HPLC法測定八角蓮中3種活性成分含量的研究

徐怡++邱斌++熊永興++蘇鈦++李云

摘要：目的建立用高效液相色譜法測定八角蓮中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的方法，比較不同產(chǎn)地八角蓮藥材3種化合物的含量。方法色譜柱：Waters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30℃。結(jié)果槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的線性范圍分別為000973 μg-973 μg（r=09999）、001001 μg-1001 μg（r=09999）、000998 μg-998 μg（r=09999），平均回收率分別為9835%（RSD=26%）、10025%（RSD=23%）、10080%（RSD=27%）。結(jié)論該方法簡便可行，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定八角蓮藥材中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素3種成分的含量，為八角蓮藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：八角蓮；槲皮素；鬼臼毒素；山柰素；高效液相色譜法

中圖分類號：R9272文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2017）07-0065-03

八角蓮（Dysosma versipellis Hance MCheng）隸屬于小檗科（Berberidaceae）八角蓮屬（Dysosma Woodson），為我國特有二級瀕危保護(hù)植物，主要分布在四川、云南、廣西和湖北神農(nóng)架林區(qū)及周邊地區(qū)[1-2]，其根和根莖入藥，有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀消腫之功效。用于治療癰癤腫痛、毒蛇咬傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、半身不遂、氣管炎、乙型肝炎等，也可做殺蟲劑。其主要有效成分有木脂素類物質(zhì)鬼臼毒素及其衍生物、黃酮類物質(zhì)山柰素和槲皮素等?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-6]，鬼臼毒素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用；黃酮類成分則在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用。目前對八角蓮中有效成分的含量測定研究僅限于鬼臼毒素，且對不同產(chǎn)地八角蓮中鬼臼毒素、槲皮素、山柰素等三種有效成分的含量比較尚未見報(bào)道。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測定八角蓮中三種成分的方法，為客觀評價(jià)八角蓮藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

11儀器美國Agilent 1100高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測器、自動進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、智能化柱溫箱及化學(xué)工作站）；恒溫水浴鍋；梅特勒-托利多AG285電子天平。

12試藥十二批八角蓮藥材由云南省藥物研究所收集，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance）MCheng，見表1。

對照品槲皮素（批號：100081-200406，純度973%）、鬼臼毒素（批號：111645-200301）、山柰素（批號：110861-200304）均由中國藥品生物制品檢定所提供；所用流動相甲醇、磷酸為色譜純，處理樣品的甲醇為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Wasters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30℃，理論塔板按槲皮素計(jì)算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離（見圖1）。

22溶液的制備

221對照品溶液的制備精密稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含槲皮素01 mg，鬼臼毒素01 mg，山柰素01 mg的溶液，作為對照品溶液。

222供試品溶液的制備取樣品05 g（過4號篩），精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，精密量取甲醇25 mL，稱重，80℃水浴回流30 min，放至室溫后，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，用045 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

23線性關(guān)系考察精密稱取槲皮素1000 mg，鬼臼毒素1001 mg，山柰素998 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0973 mg/mL、1001 mg/mL、0998 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精密吸取此儲備液逐級稀釋，分別注入液相色譜儀中，以對照品含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y槲皮素=14109X+18353，r=09999；Y鬼臼毒素=4837X +9504，r=09999；Y山奈素=15916X+16558，r =09999。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，槲皮素在000973μg～973μg，鬼臼毒素在001001μg～1001μg，山柰素在000998μg～998μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

24準(zhǔn)確度試驗(yàn)（加樣回收試驗(yàn)）精密稱取9份樣品（已測槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量分別為00645%、0125%、0241%，每份約025 g），分別添加適量對照品（含量的50%、100%、150%），然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的供試品溶液按含量測定方法同法測定，計(jì)算：槲皮素平均回收率=9835%，RSD=26%（n=9）、鬼臼毒素平均回收率=10025%，RSD=23%（n=9）、山柰素平均回收率=10080%，RSD=27%（n=9）。

25精密度試驗(yàn)

251儀器精密度取混合對照品溶液（槲皮素00973 mg/mL、鬼臼毒素01001 mg/mL、山柰素00998 mg/mL），按照“21”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，RSD%分別為11%、12%、082%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度較好。

252重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品按“222”項(xiàng)平行制備供試品6份，按照“21”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定結(jié)果，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的RSD分別為：29%、24%、22%，表明本法具有良好的重復(fù)性（RSD3%）。

26穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份樣品溶液，按“21”項(xiàng)色譜條件，分別于0、3、6、16、20h進(jìn)樣，測定峰面積，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素峰面積的RSD%（n=5）分別為：091%、079%、059%，結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

27樣品測定取12批樣品按上述供試品制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述“21”項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量，結(jié)果見表2。

3討論

本試驗(yàn)參考了有關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，對提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間分別作單因素考察，最終確定了供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取法。通過對三種成分的甲醇溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果槲皮素、山柰素在254 nm、360 nm處有最大吸收，但鬼臼毒素的最大吸收波長為290 nm，考慮到槲皮素和山柰素的響應(yīng)值偏高，且鬼臼毒素在其他兩個(gè)波長下吸收值均不理想，故選擇290 nm為檢測波長，實(shí)驗(yàn)表明該波長檢測靈敏度高，雜質(zhì)吸收峰少，干擾小，效果理想。

本研究建立了八角蓮中三個(gè)主要化學(xué)成分的高效液相色譜定量分析方法。該方法專屬性強(qiáng)，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可為八角蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究及種質(zhì)資源評價(jià)建立基礎(chǔ)。

從12批不同產(chǎn)地的樣品測定結(jié)果可以看出，各地八角蓮三個(gè)成分含量存在較大差異。其中，湖北、江西、安徽等地的八角蓮樣品鬼臼毒素含量明顯高于云南、四川等地。影響藥材品質(zhì)的因素很多，主要有產(chǎn)地、采收期、加工方法等。本文收集的樣品有限，一定程度上影響了研究的深度，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，并對其他影響因素與含量間的相關(guān)性開展更深入研究。

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