響應(yīng)面法對光合細菌還原亞碲酸鹽條件的優(yōu)化

易馨+楊開智+童晉+李明學(xué)+謝鴻觀

摘要：以實驗室前期獲得的1株對亞碲酸鹽有還原能力的光合細菌——沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）為研究對象，采用響應(yīng)面法對其還原亞碲酸鹽的條件進行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以碲的還原率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken（BB）設(shè)計，利用Design-Expert軟件對響應(yīng)值進行4因素3水平下的多元二次回歸擬合分析，確定最佳還原條件為：菌種接種量8%（體積分數(shù)，下同），初始碲濃度63 mg/L，初始pH值6.2，接種后培養(yǎng)9 d，則亞碲酸鹽的還原率可達99.76%。反應(yīng)過程中還原條件的優(yōu)化，對后期利用微生物治理環(huán)境的碲污染具有參考價值。

關(guān)鍵詞：光合細菌；亞碲酸鹽；最佳還原條件；響應(yīng)面法；碲污染治理

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0217-04

碲（Te）是一種非金屬稀散元素，于1782年在金礦中發(fā)現(xiàn)[1]。碲及其化合物廣泛應(yīng)用于冶金、化工、電子、醫(yī)藥等行業(yè)，被譽為“現(xiàn)代工業(yè)、國防與尖端技術(shù)的維生素”“當代高技術(shù)新材料的支撐材料”[2]。隨著碲的廣泛應(yīng)用，對環(huán)境造成的污染也日益增加。

碲的化合物在很低的濃度水平都具有毒性，其中以亞碲酸鹽（TeO32-）的毒性最強，是污染環(huán)境的主要物質(zhì)之一。亞碲酸鹽具有很好的水溶性且易于進入生物體內(nèi)，其毒性遠比單質(zhì)碲的毒性強，主要是其具有氧化性[3]，而單質(zhì)碲不溶于水，常被認為無生物利用性。將污染物中易溶有毒的亞碲酸鹽還原成碲單質(zhì)，從而可以達到去除這種元素的目的。微生物的這種作用在環(huán)境碲污染的治理方面具有應(yīng)用前景。

響應(yīng)面分析法（response surface analysis methodology，RSM）是目前廣泛應(yīng)用的一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過多元二次回歸方程擬合多因子與響應(yīng)值間的關(guān)系進行模型預(yù)測，并可得到最佳優(yōu)化條件[4]。成都理工大學(xué)測試樓微生物實驗室前期獲得1株對亞碲酸鹽有還原能力的光合細菌——沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris），本研究對其還原亞碲酸鹽的影響條件進行系統(tǒng)研究，用響應(yīng)面法分析確定了最佳還原條件，對后期利用微生物治理環(huán)境中的碲污染問題具有指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1菌種

試驗菌種為實驗室前期儲藏的1株對亞碲酸鹽有還原能力的沼澤紅假單胞菌。

1.2供試培養(yǎng)基

培養(yǎng)基采用RCVBN液體培養(yǎng)基，其配方如下：DL-蘋果酸4.00 g，（NH4）2SO4 1.00 g，KH2PO4 1.36 g，K2HPO4·3H2O 1.24 g，MgSO4·7H2O 120 mg，CaCl2·2H2O 75 mg，EDTA 20 mg，維生素B1 1 mg，煙酸 1 mg，生物素 15 μg，微量元素 1 mL，雙蒸水 1 L。微量元素包括H3BO3 2.8 mg、ZnSO4·7H2O 240 μg、MnSO4·H2O 1.6 mg、Cu（NO3）2·3H2O 40 μg、Na2MoO4·2H2O 750 μg，雙蒸水 1 L。

1.3試驗方法

1.3.1單因素試驗優(yōu)化亞碲酸鹽還原條件

1.3.1.1菌種接種量的考察將初始碲濃度為60 mg/L的100 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0，分別按體積分數(shù)為1%、3%、5%、7%、9%、11%的接種量將在30 ℃下培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌接種至培養(yǎng)基中，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。

1.3.1.2初始碲濃度的考察將接種了5%沼澤紅假單胞菌的液體培養(yǎng)液置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d后將不同濃度的亞碲酸鈉溶液加入培養(yǎng)基中，使其初始碲濃度分別為20、40、60、80、100、120、140 mg/L，初始pH值均為7.0。

1.3.1.3初始pH值的考察將初始碲濃度為60 mg/L的100 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值分別為5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并將在30 ℃培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌按5%接入培養(yǎng)基中混合，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。

以上幾組培養(yǎng)基均培養(yǎng)8 d后，用滅菌的針筒分別抽取上述菌液10 mL于潔凈離心管中，置于高速離心機中離心分離（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm濾膜過濾，并測定濾液中剩余碲的濃度。

1.3.1.4接種后培養(yǎng)時間的考察將初始碲濃度為 60 mg/L 的500 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0，并將在30 ℃培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌菌株按5%接入培養(yǎng)基中混合，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 d時，分別用滅菌的針筒分別抽取菌液 10 mL 于潔凈離心管中，置于高速離心機中高速離心分離（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm濾膜過濾，并測定濾液中剩余碲的濃度。

1.3.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

對沼澤紅假單胞菌的接種量、初始碲濃度、初始pH值及接種后培養(yǎng)時間（分別記為A、B、C、D），每個因素取3個水平；以Te4+的還原率作為響應(yīng)值，記為R，進行Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計，建立數(shù)學(xué)模型，通過Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，預(yù)測最優(yōu)還原條件，并按照預(yù)測最優(yōu)還原條件重復(fù)試驗，與模型的預(yù)測值進行比較，驗證其有效性。

1.3.3碲還原率的測定

采用氫化物-原子熒光儀（HG-AFS）測定培養(yǎng)液中Te4+的濃度[5]。

[JZ]碲還原率=（A-B）/A×100%。

式中：A為初始碲濃度，mg/L；B為還原后培養(yǎng)基中Te4+濃度，mg/L。

2結(jié)果與分析

2.1細菌還原亞碲酸鹽現(xiàn)象

沼澤紅假單胞菌在未添加亞碲酸鈉的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，結(jié)果如圖1（右）所示，培養(yǎng)液由無色逐漸變成紅色，這是細菌正常培養(yǎng)的顏色。而沼澤紅假單胞菌在含亞碲酸鈉的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，結(jié)果見圖1（左），培養(yǎng)液顏色逐漸變?yōu)楹谏?，這是由于沼澤紅假單胞菌將Na2TeO3還原成黑色單質(zhì)碲的緣故。

2.2菌種接種量對亞碲酸鹽還原率的影響

在不同的菌種接種量條件下，沼澤紅假單胞菌對亞碲酸鹽的還原率存在明顯的差異，結(jié)果如圖2所示。隨著菌種接種量的增加，沼澤紅假單胞菌對碲的還原率明顯提高；當接種量達到5%時，還原率達到一個高值，為90.24%；隨后再增加菌種接種量，碲的還原率變化不大，由此推測，當菌種接種量低于5%時，菌株在培養(yǎng)基中的生長速度相對緩慢，嚴重影響了碲的還原率，當菌種接種量≥5%時，對亞碲酸鹽還原效果更好。

2.3初始碲濃度對亞碲酸鹽還原率的影響

沼澤紅假單胞菌在不同的初始碲濃度條件下培養(yǎng)，對碲的還原率如圖3所示。隨著初始碲濃度的增大，對碲的還原率呈現(xiàn)上升—下降的趨勢。碲的還原效果在亞碲酸鈉添加量低于 60 mg/L 時，碲還原率呈緩慢上升趨勢，達到最大值（9098%），說明菌株可忍受一定濃度的亞碲酸鹽，而未受到TeO32-的抑制且菌株活性良好。當初始碲濃度超過60 mg/L

時，隨著碲濃度的升高，其較高的毒性抑制了菌的活性，碲還原率逐漸降低。

2.4pH值對亞碲酸鹽還原率的影響

在不同的pH值條件下，菌株還原碲的效果如圖4所示。當pH值為6.5～7.5時，碲還原效果較好，還原率為 90.09%～91.13%，因此試驗中采用的沼澤紅假單胞菌適宜的生長代謝pH值范圍為6.5～7.5[6]。當pH值<6或pH值>8時，碲還原率相對較低?？梢?，過高或過低的pH值環(huán)境會直接影響菌的酶活性，抑制其生長和代謝能力，不利于菌株對亞碲酸鈉的還原。

2.5接菌種后培養(yǎng)時間對亞碲酸鹽還原率的影響

沼澤紅假單胞菌接種后隨著培養(yǎng)時間的變化，碲的還原率也存在明顯的變化，結(jié)果如圖5所示。接種培養(yǎng)的前7 d，隨著菌的生長，培養(yǎng)液中的TeO32-濃度降低，碲還原率迅速增長。在培養(yǎng)后8 d，對亞碲酸鹽的還原率達到一個高值，為89.09%；隨后，隨著時間的推移，碲還原率達到穩(wěn)定期。這一[JP3]趨勢與細菌在亞碲酸鹽的脅迫下菌體的生長曲線相符合，說明沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽可能依賴菌體生物量的生長。

2.6Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗與響應(yīng)面優(yōu)化還原條件

2.6.1模型的建立及顯著性檢驗

將菌種接種量、初始碲濃

2.6.3最佳還原條件的預(yù)測與檢驗

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽的條件為：菌種接種量8%，初始碲濃度63.29 mg/L，初始pH值 6.23，接種后培養(yǎng)9 d，在此條件下，亞碲酸鹽的還原率在理論上可達107.38%?？紤]到實際可操作性，將還原條件修正為：菌接種量8%，初始碲濃度63 mg/L，初始pH值 6.2，接種培養(yǎng)9 d。為驗證試驗結(jié)果的可靠性，在最優(yōu)的還原條件下進行試驗，6組平行試驗的平均值為99.76%，試驗結(jié)果與模型復(fù)合良好。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽的條件參數(shù)準確可靠，具有利用價值。

3結(jié)論與討論

利用微生物將溶解性強的亞碲酸鹽還原成溶解性差、無毒的碲單質(zhì)的報道有很多[7-10]，如Lloyd等利用大腸桿菌（Escherichia coli）對亞碲酸鹽還原，發(fā)現(xiàn)碲單質(zhì)積累在靠近細胞膜位置[7]；Klonowska等發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）能夠在厭氧條件下還原亞碲酸鹽[9]。目前，對細菌還原亞碲酸鹽影響條件的系統(tǒng)研究還較少。通過單因素試驗和中心組合設(shè)計試驗，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化光合細菌還原亞碲酸鹽影響條件，得到優(yōu)化還原條件為：菌接種量8%，初始碲濃度63 mg/L，初始pH值 6.2，接種后培養(yǎng)9 d，在此條件下，亞碲酸鹽的還原率可達99.76%。在此試驗范圍內(nèi)建立起的二次線性回歸模型準確有效，對試驗擬合較好。說明本研究對后期利用微生物治理環(huán)境中的碲污染問題具有重要意義。

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