漁用莢膜紅假單胞菌商品保存技術(shù)

李大列+黎建斌

摘 要：為優(yōu)化漁用莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata）商品保存技術(shù)，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室選育保存的高效莢膜紅假單胞菌（菌種NC01）進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，再采用正交試驗(yàn)方法，研究不同的保存溫度、菌液pH值、包裝桶規(guī)格、透光度、顏色對(duì)漁用莢膜紅假單胞菌商品保存期的影響，并采用單因素試驗(yàn)方法，研究在菌液中添加保護(hù)劑后的保存效果。結(jié)果顯示，在商品菌液中添加 0.5 g/L維生素C，調(diào)節(jié)菌液pH值7.0，采用5 L透光度2 500 lx的綠色塑料桶包裝，在溫度25 ℃下保存效果最好。應(yīng)用最適宜保存技術(shù)保存漁用莢膜紅假單胞菌商品兩個(gè)月，菌液的有效活菌數(shù)≥2.76×109個(gè)/mL，比普通保存技術(shù)提高了67.27%，兩者差異顯著（P<0.05），為漁用莢膜紅假單胞菌商品的保存提供了一種全新、有效的保存技術(shù)。

關(guān)鍵詞：漁用莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata）；商品；保存

光合細(xì)菌是在水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用的微生物菌種之一。它不僅能凈化水質(zhì)，而且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，可作為魚(yú)蝦的飼料添加劑，同時(shí)能促進(jìn)養(yǎng)殖品種的繁殖，提高魚(yú)苗、蝦等的成活率。由于漁用光合細(xì)菌不耐高溫，因此，采用成本低的工藝路線研制粉狀制劑較為困難。目前市場(chǎng)上銷售的漁用光合細(xì)菌多為液態(tài)產(chǎn)品，而液體產(chǎn)品都存在菌種保質(zhì)期較短，菌種在保存中漸漸死亡的問(wèn)題，這嚴(yán)重影響了漁用光合細(xì)菌商品的保存期與應(yīng)用效果。張李陽(yáng)等（2005）對(duì)幾種光合細(xì)菌保種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥法保存光合細(xì)菌最好，但成本較高。從綜合考慮，固體、半固體法最適合不同條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行光合細(xì)菌菌種保存[1]。張芳蕾等（2009）用正交實(shí)驗(yàn)方法探討菌劑保藏的光線、溫度及pH對(duì)液態(tài)濃縮制劑保藏期的影響，以及在菌劑中添加化學(xué)物質(zhì)后的保藏效果。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，光合細(xì)菌濃縮菌劑在pH值5.5、室溫及避光條件下保藏效果最好。而在菌劑中添加1%甘油、7%二甲亞砜和0.5～1.1 μg/mL紅霉素對(duì)延長(zhǎng)菌劑的保藏均較為有效，其中以添加1%甘油的保藏效果更好[2]。王家芳等（2011）以硫酸鋁鉀作絮凝劑，海藻糖作保護(hù)劑，陶瓷粉作固定劑，分別在常溫，4～20 ℃下保存光合細(xì)菌G3菌株，30 d后測(cè)定有效活菌數(shù)并觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：固定化保存的光合細(xì)菌活性較好，生長(zhǎng)繁殖旺盛[3]。目前我國(guó)漁用光合細(xì)菌商品保質(zhì)期較短，菌種在保存過(guò)程中細(xì)胞死亡率高、容易造成變異和污染。但目前尚無(wú)延長(zhǎng)漁用光合細(xì)菌商品保存期的研究報(bào)道。對(duì)實(shí)驗(yàn)室選育保存的高效莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata，菌種NC01）進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，采用正交和單因素試驗(yàn)方法對(duì)漁用莢膜紅假單胞菌商品進(jìn)行保存試驗(yàn)，研發(fā)出一種全新、有效的保存技術(shù)，顯著提高產(chǎn)品的保存期限和細(xì)胞活性，為漁用莢膜紅假單胞菌商品在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的廣泛應(yīng)用提供有效的保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌株P(guān)SB由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院南寧海可海樂(lè)微生物工程有限公司從高產(chǎn)蝦塘底泥中分離保存，經(jīng)鑒定為紅螺菌科莢膜紅假單胞菌（菌株編號(hào)NC01）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體配方[4]：使用本課題組優(yōu)化篩選的最佳培養(yǎng)基，其基本成分如下： CH3COONa 3.0 g，NH4Cl 0.8 g， KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 050 g，酵母膏1.5 g，CaCl2 50 mg，MnSO4 25 mg，F(xiàn)eSO4 5.00 mg，調(diào)節(jié)pH值至 7.0，曝氣自來(lái)水 1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

用5 L無(wú)色透明聚乙烯塑料桶培養(yǎng)，將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的優(yōu)化培養(yǎng)基中，置于室外自然光源下，溫度控制在30 ℃左右、光照度為6 000～8 000 lx，靜置培養(yǎng)5 d后待細(xì)胞培養(yǎng)液呈現(xiàn)深紅色，取樣測(cè)定有效活菌數(shù)≥3.18×109個(gè)/mL、pH值8.5～8.8備用。

1.2.2 保存條件正交試驗(yàn)

將擴(kuò)培后的菌液搖勻分裝到聚乙烯塑料桶中，采用L16（45）正交試驗(yàn)方法，每個(gè)試驗(yàn)方案做2個(gè)重復(fù)，共32桶，保存兩個(gè)月，取樣測(cè)定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值。研究不同的溫度、菌液pH值、包裝桶規(guī)格、透光度、顏色對(duì)漁用莢膜紅假單胞菌商品保存期的影響。試驗(yàn)以測(cè)定保存兩個(gè)月的商品菌液有效活菌數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，優(yōu)化出最適宜的保存條件。正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

1.2.3 保護(hù)劑單因素試驗(yàn)保存試驗(yàn)

在菌液中添加0.0%（空白對(duì)照組）、0.5%、1.0%、1.5%和2%的甘油，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共10桶，在最適宜的保存條件下保存兩個(gè)月，每隔15 d取樣測(cè)定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，研究不同濃度的甘油對(duì)漁用莢膜紅假單胞菌商品保存效果的影響，優(yōu)化出最適宜的添加量。

在菌液中添加0.0 g/L（空白對(duì)照組）、0.25 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L的維生素C，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共8桶，在最適宜的保存條件下保存兩個(gè)月，每隔15 d取樣測(cè)定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，研究不同濃度的維生素C對(duì)漁用莢膜紅假單胞菌商品保存效果的影響，優(yōu)化出最適宜的添加量。

1.2.4 不同保存技術(shù)的綜合對(duì)比試驗(yàn)

將擴(kuò)培好的菌液在最適宜和普通保存條件下保存漁用莢膜紅假單胞菌商品兩個(gè)月，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共4桶，每隔15 d取樣測(cè)定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，并進(jìn)行轉(zhuǎn)接復(fù)蘇，觀察菌的生長(zhǎng)情況。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

用ZDS-10型照度計(jì)測(cè)定透光度；用PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定pH值；用光合細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基[5]以平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞有效活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理