安胎丸小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗

馮杰++侯連莉++陸土柳++于志瀛

摘 要：目的：通過檢測安胎丸對體細胞的致突變性，對其遺傳危害性做出初步評價。本研究選用7個廠家的12批次安胎丸樣品進行了小鼠骨髓細胞染色體畸變實驗[1]的研究。方法：選用雌性NIH小鼠，按4mg/kg體重的劑量連續(xù)灌胃4天給予安胎丸，鏡檢股骨骨髓。 結(jié)果：表明全部樣品的平均畸變率均明顯低于陽性對照組的平均畸變率，全部樣品的平均畸變率與陰性對照組的平均畸變率基本相當。結(jié)論：本研究的全部安胎丸樣品對小鼠骨髓細胞染色體均無致畸變性。

關鍵詞：安胎丸；骨髓細胞；染色體畸變；遺傳毒性；致突變

中圖分類號：R273 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）12-0197-02

安胎丸是一種養(yǎng)血安胎的中成藥，由當歸[2]、白芍、川芎、菟絲子、川貝母、黃芪[2]、荊芥、厚樸、艾葉、積殼、羌活、甘草組成。用于妊娠血虛，胎動不安，面色淡黃，不思飲食，神疲乏力等癥?，F(xiàn)代多用于先兆性流產(chǎn)，妊娠貧血等[3-4]。由于胎兒細胞分裂、分化發(fā)育等非常旺盛，對孕婦用藥的遺傳毒性有更高的要求。據(jù)相關報道稱，在遺傳毒性試驗中出現(xiàn)陽性結(jié)果的中藥較少，即使有一定的遺傳毒性，也大都是在遠遠高出人們正常服用的劑量下出現(xiàn)的，小劑量并不足以引起危險[5]，以致人們對其安全性的忽略。目前對安胎丸的應用相對廣泛，而對其安全性評價相對較少。安胎丸，作為一種孕婦常用中藥，對其遺傳毒性的評價有較大意義。本文通過小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗，為其安全性毒理學評價提供依據(jù)。

本研究用哺乳動物骨髓細胞染色體畸變的方法，對收集到的部分安胎丸樣品（7個廠家的12個批次）的致突變性進行了安全性評價（見表1）。雖然不同的廠家安胎丸的配方基本相同，但所用原材料來源與質(zhì)量、炮制工藝等可能會有差別，因此我們將收集的樣品的全部廠家都列入考察范圍。而每個廠家的不同批號間相對穩(wěn)定性較高，結(jié)合工作量進行考慮，本次研究每個廠家選用1-2個批號進行檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

安胎丸，規(guī)格：每丸重6g。本品為棕色的大蜜丸。人體推薦用量為每日2次，一次1丸，1日12g，按60kg體重這算成0.2g/kg。

1.1.2 實驗動物

選用NIH小鼠，每組5只，雌雄各半，逐一稱重，體重為20g-22g，動物室溫溫度：22℃～25℃，相對濕度：55%～70%。

1.1.3 主要儀器與試劑

儀器：實驗室常用儀器、解剖器械、離心機、恒溫水浴箱37±5℃、載玻片、生物顯微鏡。

試劑：0.1%秋水仙素、環(huán)磷酰胺、2.2%檸檬酸鈉、90%NaCl溶液、甲醇：冰醋酸3：1（現(xiàn)配現(xiàn)用）、0.75mol/L KCl溶液、Giemsa應用液（取1mlGiemsa原液，加入KH2PO4溶液3.6ml，KH2PO4·H2O溶液5.4ml）。

Giemsa原液配制：稱取Giemsa染料1.0g于研缽中，加甘油44ml，研磨至無顆粒，56℃水浴保溫2h，取出加入66ml甲醇，混勻，濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。

KH2PO4溶液：稱取KH2PO4粉0.908g，加超純水100ml溶解。

KH2PO4·H2O溶液：稱取KH2PO4·H2O粉1.187g，加超純水100ml溶解。

1.2 動物分組與劑量設置

在前期預實驗的基礎上，參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版），選用20g/kg BW的一個劑量組，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃4天，在末次給受試物后24h取材。處死動物前3h，按4mg/kg BW腹腔注入秋水仙素。另外，設陽性對照和陰性對照，陽性對照選用40mg/kg BW腹腔注射環(huán)磷酰胺，陰性對照用同體積的純化水，給藥頻率和給藥方式與樣品相同。

1.3 試驗方法

（1）用二氧化碳麻醉法處死動物，解剖取出股骨，剔除肌肉等組織。（2）剪去兩端骨骺，用注射器吸取4mL 2.2%檸檬酸鈉從股骨一端沖洗，用10ml離心管收集骨髓細胞懸液。（3）將細胞懸液置于離心機以1500rpm離心10min，棄去上清液，沉淀加4ml 0.075mol/L KCl溶液，用滴管輕吹混勻，置37℃水浴箱低滲處理30min。（4）加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），輕輕搖勻，37℃水浴放置10min，然后以1500rpm離心10min，棄去上清液。（5）再加入5ml固定液，輕輕吹打混勻，37℃水浴放置20min，1500rpm離心10min，除去上清液。（6）加入5ml固定液，輕輕吹打混勻，37℃水浴放置20min，1500rpm離心10，min，除去上清液，留約0.5ml固定液，輕輕吹打混勻。（7）從-30℃冰箱中取出冰凍的載玻片，懸空約（50cm）滴片，自然干燥。玻片編號，倒扣于片架。（8）用配制好的Giemsa應用液加滿片架凹槽，染色15min，后用清水沖洗干凈，晾干，存放于片盒中，以便觀察。

1.4 顯微鏡觀察

在低倍鏡下，每組各選擇100個左右分散良好，細胞末破裂的中期分裂相細胞，在顯微鏡油鏡下讀片進行染色體畸變分析，在讀片時記錄每一觀察細胞的染色體數(shù)目，記錄染色體畸變細胞在顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型（染色體結(jié)構異常：斷裂、微小體、有著絲點環(huán)、無著絲點環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化。染色體數(shù)目異常細胞：多倍體；非整倍體性畸變；內(nèi)復制。）

1.5 統(tǒng)計學方法

用χ2檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，觀察各試驗組畸變細胞率與陰性對照組和陽性對照組比較差異是否有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果與結(jié)論

2.1 結(jié)果

由表2可見，全部樣品和全部廠家的平均畸變率均明顯低于陽性對照組的平均畸變率（卡方檢驗均有顯著性差異，p<0.01），全部樣品和全部廠家的平均畸變率與陰性對照組的平均畸變率基本相當（卡方檢驗均無顯著性差異）。表明本研究的全部樣品均無明顯的致畸變性。廠家之間及相同廠家不同批次之間的平均畸變率雖然小有不同，但無統(tǒng)計學差異，推測為動物個體差異造成。

2.2 結(jié)論

本次實驗結(jié)果表明，廣西梧州三鶴藥業(yè)有限公司等7個廠家12批次的安胎丸對小鼠骨髓細胞的染色體均無致畸變性。

3 討論

染色體異常也稱染色體發(fā)育不全，指的是染色體的數(shù)目異常和結(jié)構畸變。智力低下和生長發(fā)育遲滯是染色體病的共同特征。藥物對人類的生殖危害是深遠的，它不僅對畸形兒本身的生理、心理造成障礙，對患兒家庭乃至整個社會都是沉重的負擔，因而，只要有可能造成人類畸形的藥物都需引起人們的高度重視，以確保婦女用藥安全[5、6]。

骨髓細胞染色體畸變分析試驗觀察的是分裂間期與前期的細胞染色體畸變，與骨髓微核試驗不同，能夠直接反應骨髓細胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試物是否具有突變作用[7、8]。在本實驗對7個廠家12批次的安胎丸進行安全性評價中，無小鼠死亡，未出現(xiàn)致突變作用，表明安胎丸對哺乳動物染色體可能不具有損傷效應。另外，目前國內(nèi)已有不少臨床報道證實安胎丸在治療先兆流產(chǎn)方面有顯著療效。安胎丸不僅可以用于治療先兆流產(chǎn)，也能用于預防流產(chǎn)的發(fā)生，服用方便，值得臨床推廣使用

參考文獻

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