富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長及部分生物學(xué)特性的影響

張騰騰， 張 涵， 李太元， 張 敏， 許廣波， 李艷茹

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長及部分生物學(xué)特性的影響

張騰騰， 張 涵， 李太元， 張 敏， 許廣波， 李艷茹*

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為了研究富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長及部分生物學(xué)特性的影響，選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為受試菌種，進(jìn)行富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌的增菌、耐鹽性、酸堿耐受性、溫度耐受性的影響以及其對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸和抑菌效果的影響等試驗(yàn)。結(jié)果表明：富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有增菌作用，其最適作用濃度分別為1、1、4、4 mg/mL。富鍺酵母蛋白粉能一定程度地提高細(xì)菌的耐酸堿能力、膽鹽耐受能力及溫度耐受能力，提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸量和其細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。本試驗(yàn)為富鍺酵母蛋白粉在飼料中的添加提供一定的理論基礎(chǔ)。

富鍺酵母蛋白粉；酵母蛋白粉；細(xì)菌；生長；生物學(xué)特性

微生物蛋白質(zhì)又稱單細(xì)胞蛋白(single cell protein ,SCP),具有高蛋白質(zhì)、多氨基酸、低脂等特點(diǎn)，并可以從廢物中產(chǎn)生[1]。酵母蛋白是干燥益生菌酵母除去多糖等其他成分富集而成的一種功能性蛋白，主要是菌體蛋白及酵母代謝產(chǎn)物，富含小肽、氨基酸、核苷酸、谷氨酸鹽和肌醇等養(yǎng)分[2]。有機(jī)鍺具有抗炎等藥理作用，并且在癌癥、關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的治療方面有一定功效[3]。富鍺酵母蛋白粉為基本無毒食品，可作為食品功能基料廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和保健領(lǐng)域中[4]。乳酸菌作為動(dòng)物腸道的正常菌群，在維持動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡和調(diào)節(jié)動(dòng)物代謝方面發(fā)揮重要作用[5]。枯草芽孢桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)具有抑制致病菌生長和促進(jìn)有益菌生長的雙重功能[6]。大腸桿菌在正常情況下對(duì)健康有益，一旦增殖失控，或從腸道轉(zhuǎn)移到身體其他部位，就可能引發(fā)許多問題。金黃色葡萄球菌是臨床感染性疾病最常見的病原菌，可引起皮膚軟組織、下呼吸道及血液系統(tǒng)等多種部位的感染，尤其是醫(yī)院感染較常見的病原菌[7]。本試驗(yàn)把4種細(xì)菌添加到含富鍺酵母蛋白粉的培養(yǎng)基中，研究富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長及特性的影響，為進(jìn)一步開發(fā)研究富鍺酵母產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種來源

大腸桿菌(Escherichiacoli編號(hào)：1.2385)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis編號(hào)：63510)；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus編號(hào)：1.1854)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus編號(hào)：1.0089)。均購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.2藥品與試劑

富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉(由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供)；普通肉湯培養(yǎng)基(購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；MRS肉湯培養(yǎng)基，瓊脂粉，LB肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 菌懸液制備

挑取復(fù)活在固體培養(yǎng)基上的菌落于液體培養(yǎng)基(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌使用LB肉湯，嗜酸乳桿菌使用MRS肉湯，下同)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，用生理鹽水稀釋菌懸液，使其OD值為0.7±0.1[8]，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌增殖的影響

用普通肉湯把富鍺酵母和酵母蛋白粉分別配成質(zhì)量濃度為0、0.1%～1.0%的溶液，使其總體積為1 mL(下同)。每管添加菌懸液20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，嗜酸乳桿菌作厭氧培養(yǎng)(下同)。利用稀釋涂布平板法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)(下同)。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉的增殖和最適作用濃度。

1.5 酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌耐膽鹽能力的影響

用最適濃度的富鍺酵母蛋白粉肉湯(標(biāo)記為F)配制膽鹽濃度分別為0、0.1%～0.5%的溶液，另做酵母蛋白粉對(duì)照組(標(biāo)記為J)和肉湯對(duì)照組(標(biāo)記為L)。每管添加菌懸液20 μL，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，并計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母對(duì)細(xì)菌耐膽鹽能力的影響。

1.6 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌酸堿耐受性的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對(duì)照組和肉湯對(duì)照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組6管，并分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH值至2、4、6、7、9、10，每管添加菌懸液20 μL，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，并計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌酸堿耐受性的影響。

1.7 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對(duì)照組和肉湯對(duì)照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組20 mL，并調(diào)整pH值至最適，分別添加菌懸液400 μL，37℃恒溫培養(yǎng)?？莶輻U菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌每隔2 h、嗜酸乳桿菌每隔3 h取1 mL菌液，計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響。

1.8 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌溫度耐受性的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對(duì)照和肉湯對(duì)照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組10管，每管添加菌懸液20 μL，分別置于40、60、80 ℃ 3個(gè)梯度的水浴中，均處理10、20、30 min，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，并計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌溫度耐受性的影響。

1.9 富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對(duì)照組和肉湯對(duì)照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組100 mL，分別添加菌懸液2 mL，混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔3 h取5 mL菌液測(cè)pH值。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響。

1.10 富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素抑菌效果的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對(duì)照組和肉湯對(duì)照組3組肉湯培養(yǎng)基，每管體積為10 mL，每管加嗜酸乳桿菌菌懸液200 μL，混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，3 000 r/min離心5 min，取上清液。利用牛津杯法，測(cè)3組細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。重復(fù)3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 富鍺酵母蛋白粉濃度對(duì)細(xì)菌增殖的影響

由圖1可知，富鍺酵母蛋白粉有促進(jìn)細(xì)菌生長的作用，其作用效果要比酵母蛋白粉好(除嗜酸乳桿菌外)，富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最適作用濃度分別為1,1,4,4 mg/mL，而酵母蛋白粉的最適濃度分別為5,3,2,2 mg/mL。

圖1 蛋白粉濃度對(duì)細(xì)菌的影響Fig.1 The effects of protein powder concentration on bacteria

2.2 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌耐膽鹽作用的影響

富鍺酵母蛋白粉降低了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的膽鹽耐受能力；提高了枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受能力(圖2)。

圖2 蛋白粉對(duì)細(xì)菌膽鹽耐受能力的影響Fig.2 The effects of protein powder on the salt tolerance of bacteria

2.3 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌酸堿耐受性的影響

富鍺酵母蛋白粉提高了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和嗜酸乳桿菌的耐酸堿能力，且富鍺酵母蛋白粉比酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌耐酸能力提高幅度大(圖3)，尤其是pH值為6時(shí)。

圖3 蛋白粉對(duì)細(xì)菌酸堿耐受能力的影響Fig.3 The effects of protein powder on acid and alkali tolerance of bacteria

2.4 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響

由圖4可知，富鍺酵母蛋白粉延長了金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)期(由8～14 h至4～20 h)，縮短了金黃色葡萄球菌的適應(yīng)期(由0～8 h至0～4 h)；縮短了大腸桿菌的適應(yīng)期(由0～10 h至0～4 h)，延長了其對(duì)數(shù)生長期；延長了枯草桿菌的適應(yīng)期(由0～14 h至0～18 h)，但是提高了其對(duì)數(shù)期的生長速度；縮短了嗜酸乳桿菌的適應(yīng)期(由0～15 h至0～12 h)，但提高了對(duì)數(shù)生長期的生長速度(圖5)。

圖4 蛋白粉對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響 圖5 蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌生長曲線的影響Fig.4 The effects of protein powder on bacterial growth curve Fig.5 The effects of protein powder on L. acidophilus growth curve

2.5 富鍺酵母蛋白粉對(duì)細(xì)菌溫度耐受性的影響

由圖6可知，富鍺酵母蛋白粉不同程度地提高了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和嗜酸乳桿菌的溫度耐受性。但在40 ℃ 30 min時(shí)，蛋白粉的添加降低了大腸桿菌的溫度耐受性。對(duì)嗜酸乳桿菌而言，富鍺酵母組對(duì)溫度耐受性的提高幅度大于酵母組。

圖6 蛋白粉對(duì)細(xì)菌溫度耐受能力的影響Fig.6 The effects of protein powder on temperature tolerance of bacteria

2.6 富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響

隨著時(shí)間的延長，菌液pH值逐漸下降。在42～48 h時(shí)，各組pH值趨于穩(wěn)定，且酵母組的pH

值<富鍺酵母組的pH值<對(duì)照組的pH值(圖7)。這說明富鍺酵母蛋白粉提高了嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力，但提高幅度低于酵母蛋白粉。

圖7 蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響Fig.7 The effects of protein powder on acid production of L. acidophilus

2.7 富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素抑菌效果的影響

由圖8可知，富鍺酵母組乳酸菌素對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑均大于對(duì)照組，但小于酵母組，說明富鍺酵母蛋白粉提高了乳酸菌素對(duì)大腸桿菌的抑制作用，但其幅度不如酵母蛋白粉；富鍺酵母蛋白粉對(duì)乳酸菌素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用幾乎沒有影響。

圖8 蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素抑菌效果的影響

3 討論與結(jié)論

微生物蛋白為細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的生長繁殖起著重要的影響。富鍺酵母是集酵母的高營養(yǎng)、有機(jī)鍺的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤功能于一身的高附加值功能食品[4]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉能促進(jìn)細(xì)菌生長，縮短菌株生長周期和提高菌體增殖速度。但高劑量時(shí)對(duì)受試菌的促生長作用降低甚至起抑制作用。蘇琦表明抗菌肽可以在細(xì)胞膜上形成穿膜孔道，使膜快速去極化，引起細(xì)菌死亡[9]。高劑量富鍺酵母蛋白粉的抑制機(jī)制是否與其肽的含量有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

膽鹽隨肝膽汁排至小腸，影響腸道膽鹽濃度[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床證實(shí)膽鹽有抑制細(xì)菌生長的作用[11]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉提高了嗜酸乳桿菌和枯草桿菌的膽鹽耐受能力。Smet I D等人指出，膽鹽能夠以分子的形式通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，然后在細(xì)胞質(zhì)中釋放氫離子使細(xì)胞內(nèi)酸化，從而引起細(xì)菌的死亡。細(xì)菌可以利用ATP所生成的H+—三磷酸腺苷來驅(qū)逐質(zhì)子以調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的pH值，從而減輕膽鹽的毒害作用[12]。由此可以推測(cè)富鍺酵母蛋白粉可能為細(xì)菌提供了大量的ATP來源，從而提高了細(xì)菌的膽鹽耐受力。

隨著攝入食物的變化，胃腸道內(nèi)的pH值也隨之發(fā)生變化，胃酸的分泌造成胃內(nèi)酸性環(huán)境，影響細(xì)菌的生長。本次試驗(yàn)表明,富鍺酵母蛋白粉可以不同程度的提高細(xì)菌的酸堿耐受能力。田會(huì)芹表明,pH值的改變會(huì)引起細(xì)胞膜電荷變化，進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[13]。因此,可以猜測(cè)富鍺酵母蛋白粉可能保護(hù)了細(xì)菌細(xì)胞膜電荷的變化，從而提高了細(xì)菌的酸堿耐受性。

溫度對(duì)細(xì)菌生長繁殖有較大影響，過高的溫度可以殺死細(xì)菌。環(huán)境溫度會(huì)影響活菌制劑的生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存及使用。該試驗(yàn)結(jié)果顯示,富鍺酵母蛋白粉提高了細(xì)菌的溫度耐受性。菌體蛋白質(zhì)(包括酶類)因加熱而發(fā)生變性或凝固，活性消失、代謝發(fā)生障礙，因而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。由此推測(cè)蛋白粉可能補(bǔ)充了蛋白質(zhì)，從而提高了細(xì)菌的溫度耐受性。

乳酸菌產(chǎn)酸功能是一個(gè)很重要的指標(biāo)，酸可使胃內(nèi)蛋白酶原激活，同時(shí)酸具有強(qiáng)的殺菌作用[14]。乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸可以降低其他雜菌細(xì)胞間質(zhì)的pH值破壞其滲透壓，以及破壞雜菌的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)干擾其活動(dòng)從而產(chǎn)生抑菌作用[15]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉可以一定程度的提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力及其對(duì)大腸桿菌的抑制作用。其抑菌機(jī)制可能是提高了產(chǎn)酸量從而抑制了大腸桿菌的生長。

富鍺酵母蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有增菌作用，其最適作用濃度分別為1、1、4、4mg/mL。富鍺酵母蛋白粉能一定程度的提高細(xì)菌的耐酸堿能力、膽鹽耐受能力及溫度耐受能力，提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸量和其[][]

細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。畜禽可以通過食用添加富鍺酵母蛋白粉的飼料，提高腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而提高飼料利用率，提高畜禽的產(chǎn)量。本試驗(yàn)為富鍺酵母蛋白粉在飼料中的添加提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Effect of germanium-enriched yeast protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacteria

ZHANG Tengteng, ZHANG Han, LI Taiyuan, ZHANG Min, XU Guangbo, LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to study the effect of germanium-enriched protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacterial, the standard strains ofEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,BacillussubtilisandLactobacillusacidophiluswere selected as tested bacteria strains. We evaluated the effects of germanium-enriched yeast protein powder on the growth, salt tolerance, acid-base tolerance, temperature tolerance of the tested bacteria stains, and checked the effects on the acid production and bacteriostasis ofL.acidophilus. The results showed that the germanium-enriched yeast protein powder stimulated the growth ofL.acidophilus,B.subtilis,S.aureus,E.coli, and the most suitable concentrations of germanium powder were 1, 1, 4 and 4 mg/mL, respectively. The germanium-enriched yeast protein powder could improve the ability of acid-resistance and alkali-resistance, bile salt tolerance and temperature tolerance of the tested bacteria, and increase the acid production ofL.acidophilusand the bacteriostasis effect of bacteriocin onE.coli. The results provide a theoretical basis for the application of the germanium-enriched yeast protein powder in feed additives.

Germanium-enriched yeast protein powder; yeast protein powder; bacteria; growth; biochemical characteristics

2017-03-27 基金項(xiàng)目：吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(20110236)

張騰騰(1991—)，女，河南永城人，在讀碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)，李艷茹為通信作者，

E-mail：hmwang@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0060-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.010

TQ936

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