骨髓細胞學(xué)結(jié)合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析

張　斌，蔡艷霞，張素貞，房勝春，李玉芬(.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000；.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診部，河北 張家口 075000)

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·論著·

骨髓細胞學(xué)結(jié)合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析

張斌1，蔡艷霞2，張素貞1，房勝春1，李玉芬3*(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診部，河北 張家口 075000)

[摘要]目的采用流式細胞技術(shù)結(jié)合骨髓細胞形態(tài)學(xué)雙參數(shù)雙向驗證分析微小殘留病細胞。方法對微小殘留病檢測患者進行形態(tài)學(xué)與流式散點圖雙向驗證，分析微小殘留病細胞的特點。結(jié)果采用該方法分析的樣本陽性檢出率高且不易漏診。結(jié)論采用骨髓細胞學(xué)結(jié)合流式散點圖雙向驗證進行微小殘留分析，陽性檢出率高且漏診率低。

[關(guān)鍵詞]骨髓細胞；流式細胞術(shù)；治療結(jié)果

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.028

微小殘留病是指白血病經(jīng)誘導(dǎo)化療獲完全緩解后或骨髓移植后，體內(nèi)殘留有少量白血病細胞的狀態(tài)。當今對微小殘留病主要有基因檢測、流式細胞技術(shù)檢測等方法，各實驗室還沒有完全統(tǒng)一的分析方法及標準化操作，本實驗室近年來采取流式細胞技術(shù)及細胞形態(tài)學(xué)2項檢測相互驗證的方法，對微小殘留病進行分析，療效判斷標準按照張之南、沈悌主編的《血液病診斷及療效標準》第3版[1]?，F(xiàn)將本實驗室近年來對32例微小殘留病分析結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇我院2011—2013年急性淋巴細胞性白血病14例和急性非淋巴細胞白血病18例進行微小殘留病分析檢測的患者。分析評估獲檢測陰性者25例(M3 10例，M2 5例，M5 3例，B-ALL 7例)，陽性者7例(M3 3例，M5 1例，M2 1例，B-ALL 2例)。其中1例本實驗室分析陽性而北京某檢驗所單一流式分析陰性患者45 d后骨髓形態(tài)學(xué)檢測原始細胞7.5%為陽性骨髓復(fù)發(fā)，其余檢測陰性者停藥至今(>1年)未見1例復(fù)發(fā)。

1.2實驗室檢查

1.2.1流式細胞檢測對標本進行50~100萬個細胞以上多抗體組合檢測，其中髓系白血病主要包括CD3、CD5、CD7、CD19、CD14、CD64、CD34、CD38、CD13、CD33、CD16、CD11b、HLA-DR、CD15、CD117、MPO等，B淋系白血病主要包括CD3、CD5、,CD7、CD19、CD20、CD22、CD9、CD23、CD34、CD38、CD13、HLA-DR、MPO、CD79a等[2]。通過以上檢測觀察有無幼稚細胞跨系列表達、跨階段多表達和缺失表達，以及幼稚細胞發(fā)育停滯等現(xiàn)象[3]。

1.2.2細胞形態(tài)學(xué)觀察比對主要采取低倍鏡全片或大面積尋找幼稚細胞后轉(zhuǎn)高倍鏡進行幼稚細胞形態(tài)學(xué)評估。評估要點有：整體形態(tài)(有無多邊形、梭形、手鏡形等)、核漿比例失衡、核出芽、核腫脹等病態(tài)造血現(xiàn)象[4]。

2結(jié)果

對32例患者采用以上方法分析，所有檢測陰性者在低倍鏡下，多視野(至少50個有幼稚細胞視野)觀察未發(fā)現(xiàn)原始細胞形態(tài)不規(guī)則、大小不一、核漿比例不平衡，以及染色質(zhì)腫脹、出芽現(xiàn)象，符合流式細胞散點圖原始細胞無任何跨系列、跨階段表達，CD34、CD38走向正常，無幼稚細胞停滯現(xiàn)象。如果有一項指標符合以上描述均視為微小殘留病分析檢測陽性。部分細胞形態(tài)學(xué)及流式散點圖結(jié)果，見圖1~6。

圖1所示細胞為檢測陽性細胞(原發(fā)M5)，此類細胞胞體中等形態(tài)似梭形，染色質(zhì)疏松，染色質(zhì)偏于一側(cè)，且有扭曲折疊，核仁明顯(瑞氏染色 ×1 000)

圖2所示細胞為檢測陽性細胞，此類細胞胞體較大，不規(guī)則，染色質(zhì)疏松腫脹，核仁明顯，胞漿中可見分布不均勻、大小不等顆粒，且易見偽足(瑞氏染色 ×1 000)

圖3所示細胞為檢測陰性細胞，此類細胞胞體中等大小，形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)疏松，核仁1~2個，無扭曲折疊、核出芽等現(xiàn)象(瑞氏染色 ×1 000)

圖4對應(yīng)圖1 流式細胞，該病例原始細胞占1.65%，流式結(jié)果主要表達B淋巴細胞免疫標志CD19、CD10、HLA-DR，但其有異常系外表達CD64以及CD34 表達停滯現(xiàn)象，未有向CD38過度表達的痕跡

圖5對應(yīng)圖2，該細胞群CD34向CD38過度發(fā)育散點圖有明顯斷裂走勢，另外幼稚細胞群既有髓系CD33表達又有淋系CD19的異常表達

圖6對應(yīng)圖3，該細胞群表達幼稚淋巴細胞，未見異常表達

3討論

在評價微小殘留時，在形態(tài)學(xué)方面主要考慮原始細胞所占有核細胞比例，>5%為骨髓未見緩解，<5%為骨髓完全緩解。對于原始細胞的良惡描述很少或近乎沒有形態(tài)學(xué)工作者對其進行判斷，可能是由于形態(tài)學(xué)工作者專一從事其工作，未對流式細胞術(shù)或更多檢查手段進行對比研究，沒有人描述什么樣的原始細胞更趨向于正常細胞，什么樣的細胞可能趨向于惡性細胞。

3.1原始細胞形態(tài)在形態(tài)學(xué)診斷工作中，特別是原始細胞比例偏低時，絕對不應(yīng)以原始細胞的比例進行骨髓報告的判斷，而應(yīng)該以形態(tài)學(xué)特點加以分析，主要包括：①原始細胞的整體特點，有無形態(tài)各異的原始細胞，如多邊形、梭形、手鏡形及不規(guī)則形等；②細胞核的觀察，如有無核腫脹出芽、胞核偏于一側(cè)，同一標本中觀察多個原始細胞有無胞核形態(tài)各異(既有規(guī)整者又有其他者)；③細胞質(zhì)的觀察，有無多邊形偽足、內(nèi)外漿等現(xiàn)象。對于以上細胞的觀察診斷應(yīng)主要分析其一致性，如果同一標本容易發(fā)現(xiàn)不一致細胞特點，應(yīng)考慮非正常原始細胞存在，進而結(jié)合流式細胞分析結(jié)果及散點圖走向特點。

3.2流式細胞技術(shù)分析白血病相關(guān)的免疫表型主要包括以下4種類型：抗原跨系列表達、跨階段表達、過度表達及表達缺失[5]。許多研究表明，不能因為骨髓中不成熟細胞的量而判斷為微小殘留病陽性。正常的骨髓細胞沒有免疫標志異常高表達和異常低表達，只有異常免疫標志表達足夠顯著時才可被用于判斷微小殘留的細胞[6]。采用流式細胞技術(shù)分析微小殘留病，主要觀察原始細胞的發(fā)育走向，如在進行最少100萬個細胞分析的基礎(chǔ)上單獨設(shè)門進行原始細胞的分析，如發(fā)現(xiàn)有原始細胞CD34到CD38發(fā)育停滯或有斷裂現(xiàn)象及原始細胞跨階段表達(髓系CD16/11b，淋系CD20/22尤為重要)，要結(jié)合有無形態(tài)異常進而判斷其原始細胞的質(zhì)量。在檢測跨系列表達時，并非要按照首發(fā)時原始細胞的表達進行分析，應(yīng)該增加它系典型抗體。本研究中多次化療后檢測到的病理細胞表達情況并非與首發(fā)時表達完全一樣，如M3的患者檢測到在幼稚B淋巴細胞的表面表達CD64，同時形態(tài)學(xué)原始細胞形態(tài)各異，有核出芽等現(xiàn)象。Kern等[7]總結(jié)了文獻報道的1 400例新診斷和未治療AML患者的白血病相關(guān)免疫表型分布情況，結(jié)果顯示抗原跨系列表達者占23．5%，跨階段表達者占20.6%，過度表達者占36.1%，表達缺失者占19.8%，其中絕大多數(shù)檢測出的LAIP僅見于5%以下的患者。因此，建議采用較大的抗體組合及三色以上的MPFC分析進行LAIP的檢測。我們主張在進行髓系檢測的時候至少增加淋系CD19、CD7、CD79a；在進行淋系檢測的時候至少增加淋系CD13、CD33、CD64、MPO的檢測。

綜上所述，在分析微小殘留病樣本時至少結(jié)合形態(tài)學(xué)及流式細胞2項技術(shù)進行，2項技術(shù)相互印證地分析同一標本得出的結(jié)果更符合實際病情。但本研究樣本量較少，需增加樣本量進一步探討。

[參考文獻]

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[4]邱衛(wèi)華，郭慶云，張英芬. 骨髓增生異常綜合征中病態(tài)造血的特點與鑒別診斷[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008,29(4)：584-586.

[5]Campana D，Coustan-Smith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytomemy[J].Cytomemy,1999，38(4)：139-152 .

[6]王璐璐，王建中，屈晨雪，等. 八色流式細胞術(shù)檢測急性B淋巴細胞白血病微小殘留病方法的建立[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35(5)：423-430.

[7]Kern W，Schoch C，Haferlach T，et al. Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2005,56(2):283-309.

(本文編輯：劉斯靜)·研究快報·

[中圖分類號]R551.3

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2016)02-0222-04

通訊作者*。E-mail:zbzb612@126.com。

[作者簡介]張斌(1976-),男,河北張北人，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院副主任技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事血液病形態(tài)學(xué)診斷及流式細胞技術(shù)研究。

[基金項目]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20100482)

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-01-13