兒童急性淋巴細(xì)胞白血病骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查多中心綜合比較及評價

張 雪，李 蓓，陳振萍，吳敏媛，李志剛

(1.兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科、教育部兒科重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心，北京100045;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院科研處，北京100045)

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查因其方法簡單、報告及時、參考價值大，在血液系統(tǒng)疾病診斷中發(fā)揮著相當(dāng)關(guān)鍵的作用。但是在多數(shù)情況下，由于骨髓取材過程、染色、檢驗(yàn)人員判定能力以及所用術(shù)語習(xí)慣的不同，使這項(xiàng)診斷技術(shù)缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，特別是在一些惡性血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療中，更需要進(jìn)一步規(guī)范。

急性白血病(acute leukemia，AL)是兒童最常見的惡性腫瘤，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)約占兒童 AL的70%[1]。目前，ALL多采用 MIC(細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué))分型法。其中骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷因不受實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和儀器限制，往往作為ALL診斷的首選項(xiàng)目，同時也是ALL后續(xù)治療評估、調(diào)整治療方案的重要依據(jù)之一。但是，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查作為一項(xiàng)特殊性檢驗(yàn)項(xiàng)目，影響因素相對較多，同時對檢驗(yàn)人員的素質(zhì)、能力要求比較嚴(yán)格、苛刻。因此其客觀性往往不如免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。

2008年，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院、香港威爾斯親王醫(yī)院、蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院等全國13家醫(yī)院以及首都醫(yī)科大學(xué)共同組成了中國兒童白血病協(xié)作組(Chinese Children's Leukemia Group，CCLG)，研究兒童 ALL 診斷、規(guī)范性治療及預(yù)后評估。該項(xiàng)目的重要內(nèi)容之一就是完善并統(tǒng)一兒童ALL在細(xì)胞形態(tài)學(xué)的診斷及評估標(biāo)準(zhǔn)。

材料和方法

一、研究對象

CCLG的13家成員醫(yī)院于2008年1月至2010年12月期間共收治1 091例ALL患兒，其中男童653例，女童438例，中位年齡4歲(0.5～16歲)。協(xié)作組成員醫(yī)院對ALL患兒采用統(tǒng)一的入組標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中標(biāo)危組 480 例(44.0%)、中危組395例(36.2%)、高危組 216 例(19.8%)。ALL患兒治療期間統(tǒng)一使用CCLG-ALL2008治療方案[2]。所有病例的中位隨訪時間為18個月(0.4個月 ～36個月)。

二、研究方法

1.建立多中心協(xié)作的資料采集、登記、共享的網(wǎng)絡(luò)信息管理系統(tǒng)。

2.經(jīng)過CCLG各成員醫(yī)院協(xié)商，通過網(wǎng)絡(luò)信息管理系統(tǒng)，使用單純隨機(jī)抽樣方法，分別從標(biāo)危組、中危組、高危組抽取10%樣本，其中，標(biāo)危組48例、中危組40例、高危組22例，共計110例。登記被抽樣ALL患兒資料，包括姓名、性別、年齡、收治醫(yī)院、入院時間。

3.將被抽樣患兒資料反饋給其收治醫(yī)院，同時依據(jù)CCLG-ALL2008治療方案規(guī)定的骨髓檢查時間，要求該醫(yī)院提供該患兒的初診、治療第15天、治療第33天以及治療第12周的骨髓細(xì)胞涂片及相對應(yīng)的原始報告。

4.由專人接收、登記各醫(yī)院復(fù)檢骨髓細(xì)胞涂片及原始報告，并將復(fù)檢骨髓細(xì)胞涂片及原始報告統(tǒng)一登記管理。

5.采用電腦隨機(jī)派位方法，將骨髓細(xì)胞涂片平均分配給2名檢驗(yàn)人員進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢內(nèi)容包括骨髓細(xì)胞分類(CCLG各成員醫(yī)院均計數(shù)200個有核細(xì)胞)、描述骨髓像特點(diǎn)、提出檢驗(yàn)結(jié)論。復(fù)檢人員均專職負(fù)責(zé)骨髓細(xì)胞涂片檢查，且均為中級技術(shù)職稱。

6.由血液專業(yè)臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)技師各一名，對骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告和原始報告進(jìn)行審核、比對、分析，并提供書面意見。

7.將骨髓細(xì)胞涂片、復(fù)檢報告以及反饋意見發(fā)還給CCLG各成員醫(yī)院。

結(jié) 果

一、骨髓取材及增生程度判斷

在隨機(jī)抽取的110個樣本共440份骨髓細(xì)胞涂片中有12份(2.7%)骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告與原始報告均判斷取材稀釋，且均未描述骨髓增生程度，其中治療第15天骨髓細(xì)胞涂片7份(1.6%)、治療第 33天骨髓細(xì)胞涂片 5份(1.1%)。13 份(3.0%)骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告判斷骨髓取材稀釋，未描述骨髓增生程度;而原始報告判斷該13份骨髓細(xì)胞涂片取材良好，均描述骨髓增生減低，其中治療第15天骨髓細(xì)胞涂片7份(1.6%)，治療第 33天骨髓細(xì)胞涂片 6份(1.4%)。其余 415 份(94.3%)骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告與原始報告均判斷骨髓取材良好，其骨髓增生程度描述也基本吻合。報告存在分歧的13份骨髓細(xì)胞涂片，經(jīng)過復(fù)審，支持復(fù)檢報告結(jié)論。

二、染色情況

復(fù)檢報告中有7份(1.6%)初診骨髓細(xì)胞涂片描述染色偏淺，5份(1.1%)初診骨髓細(xì)胞涂片描述染色偏深;這12份骨髓細(xì)胞涂片原始報告均描述染色良好。其余428份(97.3%)骨髓細(xì)胞涂片的復(fù)檢報告與原始報告均描述染色良好。報告存在分歧的12份骨髓細(xì)胞涂片經(jīng)過復(fù)審，支持復(fù)檢報告結(jié)論。

三、骨髓像特點(diǎn)描述

復(fù)檢報告與原始報告描述骨髓像特點(diǎn)時均不同程度存在使用語言不規(guī)范，名詞術(shù)語使用不統(tǒng)一，中、英文混用以及使用不規(guī)范的縮略語或英文縮寫等現(xiàn)象。同時，各CCLG成員醫(yī)院骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)報告格式不統(tǒng)一。

表1 兒童ALL初診及治療期間骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢與原始報告符合情況統(tǒng)計 [份(%)]

四、檢驗(yàn)結(jié)論

除骨髓取材情況存在異議的骨髓細(xì)胞涂片以及稀釋骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告及原始報告均建議復(fù)查、未下檢驗(yàn)結(jié)論外，其余415份(94.3%)骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告與原始報告檢驗(yàn)結(jié)論基本吻合。其中110份初診骨髓細(xì)胞涂片檢驗(yàn)結(jié)論均為ALL;在96份ALL治療第15天骨髓細(xì)胞涂片中，76份(79.2%)診斷為完全緩解(CR)、13份(13.5%)診斷為部分緩解(PR)、7 份(7.3%)診斷為未緩解(NR);在99份ALL治療第33天骨髓細(xì)胞涂片中，93份(93.9%)診斷為 CR、4份(4.0%)診斷為 PR、2 份(2.0%)診斷為 NR;在110份ALL治療第12周骨髓細(xì)胞涂片中，109份(99.1%)診斷為 CR、1 份(0.9%)診斷為骨髓復(fù)發(fā)。

表2 兒童ALL骨髓復(fù)檢與原始報告緩解情況符合統(tǒng)計 [份(%)]

討 論

世界衛(wèi)生組織(WHO)新的分型系統(tǒng)強(qiáng)調(diào)了形態(tài)學(xué)在血液系統(tǒng)疾病診斷的重要性。特別是在急性白血病的分型和治療評估中，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查更具有重要的參考價值和意義[3]。CCLG各成員醫(yī)院骨髓細(xì)胞涂片的制作和常規(guī)染色比較統(tǒng)一，沒有特殊或改良方法。但是在日常工作中，由于工作人員在實(shí)際操作中存在技術(shù)和習(xí)慣性差異，可能造成骨髓細(xì)胞在取材、制片及染色過程中出現(xiàn)與理論要求不同;同時，由于檢驗(yàn)人員的細(xì)胞辨別能力以及細(xì)胞形態(tài)術(shù)語應(yīng)用習(xí)慣的差異，影響了骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷的客觀性和一致性，使這項(xiàng)診斷技術(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，在跨地區(qū)、跨醫(yī)院進(jìn)行骨髓細(xì)胞涂片會診中出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)論偏差。因此，多中心進(jìn)行骨髓細(xì)胞涂片的室間比對在統(tǒng)一骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法，提高實(shí)驗(yàn)室骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)水平的同時，通過討論和協(xié)商，建立統(tǒng)一的骨髓細(xì)胞形態(tài)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及報告格式，為多中心協(xié)作發(fā)展和血液系統(tǒng)及相關(guān)疾病的病例會診、討論提供了統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室平臺。

骨髓細(xì)胞取材是骨髓細(xì)胞學(xué)檢查的基礎(chǔ)，但有時骨髓穿刺采集標(biāo)本時?；煅♂?，影響骨髓細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果。因此，鑒別稀釋骨髓細(xì)胞涂片是能否正確診斷血液系統(tǒng)疾病的前提。但是，目前《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》等有關(guān)文獻(xiàn)都未明確提及骨髓細(xì)胞涂片稀釋的判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實(shí)際工作中往往憑借檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)判斷，易造成偏差。特別是在兒童ALL治療第15天和治療第33天期間，其骨髓增生受到化療藥物抑制，骨髓穿刺時易出現(xiàn)骨髓干抽，造成骨髓稀釋現(xiàn)象，而稀釋骨髓細(xì)胞涂片中白血病細(xì)胞比值常少于取材良好的骨髓細(xì)胞涂片。因此，正確判斷骨髓稀釋與骨髓抑制期的骨髓增生減低是評估ALL患兒治療效果，繼續(xù)或調(diào)整治療方案的重要保證。本研究中有13份骨髓細(xì)胞涂片原始報告判斷骨髓增生減低，但復(fù)檢報告判斷骨髓稀釋，而這13份標(biāo)本均為治療第15天或治療第33天骨髓。另外，有12份骨髓細(xì)胞涂片復(fù)檢報告與原始報告均判斷為骨髓稀釋，這12份標(biāo)本也均為治療第15天或治療第33天骨髓。因此，鑒別骨髓細(xì)胞涂片是否稀釋需要檢驗(yàn)人員長期的經(jīng)驗(yàn)積累和對該疾病以及該疾病治療期間骨髓特點(diǎn)的準(zhǔn)確認(rèn)識和把握。同時，多部位骨髓穿刺取材也是鑒別骨髓抑制或骨髓稀釋的方法，但對患者創(chuàng)傷較大，操作時應(yīng)慎重。

本研究中除12份稀釋骨髓細(xì)胞涂片和13份骨髓取材情況有異議的骨髓細(xì)胞涂片外，其余415份骨髓細(xì)胞涂片增生程度的判斷非常吻合。目前，對骨髓增生程度的分級標(biāo)準(zhǔn)[4-5]已經(jīng)非常明確，一般采用五級分級法[5]。即使對于骨髓細(xì)胞形態(tài)初學(xué)者也可以參照分級標(biāo)準(zhǔn)對骨髓增生程度進(jìn)行正確判斷。但是，對于稀釋骨髓細(xì)胞涂片不應(yīng)進(jìn)行增生程度分級，但應(yīng)對骨髓稀釋程度進(jìn)行適當(dāng)說明或描述。

骨髓細(xì)胞涂片染色目前多采用Wright染液或Wright-Giemsa混合染液[6]染色，方法均比較成熟。本研究中原始報告對骨髓細(xì)胞涂片染色均描述染色良好，但在復(fù)檢報告中出現(xiàn)ALL患兒初診骨髓細(xì)胞涂片染色偏淺或偏深現(xiàn)象。骨髓細(xì)胞涂片染色情況直接影響檢驗(yàn)人員對骨髓細(xì)胞的辨別。因此，當(dāng)不能把握染色過程中細(xì)胞著色程度時，應(yīng)在涂片染色過程中使用顯微鏡低倍鏡反復(fù)、多次觀察涂片中有核細(xì)胞染色情況。當(dāng)有核細(xì)胞染色略深于正常顏色時方可沖去染液。同時，骨髓細(xì)胞涂片染色時間應(yīng)結(jié)合涂片中有核細(xì)胞數(shù)量、染液與緩沖液比例、實(shí)驗(yàn)室溫度等因素靈活掌握，不能一概而論。ALL患兒初診骨髓細(xì)胞涂片中有核細(xì)胞相對較多，造成染色時間掌握不準(zhǔn)確，使有核細(xì)胞著色不好。

CCLG各成員醫(yī)院由于各實(shí)驗(yàn)室骨髓細(xì)胞學(xué)檢查電腦軟件操作平臺不同，同時各醫(yī)院對骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)報告要求存在差異，檢驗(yàn)人員對骨髓像描述習(xí)慣不同，在骨髓細(xì)胞涂片檢查中往往存在報告內(nèi)容不統(tǒng)一，描述骨髓像特點(diǎn)時專業(yè)術(shù)語使用不規(guī)范等現(xiàn)象，例如在描述骨髓增生程度時出現(xiàn)“Ⅰ～Ⅴ級”分級和“增生極度活躍、明顯活躍、活躍、減低和極度減低”分級兩種描述方法;另外，還存在部分細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)描述不一致，中文命名不統(tǒng)一，中、英文混用以及使用不規(guī)范中文縮略語或英文縮寫等現(xiàn)象。這些問題說明細(xì)胞形態(tài)學(xué)領(lǐng)域需要達(dá)成必要的共識，這將有助于提高骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷綜合水平，同時對于跨地區(qū)、跨醫(yī)院骨髓細(xì)胞涂片會診提供統(tǒng)一、規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)。

目前，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法學(xué)已經(jīng)相當(dāng)成熟。但在實(shí)際操作中，由于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)專職人員相對較少，而細(xì)胞形態(tài)學(xué)本身具有專業(yè)性、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)和有一定傳承性的特點(diǎn)。同時，檢驗(yàn)人員對骨髓各階段細(xì)胞形態(tài)尺度及標(biāo)準(zhǔn)的把握，對疾病發(fā)生、發(fā)展過程中骨髓特點(diǎn)的掌握均不同程度的影響檢驗(yàn)結(jié)論，造成骨髓細(xì)胞涂片在會診過程中結(jié)論出現(xiàn)差異。因此，要提高骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷水平就需要完全依靠檢驗(yàn)人員扎實(shí)的理論基礎(chǔ)和長期工作經(jīng)驗(yàn)的積累，這也是血液實(shí)驗(yàn)室管理中的重點(diǎn)、難點(diǎn)[7]。同時，實(shí)驗(yàn)室間定期交流比對、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部對疑難細(xì)胞涂片討論學(xué)習(xí)、檢驗(yàn)人員的定期培訓(xùn)和考核[8]以及積極參加骨髓讀片會都是提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)水平、強(qiáng)化檢驗(yàn)人員綜合素質(zhì)、統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)的必要手段和方法。

本研究僅對CCLG成員醫(yī)院兒童ALL骨髓細(xì)胞涂片檢查進(jìn)行比較評價，存在一定局限性，而對于其它疾病的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查還需要各醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行定期比對和長期的經(jīng)驗(yàn)和人員交流，通過討論、協(xié)商，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，最終達(dá)到各成員醫(yī)院間骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果的互認(rèn)。

致謝:CCLG成員醫(yī)院(排名不分先后)為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院、香港威爾斯親王醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院、首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院、中國人民解放軍總醫(yī)院、中國人民解放軍海軍總醫(yī)院、蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院、哈爾濱市兒童醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心第二附屬醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院。

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