青少年起病的成人型糖尿病相關(guān)基因新突變位點的發(fā)現(xiàn)

李怡心，李玉秀，常永生*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室， 北京 100005； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科 衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室， 北京 100730)

于20世紀60年代首次發(fā)現(xiàn)，青少年起病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)最初用于描述兒童或青年的持續(xù)性、無癥狀的高血糖[1- 2]?，F(xiàn)在，MODY主要指由常染色體顯性基因突變所引起的遺傳性糖尿病[3]。MODY是單基因糖尿病中最常見的類型， 在歐洲，MODY約占所有

糖尿病病例的1%～2%[1，4]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13個基因(HNF4α、GCK、HNF1α、PDX1、HNF1β、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、ABCC8和KCNJ11)的突變與MODY發(fā)病有關(guān)[5- 7]。

由于臨床表現(xiàn)和發(fā)病年齡的相似，MODY經(jīng)常被誤診為1型或2型糖尿病。鑒于不同類型糖尿病的治療方式和預(yù)后均有所差異，且MODY具有明確的家族遺傳性，因此正確的診斷對于MODY患者及其親屬具有重要意義。本研究旨在通過全外顯子組測序篩查新的MODY相關(guān)基因或突變位點，為MODY的臨床診斷補充依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2016年4月至2016年8月在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的臨床疑診為MODY的患者8例，結(jié)合本研究的目的，對滿足以下條件的4例患者進行全外顯子組測序：1)糖尿病診斷年齡<25歲；2)家族成員中至少連續(xù)2代有糖尿病；3)自身抗體(IAA、ICA和GAD)陰性。所有進行全外顯子組測序的患者均在簽署知情同意書后登記病歷資料并留取血液標本，對于年齡小于18周歲的研究對象，同時獲得其監(jiān)護人的知情同意并簽署知情同意書。本研究獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 材料：血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)。GCK及HNF4α擴增序列引物(Invitrogen公司)。LA Taq DNA聚合酶、dNTPs(TaKaRa公司)。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(美基生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提?。禾崛』颊呖鼓獦吮镜幕蚪MDNA，NanoDrop2000超微量分光光度計測得濃度>50 mg/L，DNA總量>3 μg。

1.2.2 全外顯子組測序：所得DNA樣本送至諾禾致源公司進行全外顯子組測序，捕獲平臺Agilent SureSelcet Human All Exon V6，測序平臺HiSeq 4000 PE150，有效測序深度達到100×以上。

1.2.3 PCR法擴增突變位點所在外顯子：以基因組DNA為模板，在T100TMPCR儀上進行擴增反應(yīng)。條件為：95 ℃ 5 min、(95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)29個循環(huán)、72 ℃ 10 min。所得PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離并純化，純化產(chǎn)物濃度>50 mg/L。

1.2.4 Sanger測序驗證突變位點：對PCR回收純化產(chǎn)物進行測序，與已知序列對比，驗證全外顯子組測序結(jié)果(表1)。

表1 PCR的引物序列Table 1 The sequences of PCR primers

2 結(jié)果

2.1 測序患者的臨床指標

測序的4例患者來自4個不同的家族，2例男性2例女性，每例患者家族中患有糖尿病的人數(shù)為3～5人(圖1)。4例患者診斷為糖尿病時的平均年齡為(17.85±3.3)歲，進行本次測序時的平均年齡為(22.4±6.4)歲，平均BMI為(23.00±2.84) kg/m2，具體臨床指標(表2)。

2.2 新的突變位點

在患者01和患者02中均未檢測到MODY相關(guān)基因的已報道或未報道突變。

在患者03中檢測到了位于GCK基因10號外顯子上的新的突變位點c.1348G>T (p.Ala450Thr)(圖1)。該患者的父親也患有糖尿病，后續(xù)對其父親的基因組DNA進行測序驗證，結(jié)果顯示具有相同的突變位點(圖2)。

在患者04中檢測到了位于HNF4α基因7號外顯子上的新的突變位點c.758G>A (p.Arg253Gln)(圖1)。該患者的母親也患有糖尿病，后續(xù)對其母親的基因組DNA進行測序驗證，結(jié)果顯示具有相同的突變位點(圖3)。

3 討論

GCK和HNF4α突變所導(dǎo)致的MODY分別為MODY2和MODY1，是除了HNF1α突變所致的MODY(MODY3)外最常見的MODY亞型[8]。

A.pedigree of family 01; B.pedigree of family 02; C.pedigree of family 03; D.pedigree of family 04; show the patients with diabetes, show family members without diabetes; represent for male individuals, represent for female individuals; P01-P04 are the subjects we selected; number 1-7 represent for members from each family

圖1 4例測序患者的家族系譜圖Fig 1 Family trees of the four patients being sequenced

BMI.body mass index; FFA.free fatty acid; UA.uric acid; UAE.urinary albumin excretion; ND.non did.

The G>T mutation in exon 10 of GCK gene from family 03; the patients with GCK gene mutations show a high level of fasting blood glucose; A.the normal base G of this site; B.the novel c.1348G>T mutation in patient 03,the proband in family 03; C.the novel c.1348G>T mutation in patient 03’s father; patient 03 and patient 03’s father have the same mutation,but different peak height G/T ratio圖2 患者03及其父親中檢測到的新突變位點Fig 2 Novel mutation detected in patient 03 and her father

The G>A mutation in exon 7 of HNF4α gene from family 04; patients with HNF4α gene mutations have a low renal threshold and are sensitive to sulfonylureas; A.the normal base G of this site; B.the novel c.758G>A mutation in patient 04, the proband in family 04; C.the novel c.758G>A mutation in patient 04’s mother; patient 04 and patient 04’s mother have the same mutation, but different peak height G/A ratio; the peak height of base G is different between normal sample and mutation samples圖3 患者04及其母親中檢測到的新突變位點Fig 3 Novel mutation detected in patient 04 and his mother

GCK(glucokinase葡萄糖激酶)是葡萄糖磷酸化過程中的限速酶，且具有調(diào)節(jié)胰島素分泌的功能，由位于染色體7p13的GCK編碼，該基因的雜合突變可導(dǎo)致MODY2的發(fā)生。GCK主要在胰島β細胞中表達，也可見于肝細胞、神經(jīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞[8]。MODY2的臨床表現(xiàn)主要為無癥狀、非進行性、輕度的高血糖。MODY2患者通常不需要進行藥物治療，僅通過控制飲食和適量運動就可以控制血糖水平，且預(yù)后良好[9]。

HNF4α是一種細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，主要在肝臟中表達，也存在于胰腺和腎臟中。HNF4α發(fā)生突變會導(dǎo)致胰島β細胞功能障礙，從而導(dǎo)致高血糖的發(fā)生。MODY1較為少見，其臨床表現(xiàn)與MODY3相似，且對小劑量的磺脲類藥物治療敏感。有研究顯示，在無HNF1α突變的疑診MODY3患者中，有10%～29%具有HNF4α突變[10]。

準確的診斷MODY對于臨床醫(yī)生選擇治療方案及為患者親屬提供遺傳學(xué)咨詢具有重要意義。由于MODY的臨床表現(xiàn)與1型和2型糖尿病存在相似之處，且我國對MODY的研究起步相對較晚，尚未形成系統(tǒng)的診斷流程，因此大部分MODY患者被誤診為1型或2型糖尿病甚至未被明確診斷。基因測序有助于MODY的確診并明確具體的MODY亞型，從而使患者及其親屬能夠得到正確、及時的診斷和治療。

本研究發(fā)現(xiàn)的GCK和HNF4α的新的突變位點幫助診斷了兩位患者確為MODY患者，并據(jù)此對患者的相關(guān)親屬進行了測序，有助于其后續(xù)治療方案的調(diào)整，也為進一步研究MODY相關(guān)基因的功能及臨床上對于MODY的診斷提供了依據(jù)。

[1] Li Q, Cao X, Qiu HY,etal. A three-step programmed method for the identification of causative gene mutations of maturity onset diabetes of the young (MODY) [J]. Gene，2016，588:141- 148.

[2] Tattersall RB. Mild familial diabetes with dominant inheritance [J]. Q J Med，1974，43:339- 357.

[3] Murphy R, Ellard S, Hattersley AT. Clinical implications of a molecular genetic classification of monogenic beta-cell diabetes [J]. Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4:200- 213.

[4] Gardner DS, Tai ES. Clinical features and treatment of maturity onset diabetes of the young(MODY)[J]. Diabetes Metab Syndr Obes，2012，5:101- 108.

[5] Gao R, Liu Y, Gjesing AP,etal. Evaluation of a target region capture sequencing platform using monogenic diabetes as a study-model [J]. BMC Genet，2014，15:13.doi:10.1186/1471- 2156- 15- 13.

[6] Bonnefond A, Philippe J, Durand E，etal. Whole exome sequencing and high throughput genotyping identified KCNJ11 as the thirteenth MODY gene [J]. PLoS One，2012，7:e37423.doi:10.1371/journal.pone.0037423.

[7] Flannick J, Beer NL, Bick AG，etal. Assessing the phenotypic effects in the general population of rare variants in genes for a dominant mendelian form of diabetes [J]. Nat Genet，2013，45:1380- 1385.

[8] Almeida C, Silva SR, Garcia E,etal. A novel genetic mutation in a Portuguese family with GCK-MODY [J]. J Pediatr Endocrinol Metab，2014，27:129- 133.

[9] Shields BM, Hicks S, Shepherd MH,etal. Maturity-onset diabetes of the young (MODY): how many cases are we missing [J].Diabetologia，2010，53:2504- 2508.

[10] Pearson ER, Pruhova S, Tack CJ,etal. Molecular genetics and phenotypic characteristics of MODY caused by hepatocyte nuclear factor 4alpha mutations in a large European collection [J]. Diabetologia，2005，48:878- 885.

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牙周病和勃起功能障礙有關(guān)

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016年12月13日報道，根據(jù)一份現(xiàn)有研究，勃起功能障礙在罹患牙周病的男性中很常見。研究人員分析了2009至2014年發(fā)表的5項研究數(shù)據(jù)，包括一項隨機對照試驗，總計涵蓋213 000名20至80歲男性的資料。

在每項研究中發(fā)現(xiàn)，勃起功能障礙更普遍地出現(xiàn)在正在治療牙周病的患者中，特別是年齡小于40歲和大于59歲的男性。根據(jù)研究報告，罹患牙周病的男性有勃起功能障礙是沒有牙周病男性的2.28倍。

中國廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院趙志剛博士認為：“牙齦的慢性細菌感染或牙周炎是常見的，并且是成年人牙齒脫落的主要原因。而牙齦牙周的感染和發(fā)炎被認為與高風(fēng)險的心血管疾病、腦卒中和動脈硬化有關(guān)，而腦卒中和動脈硬化也與勃起功能障礙有關(guān)。對于罹患牙周病的勃起功能障礙患者，實際生物學(xué)機制仍然知之甚少。建議勃起功能障礙患者檢查牙齒可能太早，但是告知慢性牙周炎患者關(guān)于兩個疾病之間的相關(guān)性是有益的。由于慢性牙周病與幾種慢性疾病有關(guān)，建議每天進行牙間清潔以減少牙菌斑和牙齦炎炎性反應(yīng)。慢性牙周病的治療可以控制或治愈，并可以降低性功能勃起障礙的風(fēng)險。此外，臨床醫(yī)生應(yīng)該意識到牙周病在勃起功能障礙發(fā)展中的潛在作用?！比欢?，這項新的研究內(nèi)容，有其局限性。包括勃起功能障礙和慢性牙周炎是由類似的危險因素引起的，例如老化，吸煙、糖尿病和冠狀動脈疾病。以及，雖然其中一些研究有考慮到糖尿病，但大多數(shù)沒有說明吸煙或飲酒習(xí)慣，這也是影響口腔健康和性功能的因子。因此牙周病和勃起功能障礙之間的聯(lián)系還是有限的。

本研究刊登于InternationalJournalofImpotenceResearch。