人工養(yǎng)殖菲牛蛭性腺分化的組織學(xué)觀察

張濤+于翔+龔元+李軍+張健

菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）屬于無吻蛭目，俗名金邊螞蟥，主要以吸食人和動(dòng)物的血液為生，在我國華南地區(qū)分布較廣，福建、海南、香港等地均有發(fā)現(xiàn)[1]。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者通過大量研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在生物活性物質(zhì)[2-8]，功能與水蛭素相似，具有抗凝活性，對降低血酸和血脂有一定藥理作用，在心血管疾病和血栓疾病方面療效明顯。因此，菲牛蛭的人工養(yǎng)殖開發(fā)具有廣大的市場前景。

目前，隨著我國野生菲牛蛭采捕量逐年減少，人工繁殖菲牛蛭技術(shù)至關(guān)重要，于翔[9]報(bào)道了菲牛蛭產(chǎn)卵繭孵化溫度24.0～30.0 ℃下，產(chǎn)卵繭周期一般從幾天到幾十天；張彬[10]報(bào)道了溫度對菲牛蛭卵繭孵化影響顯著，26 ℃和28 ℃下菲牛蛭卵繭孵化率較高；筆者通過越冬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭冬季也有產(chǎn)繭孵化現(xiàn)象。因此，能否通過一定物理刺激或強(qiáng)化飼料等因素作用，縮短菲牛蛭繁殖周期，并在發(fā)育成熟階段集中繁殖產(chǎn)卵繭，是人工繁殖菲牛蛭最重要的一環(huán)。而本文則通過生物組織學(xué)角度來剖析菲牛蛭在飼喂強(qiáng)化飼料條件下的性腺發(fā)育成熟度，為人工繁殖菲牛蛭技術(shù)的發(fā)展提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭由湖北省荊州市民康生物技術(shù)公司提供，挑選健康無病，平均每條體重為1.24±0.13 g亞成體菲牛蛭。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，將實(shí)驗(yàn)小水蛭暫養(yǎng)到土壤厚度為20～30 mm 的380 mm×275 mm×140 mm的60目網(wǎng)箱中，再將網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，用水調(diào)節(jié)干濕度至70%～80%。每箱實(shí)驗(yàn)組投放100尾小水蛭，并設(shè)三個(gè)平行組，暫養(yǎng)周期為7 d。

在養(yǎng)殖室溫為21～28 ℃，土層溫度為19～24 ℃條件下，試驗(yàn)飼料采用人工配合飼料（NP90血球粉30 g，NP2002血漿粉5 g，基礎(chǔ)液，雞蛋100 mL）灌腸后飼喂，每次飼喂前挑取全部試驗(yàn)小水蛭放到380 mm×275 mm×140 mm的60 目空網(wǎng)箱中，再將網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，塑料箱中放入少量的37 ℃左右的溫水，最后將配好的飼料放入網(wǎng)箱中，每5～10 d飼喂一次。每次飼喂前后要稱量全部水蛭個(gè)體體重，并在飼喂前隨機(jī)采取3～5條體質(zhì)健壯、體色正常、無傷病的小水蛭，用吸水濾紙擦拭干凈后稱其體重，經(jīng)麻醉劑麻醉，解剖截取精巢和卵巢后用波恩氏液固定24 h、梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟（56～60 ℃）包埋；通過DQP-9010電腦切片機(jī)連續(xù)切片，厚度7～8 μm，再進(jìn)行蘇木精—曙紅（H.E）染色、中性樹膠封片，最后用ECLIPSE E600光學(xué)顯微鏡觀察、拍照[11-12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示， 每次飼料實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)后代謝5～10 d的體重增重率（W，%）。

W（%）=（W2-W1）/W1×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 人工飼料飼喂菲牛蛭前后體重與形態(tài)變化

2014年6月14日至2014年9月19日期間，用人工飼料飼喂菲牛蛭14次。每次飼料實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)后代謝5～10 d的平均體重增重率（%）達(dá)到14.1±1.32%。飼喂后菲牛蛭全身腫脹，行動(dòng)遲緩，經(jīng)過5～10 d的代謝過程，身體基本恢復(fù)到飼喂前狀態(tài)，體表顏色無顯著變化，身體健康。當(dāng)水蛭體重達(dá)到6 g左右時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分菲牛蛭前端有黃色生殖環(huán)帶出現(xiàn)。

2.2 人工飼料飼喂菲牛蛭的精巢發(fā)育及組織學(xué)特征

菲牛蛭精巢位于身體兩側(cè)，為球形，共11對。每個(gè)精巢有輸精小管通到輸精管，各自膨大成貯精囊，再通到射精管，兩側(cè)的射精管在中部匯合到一個(gè)精管膨腔。不同發(fā)育時(shí)期的精巢，其特征不同。

本實(shí)驗(yàn)中，菲牛蛭通過人工飼料強(qiáng)化喂養(yǎng)，精巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期是在8月24日—9月19日的6次喂養(yǎng)過程中。本文為便于描述，將精巢發(fā)育過程分為5個(gè)時(shí)期。

2.2.1 精巢發(fā)展適應(yīng)期Ⅰ（6月14日—6月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑為110 μm。由圖1-1可知，組織切片觀察：精巢由結(jié)締組織分割成許多不規(guī)則的小室，小室內(nèi)生殖細(xì)胞大量增值成精原細(xì)胞，聚集成團(tuán)，精原細(xì)胞大小不一，不規(guī)則的排列于精巢之中，組織學(xué)為第Ⅰ時(shí)期。該結(jié)構(gòu)為初生期精囊。

2.2.2 精巢發(fā)展適應(yīng)期Ⅱ（6月24日—7月9日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑150 μm。由圖1-2可知，組織切片觀察：生精囊之間較為寬松，精小葉之間可見精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，精原細(xì)胞大量增殖聚集成初級精母細(xì)胞，核染色較深，結(jié)締組織有明顯的血管分布，精小葉無腔隙或腔隙較小，精小囊內(nèi)初級精母細(xì)胞同步發(fā)育，細(xì)胞體積與精原細(xì)胞相差不多，組織學(xué)為第Ⅱ時(shí)期。

2.2.3 精巢發(fā)展啟動(dòng)期（7月9日—7月29日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色半透明，精巢最大直徑為190 μm。由圖1-3，1-4可知，組織切片觀察：生精囊有豐富的微血管分布，精母細(xì)胞發(fā)育不同步性，除少數(shù)精原細(xì)胞外，大多數(shù)為初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞，細(xì)胞嗜堿性很強(qiáng)，被蘇木精染成藍(lán)色，細(xì)胞核明顯，生精囊中空存在，生精囊壁較薄，組織學(xué)為第Ⅲ時(shí)期。

2.2.4 精巢發(fā)展生長期（7月29日—8月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為240 μm。由圖1-5可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，腔隙增大，精小葉主要以次級精母細(xì)胞為主，同時(shí)伴有少量的精原細(xì)胞，初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，這些不同發(fā)育階段的各類精母細(xì)胞在一個(gè)精小葉內(nèi)是以同型的細(xì)胞群排列，組織學(xué)為第Ⅳ時(shí)期。

2.2.5 精巢發(fā)展成熟期（8月24日—9月19日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為270 μm。由圖1-6，1-7可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，次級精母細(xì)胞很少，幾乎看不到精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，成熟的精子細(xì)胞進(jìn)入腔隙擠滿整個(gè)空間，精小葉中腔隙縮小，精小葉的小葉腔隙充滿大量的成熟精子，組織學(xué)為第Ⅴ時(shí)期。

2.3 人工飼料飼喂菲牛蛭的卵巢發(fā)育及組織學(xué)特征

菲牛蛭卵巢被上皮結(jié)締和脂肪組織包裹明顯，位于雌性生殖孔第36，37環(huán)節(jié)中間的環(huán)溝上，蛋白腺兩側(cè)，為圓形或橢圓形，與輸卵管相連，共1對。不同發(fā)育時(shí)期的卵巢，其特征不同。

本實(shí)驗(yàn)中，菲牛蛭通過人工飼料強(qiáng)化喂養(yǎng)，卵巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期也是在8月24日—9月19日的6次喂養(yǎng)過程中。本文為便于描述，將卵巢發(fā)育過程分為5個(gè)時(shí)期。

2.3.1 卵巢發(fā)育適應(yīng)期（6月14日—7月9日）

卵巢發(fā)育到第Ⅰ期時(shí)，肉眼觀察卵巢為淺灰色半透明，橢圓形，最大直徑為100 μm。由圖2-1可知，組織切片觀察：生殖細(xì)胞成團(tuán)，不規(guī)則的排列在卵巢中，主要以卵原細(xì)胞為主，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，并表現(xiàn)為明顯的嗜堿性，細(xì)胞核圓形，較大，位于細(xì)胞中央，占據(jù)整個(gè)細(xì)胞體積的1/3-1/2左右，卵母細(xì)胞直徑0.8～1.2 μm。

2.3.2 卵巢發(fā)育啟動(dòng)期（7月9日—8月8日）

卵巢發(fā)育到第Ⅱ期時(shí)，肉眼觀察卵巢為白色半透明，橢圓形或圓形，最大直徑為120 μm。由圖2-2， 2-3可知，組織切片觀察：生殖細(xì)胞由卵原細(xì)胞向初級卵母細(xì)胞過渡，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性減弱，細(xì)胞核多位于細(xì)胞中央，細(xì)胞為卵圓形或圓形，部分細(xì)胞核仁增多，核區(qū)嗜酸性增強(qiáng)，卵母細(xì)胞質(zhì)膜外層出現(xiàn)皮質(zhì)液泡層并向內(nèi)延伸，細(xì)胞直徑1.5～2.1 μm。

2.3.3 卵巢發(fā)育小生長期（8月8日—8月24日）

卵巢發(fā)育到第Ⅲ期時(shí)，肉眼觀察卵巢體積增大不明顯，為白色透明，橢圓形或圓形，最大直徑為145 μm。由圖2-4，2-5可知，組織切片觀察：初級卵母細(xì)胞進(jìn)入卵黃積累時(shí)期，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性繼續(xù)減弱，細(xì)胞膜和細(xì)胞核界限模糊不清，細(xì)胞核向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)，核仁已經(jīng)排出，皮質(zhì)液泡層液泡減小，并出現(xiàn)嗜酸性卵黃顆粒，呈放射狀和淺紫色，卵母細(xì)胞直徑1.8～2.4 μm。

2.3.4 卵巢發(fā)育大生長期（8月24日—9月9日）

卵巢發(fā)育到第Ⅳ期時(shí)，肉眼觀察卵巢體積明顯增大，為淡黃色 ，橢圓形或圓形，最大直徑為210 μm。由圖2-6可知，組織切片觀察：細(xì)胞質(zhì)減少，核膜開始消失，核仁溶解，皮質(zhì)液泡層消失，卵黃顆粒由外向內(nèi)延伸，充滿卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞直徑2.7～3.2 μm。

2.3.5 卵巢發(fā)育成熟期（9月9日—9月19日）

卵巢發(fā)育到第Ⅴ期時(shí)，肉眼觀察卵巢體積，形狀與Ⅳ期變化不明顯，顏色為黃色，最大直徑為215 μm。由圖2-7可知，組織切片觀察：卵母細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到成熟標(biāo)準(zhǔn)，卵黃顆粒在卵母細(xì)胞聚集成卵黃，并充滿整個(gè)卵母細(xì)胞， 卵母細(xì)胞直徑2.8～3.4 μm。

3 討論

3.1 菲牛蛭繁殖生物學(xué)特性

菲牛蛭是雌雄同體，雄性先成熟[1]的環(huán)節(jié)動(dòng)物，這與本實(shí)驗(yàn)組織切片觀察結(jié)果相似。菲牛蛭行異體受精，由身體前端產(chǎn)繭后繭繁殖后代。其有一可以翻出的陰莖，交配時(shí)兩個(gè)體身體相反的腹部貼緊，一個(gè)個(gè)體陰莖插入另一個(gè)體陰道內(nèi)，一般是單方面輸送精子到另一方。當(dāng)一方個(gè)體的卵巢成熟后，卵巢囊中的卵與來自另一方個(gè)體的精子結(jié)合形成受精卵，最后被輸卵管的蛋白包上，此時(shí)受精卵就通過雌孔迅速地產(chǎn)到水蛭前端生殖體節(jié)的腺體中，這是為什么我們在觀察水蛭在產(chǎn)繭結(jié)束前，身體前部有黃色的生殖環(huán)帶的主要原因。

3.2 人工飼料飼喂次數(shù)、體重對菲牛蛭繁殖性能的影響

菲牛蛭在經(jīng)過三個(gè)月時(shí)間，14次人工飼料飼喂后，每次飼料實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)后代謝5～10 d的平均體重增重率W（%）達(dá)到14.1±1.32%。 隨著人工飼料飼喂次數(shù)增多，當(dāng)菲牛蛭體重為6 g左右時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分水蛭前端出現(xiàn)黃色的生殖環(huán)帶，表明水蛭性腺已經(jīng)達(dá)到成熟標(biāo)準(zhǔn)。這與張斌[10]報(bào)道的當(dāng)菲牛蛭體重在5～15 g范圍內(nèi)，性腺系數(shù)隨體重的增加而增大的內(nèi)容一致。但是，水蛭成熟時(shí)軀體大小與飼喂次數(shù)并非固定，而是具有一定的可塑性[13]。生長情況良好的菲牛蛭個(gè)體可能提前性成熟。同一種群中菲牛蛭性腺成熟的時(shí)間與個(gè)體大小有可能來自遺傳的差異[14]，也有可能來自對同一環(huán)境的適應(yīng)性不同的影響[15]。

3.3 人工飼料飼喂菲牛蛭性腺成熟時(shí)間與周期

精小葉的小葉腔隙中是否充滿大量的成熟精子是判斷精母細(xì)胞成熟的標(biāo)志，而卵黃的發(fā)生是卵子發(fā)育過程中極為重要的代謝活動(dòng)，是卵母細(xì)胞能否發(fā)育成熟的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)切片觀察可知，7月29日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊中出現(xiàn)少量精子，此為組織學(xué)雄性生殖器官第Ⅳ時(shí)期；8月24日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊破裂，精小葉的小葉腔隙中充滿大量精子，精母細(xì)胞成熟，此為組織學(xué)雄性生殖器官第Ⅴ時(shí)期。8月8日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵母細(xì)胞出現(xiàn)放射狀的卵黃顆粒，此為組織學(xué)雌性生殖器官第Ⅲ時(shí)期；9月9日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵黃顆粒在卵母細(xì)胞聚集呈卵黃，并充滿整個(gè)卵母細(xì)胞，此為組織學(xué)雌性生殖器官第Ⅴ時(shí)期。因此，由以上結(jié)論推出菲牛蛭是雄性先成熟個(gè)體，這與張斌[10]報(bào)道一致。

4 小結(jié)

通過本實(shí)驗(yàn)可得知，平均質(zhì)量為1.24±0.13 g的亞成體菲牛蛭在夏季自然變溫和光照條件下，經(jīng)過三個(gè)多月14次人工飼料的飼喂，部分菲牛蛭性腺出現(xiàn)生殖環(huán)帶，性腺成熟。其成熟時(shí)間遠(yuǎn)低于譚恩光[16]報(bào)道的廣東菲牛蛭在自然變溫和光照在60 W燈泡，早上8：00 亮燈， 17：30 熄燈， 下雨天不亮燈條件下，菲牛蛭從亞成體通過3次飼喂飼料，10個(gè)月才發(fā)現(xiàn)菲牛蛭有生殖環(huán)帶，完成一個(gè)生命周期所用的時(shí)間，因而適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)飼料的飼喂頻率，可以有助于菲牛蛭性腺早日成熟。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊潼.中國動(dòng)物志.環(huán)節(jié)動(dòng)物們.蛭綱[M].北京：科學(xué)出版社，1996：31.

[2] Keegan H L， Toshioka S， Suzuk I H. Blood-sucking Asia leeches of families Hirudidae and Haemadipsidae[R].Japan： U S Army Medical Command， 1968.

[3] Steiner V. Primary structure and function of novel oglycosylated hirudins from the leech Hirudinaria manillensis[J].Biochemistry， 1992， 31（8）：2294-2299.

[4] Scacheri E. Novel hirudin variants from the leech Hirudinaria manillensis， amino acid sequence， cDNA cloning and genomic organization[J]. Eur J Bio Chem， 1993， 214： 295.

[5] 譚恩光，劉秀平.廣東菲牛蛭菲牛蛭素基因的克隆和序列測定[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23（2）：84-87.

[6] 修霞，聶海燕，韓紅霞，等.水蛭化學(xué)成分及其藥理作用探討綜述[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2005， 5（8）：1733-1735.

[7] 李天全，萬昌秀，李倚劍.天然水蛭和水蛭素的開發(fā)利用[J].資源開發(fā)與市場，1997，13（4）：187-188.

[8] 仝向榮，王德斌，馬紹賓.蛭類體內(nèi)抗凝血物質(zhì)的研究[J].藥學(xué)進(jìn)展，2004，28（11）：481-482.

[9] 于翔.菲牛蛭室內(nèi)高密度養(yǎng)殖技術(shù)研究[D].廣州：中山大學(xué)，2009.

[10] 張彬.菲牛蛭（Hirudinaria manillensis Lesson，1842）養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)、生化成分及其抗凝活性研究 [D]廣州：中山大學(xué)，2008.

[11] 洪水根.動(dòng)物顯微技術(shù)學(xué)[M]. 廈門：廈門大學(xué)出版社，1989：141—153.

[12] 潘連德，孫玉華，陳輝，許平.施氏鱘幼魚肝性腦病組織病理學(xué)與細(xì)胞病理學(xué)研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，24（1）：56—60

[13] Steam S C，Cradall R E.Plasticity for age and size at sexualmaturity：a life-history response to unavoidable stress [M].In Fish Reproduction：Strategies and Tactics（G.W Potts and R.J Wootton、eds） [A].London：Academic Press. l984，99：l3—33.

[14] Aim G.Connection between maturity size and age in fishes[J].Rep lnst Freshwat Res.Dorttningholm.1959，40：5—45.

[15] Pitt T K.Changes in abundance and certain biological characters of Grand Bank American plaice.Hippoglossoides plaslessoides [J].Fish Res Bd Can.1975，32：l383一l389.

[16] 譚恩光，黃立英，關(guān)瑩，王波.廣東菲牛蛭生長和生殖研究 [J].中草藥，2002，33（9）：837—840

（收稿日期：2017-02-03）