紅椒根際促生菌液體發(fā)酵條件研究

孫兆遠，翟瑋瑋，張麗芳，曹陽

（江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，江蘇淮安223003）

紅椒根際促生菌液體發(fā)酵條件研究

孫兆遠，翟瑋瑋*，張麗芳，曹陽

（江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，江蘇淮安223003）

為了合理開發(fā)利用PGPR生物菌肥，以600 nm波長處的吸光度（OD600）和IAA產(chǎn)量為評價指標，對紅椒根際促生細菌（PGPR）的發(fā)酵條件進行研究，探討了碳源、氮源、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、溶液pH值和裝液量等因素對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，并通過正交試驗對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結果表明：最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50 mL；各因素對IAA產(chǎn)量的影響順序為裝液量＞培養(yǎng)時間＞溶液pH值＞培養(yǎng)溫度。

辣椒；根際細菌；液態(tài)發(fā)酵；吲哚乙酸

植物根際促生細菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類可促進植物生長、提高作物產(chǎn)量、防治病害的有益菌類[1]。PGPR能夠通過解磷、自生固氮和螯合Fe3+等方法給植物提供更多的營養(yǎng)物質，以達到促進植物根系生長，改變根系形態(tài)，增加根毛度、根毛數(shù)、側根數(shù)、根重量和根表面積的作用[2]；還可以分泌IAA等植物激素，提升細胞壁的疏松度和可塑性，促進RNA和蛋白質的合成，溶解細胞壁糖，改變細胞內環(huán)境，進而起到促進細胞生長，增加細胞體積和質量的作用[3，4]。

早在1953年我國生物學家就從陜西徑陽縣老苜蓿根系土壤中分離出“5406”PGPR菌株（細黃鏈霉菌乳糖變種），經(jīng)誘變處理制成生物菌肥，該菌肥具有防病保苗、促進生長、肥地松土的作用[5]。但由于當時發(fā)酵設備和技術較為落后，所產(chǎn)生物菌肥肥效穩(wěn)定性差，特效菌株繁殖性能弱，雜菌污染嚴重，因此，大大限制了該生物菌肥的大規(guī)模應用[6]。近年來，發(fā)酵設備和發(fā)酵工藝的快速發(fā)展，為規(guī)?；a(chǎn)PGPR生物菌肥提供了物質和技術支撐[7]。

PGPR生物菌肥的促生防病效果，不僅取決于菌株本身，而且還取決于外界條件，如培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等[8]。為此，采用單因素試驗和正交試驗對PGPR菌株液態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到其最適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期為合理開發(fā)利用PGPR生物菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅椒根際PGPR，分離自淮安紅椒根際。由江蘇食品藥品職業(yè)技術學院微生物實驗室分離、篩選、鑒定和保存。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)液：L-色氨酸100 mg，（NH4）2SO42 g，NaH2PO40.50 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.20 g，CaCl20.10 g，蒸餾水1 000 mL。

試劑：3-IAA標準品為Sigma公司產(chǎn)品，其余化學試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液制備將斜面保存的紅椒根際PGPR菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度30℃、轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60 h，制成活菌含量＞108CFU/mL的種子液[9]。

1.2.2 碳源和氮源的選擇

1.2.2.1 碳源的選擇。分別向基礎發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1%（W/V）的葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖，配制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液。裝入250 mL三角瓶中，裝液量100 mL/瓶，滅菌后加入5%（V/V）的種子液，在溫度30℃、轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60 h，比較不同碳源對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳碳源種類。

1.2.2.2 氮源的選擇。分別向基礎發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1%（W/V）的蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、谷氨酸、硫酸銨、硝酸銨，配制成不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液。按照“1.2.2.1”所述方法培養(yǎng)，比較不同氮源對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源種類。

1.2.3 發(fā)酵條件的選擇與優(yōu)化

1.2.3.1 培養(yǎng)時間的選擇。應用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調節(jié)至7，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度30℃、轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72和84 h，比較不同培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.2 培養(yǎng)溫度的選擇。應用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調節(jié)至7，按照“1.2.2.1”所述方法接種，分別在溫度20、25、30、35、40和45℃，轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同培養(yǎng)溫度對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.3 pH值的選擇。應用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值分別調節(jié)至4、5、6、7、8、9和10，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度35℃、轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同pH值對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.4 裝液量的選擇。應用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調節(jié)至6，分別取25、50、75、100和150 mL裝入三角瓶中，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度35℃、轉速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同裝液量對PGPR菌株生長狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.5 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化。采用L9（43）正交試驗設計（表1），考察培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH值和裝液量對IAA產(chǎn)量的影響，確定PGPR菌株的最佳發(fā)酵條件。

表1 L9（43）正交試驗的因素及其水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 測定項目與方法

1.2.4.1 PGPR菌株生長狀況。用600 nm波長處的吸光度（OD600）表示。取發(fā)酵后的菌懸液10 mL，稀釋適當倍數(shù)后，在600 nm波長處測定吸光度[10]。

1.2.4.2 IAA產(chǎn)量。采用Salkowski比色法測定。將菌懸液10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的Salkowski比色液，避光靜置30 min，取出后立即在530 nm波長處測定吸光度[11]。根據(jù)IAA標準曲線（采用3-IAA標準品繪制），計算IAA產(chǎn)量。

2 結果與分析

2.1 碳源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長測定結果（圖1）顯示，6種碳源均對PGPR菌體生長有促進作用，其中，葡萄糖、蔗糖和甘露醇的效果較為明顯；果糖和乳糖對PGPR菌體生長有一定的作用；而木糖對OD600影響很小。說明PGPR對葡萄糖、蔗糖和甘露醇的吸收利用效果較好，但基本不吸收木糖。

從IAA產(chǎn)量測定結果看，蔗糖可以大幅提高IAA產(chǎn)量，其次是甘露醇和果糖，木糖的效果仍然不明顯。值得注意的是，葡萄糖并沒有大幅度提升IAA產(chǎn)量，這可能是因為高濃度的葡萄糖在反應終止時仍會大量殘留，而殘留的葡萄糖則與IAA形成無活性的糖基-IAA復合體，降低了游離態(tài)IAA的產(chǎn)量[3]。

綜合分析不同碳源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳碳源為蔗糖。

圖1 不同碳源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon sources on grow th of PGPR and IAA concentration

2.2 氮源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長測定結果（圖2）顯示，蛋白胨和酵母粉2種有機氮源對PGPR菌體生長和IAA產(chǎn)量均有明顯的促進作用；硝酸鉀能夠顯著提高IAA產(chǎn)量，但對PGPR菌體生長影響甚微；谷氨酸和硫酸銨對PGPR菌體生長增效不顯著，但硫酸銨明顯提高了IAA產(chǎn)量，而谷氨酸對IAA產(chǎn)量作用不大；硝酸銨能較大幅度地提高IAA產(chǎn)量，但卻阻礙了PGPR菌體生長。

綜合分析不同氮源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源為酵母粉。

圖2 不同氮源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on grow th of PGPR and IAA concentration

2.3 培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長測定結果（圖3）顯示，在0～24 h內，PGPR菌株快速進入對數(shù)生長期；24 h后逐漸進入穩(wěn)定期，并在48 h后達到最高點，當發(fā)酵時間超過60 h時OD600略有下降，說明PGPR細菌開始死亡。

從產(chǎn)量測定結果看，在12～24 h內，有少量IAA產(chǎn)生，且IAA產(chǎn)量變化不大；當發(fā)酵時間超過24 h后，IAA產(chǎn)量快速提高，這主要是因為IAA是PGPR的次級代謝產(chǎn)物，只有在PGPR成熟穩(wěn)定后才能大量產(chǎn)生并積累；當發(fā)酵時間超過60 h后，IAA產(chǎn)量略有下降，這主要是因為細胞死亡導致的次生代謝產(chǎn)物降低和IAA降解酶將IAA分解[12]。

綜合分析不同培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳培養(yǎng)時間為60 h。

圖3 不同培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on grow th of PGPR and IAA concentration

2.4 培養(yǎng)溫度對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

測定結果（圖4）顯示，隨著溫度的升高，OD600和IAA產(chǎn)量均呈先快速增加后快速降低的變化趨勢，且指標值均在培養(yǎng)溫度為35℃時達到最大。說明PGPR菌株生長的最適溫度為35℃，且在此條件下，菌株次級代謝產(chǎn)物IAA產(chǎn)量最高。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of tem perature on grow th of PGPR and IAA concentration

2.5 pH值對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長測定結果（圖5）顯示，pH值為4和10時，PGPR菌體均不生長，也不產(chǎn)生IAA，這是因為PGPR為中性微生物，在強酸和強堿環(huán)境下均不能生長；當pH值為5～9時，PGPR菌體均能較好地生長，說明PGPR生長具有較寬的pH值適應范圍，但是pH值＞6后IAA產(chǎn)量有所降低，說明PGPR積累IAA的最適pH值為6左右。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)液不同pH值對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of pH of solutions on grow th of PGPR and IAA concentration

2.6 裝液量對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長測定結果（圖6）顯示，裝液量為25 mL時，三角瓶中的氧氣最為充足，但PGPR菌株生長量和IAA產(chǎn)量并不是最大，說明過多的氧氣并不適合PGPR菌株生長和IAA的產(chǎn)生，這可能是因為高濃度的氧氣會對PGPR菌株生長產(chǎn)生抑制作用，影響了菌體的分裂和次生產(chǎn)物的代謝；裝液量為50 mL時，PGPR菌株生長量和IAA產(chǎn)量均為最大；當裝液量＞50 mL后，隨著裝液量的增加，PGPR菌株生長量和IAA產(chǎn)量均逐漸降低，這是因為裝液量增加，PGPR細菌數(shù)量增加，三角瓶中相對溶解氧氣的數(shù)量就會減少，菌體生長變慢，IAA產(chǎn)量下降。這也說明PGPR為嚴格好氧菌，IAA的合成是好氧代謝，培養(yǎng)基中溶氧量的減少將會影響菌株的生長和IAA產(chǎn)量[13]。

圖6 不同裝液量對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of quantity of sam ples on grow th of PGPR and IAA concentration

2.7 最佳發(fā)酵條件的確定

極差分析結果（表2）顯示，試驗因素對PGPR菌株發(fā)酵效果的影響順序為D＞A＞C＞B。說明裝液量對PGPR菌株發(fā)酵效果影響最大，培養(yǎng)時間次之，培養(yǎng)溫度的影響最小。

從各水平對應的k值可以看出，最佳發(fā)酵條件為A2B2C2D2，即：培養(yǎng)時間60 h，培養(yǎng)溫度35℃，發(fā)酵液pH值6，裝液量50 mL。

表2 正交試驗的IAA產(chǎn)量Table 2 IAA concentration of the orthogonal test

3 結論與討論

PGPR菌株發(fā)酵過程極其復雜，影響因素眾多，對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化顯得尤為重要[14～16]。作者在前期試驗的基礎上，通過單因素試驗和正交試驗對影響PGPR菌株發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行了研究，結果表明，不同的發(fā)酵液成分（碳源、氮源）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液pH值和裝液量）均會影響PGPR菌體的生長和IAA產(chǎn)量，這與前人的研究結果[17，18]相吻合。發(fā)酵液成分試驗結果表明，葡萄糖、蔗糖、甘露醇、蛋白胨和酵母粉對PGPR菌體生長有較好的促進作用，而蔗糖、蛋白胨、酵母粉和硝酸鉀可以大幅度提高IAA產(chǎn)量，這與文獻報道的觀點[19，20]略有不同，可能是因為菌株不同造成的；通過正交試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件對IAA產(chǎn)量的影響順序為裝液量＞培養(yǎng)時間＞溶液pH值＞培養(yǎng)溫度，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50 mL，與前人對不同菌株的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分研究結果[21]相比較，不同種類菌株之間差異很大。

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Optim ization of Submerged Fermentation of Plant Grow th-promoting Rhizobacteria From Hot Pepper

SUN Zhao-yuan，ZHAI Wei-wei*，ZHANG Li-fang，CAO Yang
（Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huaian 223003，China）

Fermentation conditions of a plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）from hot pepper were optimized by OD600and content of indoleacetic acid.The effects of six reaction parameters，including carbon sources，nitrogen source，fermentation time and temperature，pH of solutions and quantity of samples，on the growth of PCRR and content of indoleacetic acid were conducted to explore by single factor experiments and orthogonal experiment.The results showed that an optimum yield of indoleacetic acid was obtained by 50 mL samples，at pH 6 and 35℃with standing time of 60 h.In addition，other factors had the largest impact on the yield of indoleacetic acid followed by quantity of sample，fermentation time，pH of solutions and fermentation temperature.

Hot pepper；Rhizosphere bacteria；Liquid state fermentation；IAA

S144.9

：A

：1008-1631（2017）02-0061-05

2016-08-31

江蘇省政策引導類計劃（產(chǎn)學研合作）項目（BY2015054-01）

孫兆遠（1978-），男，江蘇沛縣人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分提取與應用研究。E-mail：sun_zyuan@126.com。

翟瑋瑋（1968-），女，江蘇淮安人，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分提取與應用研究。E-mail：zaiww6810@126.com。