道的患者30例，隨機(jī)分2組，每組各15例。竇道分別每日予復(fù)方茶多酚含漱液（實(shí)驗(yàn)組）或生理鹽水（對(duì)照組）局部沖洗及含漱，每3周使用錐型束CT行竇道造影成像，計(jì)算竇道體積變化。MTT法檢測(cè)茶多酚對(duì)人永生化口腔黏膜上皮細(xì)胞系的增殖影響。結(jié)果治療12周后，實(shí)驗(yàn)組的竇道縮小情況優(yōu)于對(duì)照組（5.40±4.15 cm3vs8.12±5.47 cm3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.384，P=0.043）。CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)120 mg/L茶多酚的處理后，人永生化口腔黏膜上皮細(xì)胞系的增殖速率高于無(wú)處理的對(duì)照組（0.162±0.030vs0.075±0.017），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.783，P=0.017）。結(jié)論茶多酚可能通過(guò)促進(jìn)口腔黏膜上皮增殖，加快放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道的愈合。

茶多酚；放射性頜骨骨髓炎；竇道；上皮細(xì)胞；增殖

放射性頜骨骨髓炎，是頭頸部惡性腫瘤放療后常見(jiàn)的口腔并發(fā)癥之一[1]。頜骨在放射治療后，處于低氧、低血管結(jié)構(gòu)、低細(xì)胞活性的“三低”狀態(tài)，容易發(fā)生無(wú)菌性壞死，并繼發(fā)細(xì)菌感染，形成頜骨骨髓炎[2]。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)放射性疾病有一定的防護(hù)作用[3]，同時(shí)具有抗氧化、抗感染等藥理作用[4-5]。茶多酚的主要成分是兒茶素（黃烷-3-醇衍生物）[6]，對(duì)部分體細(xì)胞有促增殖作用，何權(quán)敏等[7]發(fā)現(xiàn)茶多酚可促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞的體外增殖，但目前尚無(wú)其對(duì)口腔黏膜上皮作用的相關(guān)研究。由此設(shè)想，茶多酚是否可以通過(guò)促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖，加快放射性頜骨骨髓炎術(shù)后黏膜竇道的愈合。

本研究分別以放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道患者及人永生化口腔黏膜上皮細(xì)胞系（NOK）為對(duì)象，通過(guò)比較竇道的體積變化及NOK細(xì)胞的增殖能力，探討茶多酚促進(jìn)放射性頜骨骨髓炎術(shù)后竇道愈合的效果，為放射性頜骨骨髓炎的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年1月～2016年6月于惠州市龍門(mén)縣醫(yī)院收治的放射性頜骨骨髓炎患者30例，采用1：1病例對(duì)照研究方法，通過(guò)隨機(jī)分配隱匿的方法（按順序編碼、不透光、密封的信封）分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。該研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)所有患者簽署知情同意書(shū)的前提下進(jìn)行。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）頭頸部腫瘤放療史；（2）根據(jù)臨床及影像表現(xiàn)，診斷為放射性頜骨骨髓炎，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Harris[8]提出的“射線照射的頜骨失去活性，暴露于原本覆蓋于其上的皮膚或黏膜下方，持續(xù)超過(guò)3個(gè)月且沒(méi)有愈合，局部無(wú)腫瘤形成”；（3）接受常規(guī)手術(shù)治療（包括病灶刮除、頜骨切除等術(shù)式）后，切口延期愈合并形成開(kāi)口于口腔的竇道，且無(wú)口內(nèi)外相通的瘺管形成。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）除外其他疾病造成的骨破壞，如腫瘤、雙膦酸鹽性頜骨壞死[9]等；（2）術(shù)后經(jīng)影像檢查正式殘余骨髓炎病灶或死骨；（3）懷孕或哺乳期婦女；（4）嚴(yán)重心血管疾病、肝腎功能不全者。

1.1.3 剔除標(biāo)準(zhǔn) （1）對(duì)本研究中使用的藥物過(guò)敏或有嚴(yán)重不良反應(yīng)而不適應(yīng)此臨床實(shí)驗(yàn)者；（2）不遵醫(yī)囑或治療中因各種原因未完成療程或治療不全者；（3）治療期間發(fā)生嚴(yán)重疾病，不能繼續(xù)進(jìn)行治療者；（4）療程未到1/2者，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，共納入30例病例，單盲隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組15例。其中對(duì)照組15例患者中有1例治療后9周于外院作進(jìn)一步診治，退出本研究；實(shí)驗(yàn)組15患者中有2例因個(gè)人原因中途中斷治療。上述3例治療時(shí)間均超過(guò)計(jì)劃的1/2，故計(jì)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果。對(duì)兩組患者的基本資料進(jìn)行均衡性比較，年齡、性別、放療劑量、發(fā)病部位、手術(shù)方式等項(xiàng)目的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。提示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的病例在上述項(xiàng)目的分布相對(duì)一致，無(wú)明顯組間差異。

1.2 治療方法

實(shí)驗(yàn)組患者隔日門(mén)診復(fù)診，予茶多酚含漱液沖洗未愈合的竇道，并囑每日含漱茶多酚含漱液2次，3 min/次。對(duì)照組使用生理鹽水沖洗病灶及含漱。每3周對(duì)竇口體積進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量方法如下：向竇道注入泛影葡胺，至造影劑充滿竇道，并予醫(yī)用水凝膠敷料封閉竇口，于錐型束CT掃描成像。錐型束CT選用Pax-Uni3D（Vatech, Korea），掃描條件為110 kV、2.0 mA，曝光時(shí)間為3.6 s，由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的影像科醫(yī)生嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家的使用說(shuō)明進(jìn)行拍攝。參考何錦泉等[10]的方法，成像后使用Ez3D plus軟件包（Vatech,Korea）按最大密度投影算法三維重建竇道，DICOM數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics 14.1軟件包，使用三維體積計(jì)算功能計(jì)算竇道體積。

1.3 茶多酚對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)影響

1.3.1 人口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) NOK細(xì)胞系購(gòu)自上海眾華生物科技有限公司，NOK細(xì)胞在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)于10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。

1.3.2 主要試劑及儀器 茶多酚（純度98%）購(gòu)自江西綠康天然產(chǎn)物有限公司；CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司；RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco；M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NOK細(xì)胞接種于96孔板，4×104/孔，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底后吸棄原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含茶多酚（120 mg/L）完全培養(yǎng)液，對(duì)照組加入不含茶多酚的完全培養(yǎng)液，每天取8孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h，測(cè)量450 nm處各孔吸光度(OD值)。繪制1～5 d的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS23.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Mann-Whitney非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較兩組病例基本資料的一致性，竇道體積的變化及NOK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。所有統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 患者基本資料

2 結(jié)果

2.1 竇道體積變化

基于錐型束CT的竇道造影可以重建出輪廓邊界清晰的圖像，同時(shí)可精確計(jì)算竇道體積（圖1）。經(jīng)過(guò)局部沖洗換藥及口腔護(hù)理后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組患者的竇道體積均具有不同程度的縮小，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2）。治療后12周，實(shí)驗(yàn)組竇道體積小于對(duì)照組（5.40±4.15 cm3vs8.12±5.47 cm3），實(shí)驗(yàn)組的療效顯著，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.063，P=0.033）。

2.2 NOK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

經(jīng)茶多酚培養(yǎng)后的NOK細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）與普通完全培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的NOK細(xì)胞（對(duì)照組）進(jìn)行比較，培養(yǎng)5 d后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞吸光度高于對(duì)照組（0.162±0.030vs0.075±0.017），即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速率較高（圖3）。兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.783，P=0.017），提示茶多酚對(duì)NOK細(xì)胞有促生長(zhǎng)作用。

圖1 竇道造影三維重建圖像

圖2 竇道體積變化曲線

圖3 NOK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討論

放射性頜骨骨髓炎主要通過(guò)外科手術(shù)徹底去除死骨，并去除病變的軟組織，達(dá)到根治的目的[11]。但放射區(qū)域組織的纖維萎縮或纖維化，致使其增殖、抗感染及代謝能力低于正常組織，因而患者術(shù)后可能因出現(xiàn)創(chuàng)口愈合不良而繼發(fā)形成竇道[12]。研究竇道的定位及體積測(cè)量，對(duì)于后續(xù)治療有重要的參考意義?？谇活M面部的竇道定位及體積測(cè)量，可通過(guò)竇道造影，即向竇口注入造影劑（如碘胺醇、碘化油、泛影葡胺等）后進(jìn)行X線成像而實(shí)現(xiàn)，常用于鰓裂囊腫、甲狀舌管囊腫的術(shù)前檢查[13-14]。本研究參考了上述方法，選用水溶性離子型單體碘造影劑泛影葡胺。與油性造影劑相比，水溶性的泛影葡胺流動(dòng)性較強(qiáng)，造影后通過(guò)常規(guī)竇道沖洗即可去除。此外，有別于開(kāi)口在皮膚且竇口狹小的竇道造影，納入本研究的病例，竇口均開(kāi)口于口腔內(nèi)且竇口寬大，造影劑容易外溢，因此選用了貼合性及生物相容性良好的藻酸鹽水凝膠敷料[15]封閉竇口。

竇道的治療可分為手術(shù)治療及保守治療，伴有較大組織缺損的竇道一般采用轉(zhuǎn)移組織瓣手術(shù)修復(fù)[16]。而體積較小的瘺道則以局部沖洗換藥為主，通過(guò)保持局部衛(wèi)生，減少繼發(fā)感染，促進(jìn)上皮及肉芽生長(zhǎng)覆蓋，最終實(shí)現(xiàn)竇道的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)使用茶多酚含漱液進(jìn)行竇道沖洗換藥，輔助治療的效果理想，竇道的體積較對(duì)照組明顯縮小，有利于加快創(chuàng)口愈合。希望通過(guò)細(xì)胞體外培養(yǎng)，初步了解茶多酚促進(jìn)竇道愈合的作用機(jī)理。體外培養(yǎng)條件下，茶多酚對(duì)于上皮來(lái)源的細(xì)胞增殖作用不一。茶多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[17-18]，而對(duì)正常的上皮細(xì)胞則有促增殖作用。Hsu等[18]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)條件下，茶多酚可促進(jìn)角化上皮細(xì)胞的增殖及分化。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)人永生化口腔黏膜的上皮細(xì)胞在120 mg/L的茶多酚誘導(dǎo)下，具有較強(qiáng)的增殖能力。提示茶多酚可能通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，加快竇道愈合的速度。

此外，暴露于口腔的竇道常伴發(fā)細(xì)菌感染，也可能影響創(chuàng)口的愈合。放射性頜骨骨髓炎中常見(jiàn)的致病菌為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌[19]。錢(qián)麗紅等[20]驗(yàn)證了茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌作用。提示口腔局部使用茶多酚含漱液，可能對(duì)竇道中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌有抑制作用，減少繼發(fā)感染，但這一猜想仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)基于錐型束CT的竇道造影技術(shù)對(duì)放射性頜骨骨髓炎患者的術(shù)后竇道進(jìn)行了定位及體積測(cè)量，并發(fā)現(xiàn)茶多酚可能通過(guò)促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖，加快竇道愈合。

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Effect of tea polyphenols on sinus healing in post-operative radioactive osteomyelitis of the jaws evaluated by cone beam CT

LUO JingZhong1, HUANG BaiLong2, LIU Yi3, XU Qiurong21Department of Stomatolog;2Department of ENT, People's Hospital of Longmen County, Huizhou 516800, China;3Department of Stomatology, People's Hospital of Heyuan, Heyuan 517000, China

ObjectiveTo evaluate the effect of tea polyphenols on sinus healing in post-operative radioactive osteomyelitis of jaws (ORN) by cone beam CT and contrast fistulography.MethodsThirty ORN cases with post-operative oral mucosa sinus were divided into 2 groups randomly. In experimental group, sinus was rinsed and gargled with tea polyphenols solution in daily. In control group, sinus was treated with normal saline. Sinus radiography was taken by cone beam CT every 3 weeks with calculation of sinus volume in 2 groups. Effect of tea polyphenols on proliferation of human immortalized oral mucosal epithelial cell line was detected by MTT.ResultsThe sinus volume in experimental group was smaller than that in control group after 12 weeks of treatment (P＜0.05). With treatment of 120 mg/L tea polyphenols, growth rate of NOK in experimental group was higher than that of control group (P＜0.05).ConclusionTea polyphenols can accelerate the healing of post-operative sinus in ORN through stimulating the proliferation of epithelium cell.

tea polyphenols; radioactive osteomyelitis of jaws; sinus; epithelium cells; proliferation

2017-01-08

惠州市科技計(jì)劃（2016Y260）

羅敬中，主治醫(yī)師，E-mail：619367565@qq.com