反相液相色譜法測定苦參中苦參堿和氧化苦參堿

郝文，李丹丹，楊超

(青島市疾病預防控制中心， 青島市預防醫(yī)學研究院，青島 266033)

反相液相色譜法測定苦參中苦參堿和氧化苦參堿

郝文，李丹丹，楊超

(青島市疾病預防控制中心， 青島市預防醫(yī)學研究院，青島 266033)

建立反相液相色譜法測定苦參中苦參堿和氧化苦參堿含量的方法。提取溶劑為乙醇，選擇C18色譜柱，以甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)為流動相，流量為0.8 mL/min，紫外檢測器波長為210 nm?？鄥A和氧化苦參堿的質(zhì)量濃度在10～200 mg/L范圍內(nèi)均與其色譜峰面積呈良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限分別為0.05， 0.1 mg/L。苦參堿和氧化苦參堿的加標回收率分別為98.47%，97.89%，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.32%，1.08%(n=6)。該方法操作簡便，干擾少，靈敏度高。

反相液相色譜法；苦參；苦參堿；氧化苦參堿

AbstractA method for the determination of matrine and oxymatrine in sophora flavescens by reversed phase liquid chromatography was established. The extraction solvent was ethanol， C18column was selected， methanol-water-three ethylamine solution (55∶45∶0.2) was used as the mobile phase with the flow rate of 0.8 mL/min，and the UV detector wavelength was 210 nm. The concentration of matrine and oxymatrine was linear with its chromatographic peak area in the range of 10-200 mg/L，the linear correlation coef ficients were more than 0.999, and the detection limits were 0.05,0.1 mg/L, respectively. The recovery rates of matrine and oxymatrine were 98.47%, 97.89%，and the relative standard deviations of determination results were 1.32% and 1.08%(n=6), respectively. The method has the advantages of simple operation， less interference and high sensibility.

Keywordsreversed phase liquid chromatography; sophora flavescens; matrine; oxymatrine

苦參是豆科槐屬類植物的根，其含有的活性成分主要是苦參堿和氧化苦參堿，是一種具有喹喏里西啶骨架的生物堿［1］?？鄥A和氧化苦參減具有抗病毒、消炎止痛和抗腫瘤的功效，它在人體內(nèi)作用機理是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)具有抗病毒、抗炎免疫、升高白細胞、激活細胞膜腺苷酸環(huán)化酶以及清除體內(nèi)自由基等作用，在醫(yī)學、藥學等臨床上的應(yīng)用越來越廣泛［2］。

測定苦參堿和氧化苦參堿常用分光光度法［3］、酸堿滴定法［4］、毛細管電泳法［5］，這些方法存在樣品前處理繁瑣、消耗時間長等缺點。液相色譜法在這方面的研究近年來開始報道，白小紅等采用液相微萃取/后萃取-高效液相色譜法測定氧化苦參堿和苦參堿，具有溶劑用量小、干擾少等優(yōu)點［6］；Fukuda等采用質(zhì)譜方法對不同苦參堿類組分進行了檢測和鑒別［7］。筆者采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時測定苦參粗提取液中的苦參堿和氧化苦參堿含量，該方法具有樣品前處理簡單，定量準確，簡便快速的特點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，美國安捷倫科技有限公司；

DAD紫外檢測器：G1314A型，美國安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：BSA224S型，德國賽多利斯公司；

超聲波脫氣機：KQ2200E型，昆山超聲儀器公司；

容積過濾器：T-50型，北京興延誠博科技有限公司；

純水機：Ultra Clear TWF型，德國西門子公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

無水乙醇：分析純，國藥試劑化學試劑廠；

中性氧化鋁：粒徑為75 μm(200目)，Ⅳ級活度；

苦參堿和氧化苦參堿對照品：中國藥品生物制品研究所；

實驗用水為純水機制得一級水。

1.2 樣品前處理

將待測樣品切成小塊（約1 g），切碎，置于150 mL燒杯中，加入50 mL乙醇，使得樣品分散均勻，使用組織搗碎機搗碎2 min，用快速濾紙過濾，收集濾液，再用50 mL濾液分多次洗滌濾紙上殘渣，收集合并濾液于旋蒸瓶中，于50℃蒸干。準確加入10.00 mL流動相溶解樣品，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，供檢測［8］。

1.3 對照品儲備溶液制備

稱取苦參堿和氧化苦參堿對照品各50.00 mg，置于5 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至標線，搖勻，所制備的對照品儲備溶液質(zhì)量濃度為 10.00 mg/mL，置于 4℃冰箱中備用［9］。

1.4 儀器工作條件

色 譜 柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-三乙胺(55∶45∶0.2)，加入磷酸溶液調(diào)節(jié)流動相pH值為2.0［10-11］，流量為 0.8 mL/min ；紫外檢測器波長：210 nm；柱溫：35℃，進樣體積：10μL；外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑

分別采用乙醇、甲醇-水(1∶1)作為提取溶劑進行試驗，結(jié)果表明，用甲醇-水(1∶1)作為提取溶劑時，濾液渾濁，雜質(zhì)較多，需進一步凈化處理，否則影響液相分析；用乙醇作為提取溶劑，濾液澄清，可濃縮蒸干定容后直接進樣，因此實驗選擇乙醇為樣品提取溶劑。

2.2 流動相及其流速

分別采用不同比例的甲醇-水、乙腈-水作為流動相進行試驗，結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動相時，加入基體改進劑后峰型改善不明顯，分離效果不好；以甲醇-水為流動相時，發(fā)現(xiàn)色譜峰不對稱，有較嚴重的拖尾現(xiàn)象，加入0.2%的乙二胺后，峰型得到很好改善，苦參堿和氧化苦參堿能較好地分離，分離度在1.5以上。因此實驗選擇甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)為流動相。

考察了流動相流量分別為 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/min時，苦參堿和氧化苦參堿的分離情況。試驗結(jié)果表明，流動相流量過高色譜峰過于擁擠，分離效果差；而流動相流量過低，分析時間延長，色譜峰型也變差，最終選擇流動相流量為0.8 mL/min。在此條件下，100 mg/L的苦參堿和氧化苦參堿對照品溶液的色譜峰見圖1。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿對照品溶液色譜圖

2.3 標準工作曲線繪制

分別移取適量苦參堿和氧化苦參堿對照品儲備溶液于50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至標線，分別配制苦參堿和氧化苦參堿的質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200 mg/L 的系列標準工作溶液。在1.4條件下分別進樣分析。以待測物的質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，分別得到苦參堿的回歸方程為Y=29.210 2X-4.8763，r=0.999 8，線性范圍為 10～200 mg/L；氧化苦參堿的回歸方程為Y=22.660 7X-3.111 5，r=0.999 9，線性范圍為 10～200 mg/L。

2.4 檢出限和定量限

逐級稀釋苦參堿和氧化苦參堿對照品儲備溶液，直至各自響應(yīng)信號為噪聲10倍和3倍，分別記下此時溶液濃度，即取S/N=3時響應(yīng)值對應(yīng)的濃度為檢出限，S/N=10時響應(yīng)值對應(yīng)的濃度為定量限。最后得出苦參堿的檢出限為0.05 mg/L，定量限為0.2 mg/L；氧化苦參堿檢出限為0.1 mg/L，定量限為0.4 mg/L。

2.5 精密度試驗

在1.4儀器工作條件下對50 mg/L的苦參堿和氧化苦參堿標準使用液進行6次重復測定，結(jié)果見表1。由表1可知，苦參堿測定結(jié)果的相對標準偏差為1.32%，氧化苦參堿測定結(jié)果的相對標準偏差為1.08%。

表1 精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗

取適量苦參樣品，按1.2方法進行提取，在1.4條件下分別在 0，2，4，6，8，12，24 h 測定苦參堿和氧化苦參堿的含量，測定結(jié)果見表2。由表2可知，苦參堿和氧化苦參堿含量在24 h內(nèi)變動較小，7次測定結(jié)果的相對標準偏差分別為5.16%，1.60%，可見穩(wěn)定性較好。

表2 不同時間苦參堿和氧化苦參堿檢測結(jié)果

2.7 加標回收試驗

對某苦參樣品按1.2方法提取后，在1.4儀器條下測定，然后分別加入一定量的對照品溶液進行加標回收試驗，苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別見表 3、表 4。

表3 苦參堿回收試驗結(jié)果(n=6)

表4 氧化苦參堿回收試驗結(jié)果(n=6)

由表3、表4可知，苦參堿和氧化苦參堿的平均加標回收率分別為98.47%，97.89%，可見方法的準確度較高，滿足方法學要求。

2.8 樣品檢測

從不同藥店購到5份不同品牌的苦參藥材樣品，按1.2方法提取后進行測定，苦參堿和氧化苦參堿含量見表5。由表5可以看出，不同地區(qū)生產(chǎn)的苦參藥材樣品中，苦參堿和氧化苦參堿含量不同，來自?？荡笏幏慨a(chǎn)自陜西咸陽地區(qū)的苦參堿和氧化苦參堿含量最高。

表5 苦參樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)語

建立了反相液相色譜法同時檢測苦參中苦參堿和氧化苦參堿的含量，以甲醇-水-三乙胺溶液(體積比55∶45∶0.2)為流動相，分離度好。該方法操作簡單，干擾少，檢出限低，測定結(jié)果的精密度和準確度較高，可以在中藥生產(chǎn)加工企業(yè)進行應(yīng)用和推廣。

［1］ 馬長華，曹天海. HPLC法測定山豆根苦參堿的氧化苦參堿的含量［J］.藥物分析雜志，2000，20(6): 408-410.

［2］ 仇峰，何仲貴，李好枝，等.離子對反相高效液相色譜法測定兔血漿中氧化苦參堿含量［J］.沈陽藥科大學學報，2002，19(5):328-332.

［3］ 劉斌，李金亮，元英進.苦豆子種子中生物堿的分離及l(fā)ehmannine的結(jié)構(gòu)確定［J］.中草藥，2001，32(4): 293-293.

［4］ 徐麟，屈玟珊，黃琦.不同產(chǎn)地苦參藥材中4種活性成分含量測定［J］.廣東化工，2017，44(2): 67-69.

［5］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015: 203-203.

［6］ 白小紅，楊雪，陳璇.液相微萃取/后萃取-高效液相色譜法測定氧化苦參堿和苦參堿［J］.分析化學，2008，36(2): 109-113.

［7］ Fukuda E，Uesawa Y，Baba M，et al.Identi fication of the country of growth of Sophora flavescens using direct analysis in real time mass spectrometry (DART-MS)［J］.Nat Prod Commun，2014，9(11): 1 591-1 594.

［8］ 陳靜，梁生旺.苦參的成分及質(zhì)量分析研究進展［J］.廣東藥學院學報，2012，28(5): 569-572.

［9］ 馬鴻雁，周婉珊，褚夫江，等.苦參中黃酮類成分的高效液相指紋圖譜及5 種成分的含量測定［J］.中國中藥雜志，2013，38(16):2 690-2 695.

［10］ 孔令明.苦參總堿提取及其中苦參堿、氧化苦參堿分離、純化的研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2004。

［11］ 李弟灶，潘顯道，吳松.苦參堿類生物堿研究進展［J］.醫(yī)學研究通訊，2005，34(1): 65-66.

Determination of Matrine and Oxymatrine in Sophora Flavescens by Reverse Phase Liquid Chromatography

Hao Wen， Li Dandan， Yang Chao
(Qingdao City Center for Disease Control and Prevention, Qingdao Institute of Preventive Medicine, Qingdao 266033, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)04-0068-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.04.017

聯(lián)系人：郝文； E-mail: 645412635@qq.com

2017-04-12