吉林省稻瘟病菌無(wú)毒基因鑒定及分析

姜兆遠(yuǎn) 劉曉梅 李莉 鄒曉威 任金平 袁媛 張鐵新 王繼春 吳憲+朱峰 孫輝

摘要：為了明確無(wú)毒基因在吉林省不同稻區(qū)的分布及變異情況，將PCR檢測(cè)技術(shù)與接種鑒定技術(shù)相結(jié)合，分析2014年吉林、長(zhǎng)春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源等稻區(qū)的24株優(yōu)勢(shì)單孢菌株中無(wú)毒基因的情況。結(jié)果表明，24個(gè)優(yōu)勢(shì)稻瘟病菌株含無(wú)毒基因的比率較高，5個(gè)稻區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株100%含有無(wú)毒基因，松原稻區(qū)1株優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)CR檢測(cè)到無(wú)毒基因，但對(duì)[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]單基因品系IRBL9-W仍有致病性，說(shuō)明該菌株無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其他PCR結(jié)果均與接種結(jié)果相一致。

關(guān)鍵詞：稻瘟病；抗病基因；無(wú)毒基因；；接種鑒定；PCR檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0027-03

稻瘟病是世界范圍內(nèi)的主要水稻病害之一。在我國(guó)各水稻栽培地區(qū)均經(jīng)常發(fā)生稻瘟病，吉林省也是稻瘟病經(jīng)常流行的主要地區(qū)，如果不防治可導(dǎo)致稻谷損失30%以上，局部田塊甚至出現(xiàn)絕收的情況[1]。稻瘟病的病原為稻巨座殼（Magnaporthe oryzae B.C.Couch），隸屬于子囊門(mén)巨殼屬。其無(wú)性階段為稻梨孢（Pyricularia oryzae Cavara），屬于子囊菌無(wú)性型梨孢屬。稻瘟病是完全符合基因?qū)蚣僬f(shuō)的病害[2-3]，稻瘟病的發(fā)生程度取決于田間菌群的無(wú)毒基因類(lèi)型，當(dāng)種植的水稻所含抗瘟基因與田間菌群所含的無(wú)毒基因相對(duì)應(yīng)時(shí)，水稻則表現(xiàn)抗病；若水稻的抗病基因與菌群的無(wú)毒基因不對(duì)應(yīng)，則表現(xiàn)感病，在適宜的氣候條件下極易造成災(zāi)變。種植抗瘟品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但一個(gè)抗病品種在推廣3～5年后就失去對(duì)當(dāng)?shù)氐疚敛【目剐訹4]，主要是由稻瘟病菌變異及其上升為優(yōu)勢(shì)菌群所致。引起稻瘟病菌變異的因素很多[5-10]，但田間稻瘟病致病性的變異實(shí)質(zhì)是田間無(wú)毒基因功能的缺失或獲得[11]。吉林省是優(yōu)質(zhì)粳稻主產(chǎn)區(qū)，粳稻種植面積超過(guò)70萬(wàn)hm2[12]，稻瘟病的控制對(duì)我國(guó)優(yōu)質(zhì)米的保障尤為重要。

截至2015年3月，已至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共84個(gè)主效基因，其中24個(gè)基因已被成功克隆[13]，抗瘟基因中[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗譜較廣，對(duì)來(lái)自13個(gè)國(guó)家的43個(gè)稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性[14]，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因已被克隆[15]，因此明確吉林省稻瘟病菌無(wú)毒基因分布情況對(duì)吉林省稻區(qū)水稻品種布局具有較好的指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1供試品種

以單基因等基因系品種IRBL9-W、蒙古稻（感病對(duì)照）為供試材料。

1.2稻瘟病樣采集及菌株篩選

2014年從吉林、長(zhǎng)春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源各稻區(qū)采集穗頸瘟標(biāo)樣，通過(guò)振蕩法分別獲得10個(gè)單孢菌株，從中選出3株菌絲生長(zhǎng)較好、產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株，共獲得24個(gè)稻瘟病優(yōu)勢(shì)菌株，所有菌株均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害課題組保存。

1.3菌絲的培養(yǎng)及孢子收集

取4塊直經(jīng)約為5 mm的斜面培養(yǎng)稻瘟病菌菌塊于PDA平板上，27 ℃條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)5～7 d，無(wú)菌條件下洗去表面菌絲，將菌絲[HJ1.4mm]收集到2 mL的離心管中同時(shí)放入2粒玻璃珠，置于-80 ℃冰箱中保存，將洗掉菌絲的平板進(jìn)行12 h—12 h光—暗培養(yǎng) 3 d，用無(wú)菌水洗滌并稀釋孢子懸浮液終濃度為2×105個(gè)/mL，用于接種。

1.4接種檢測(cè)

將IRBL9-W播于16穴苗盤(pán)內(nèi)，同時(shí)播2穴蒙古稻，在稻[CM（25]苗3葉期時(shí)進(jìn)行噴霧接種。接種在溫室內(nèi)進(jìn)行，接種后于[CM）][LM]24～28 ℃暗箱保濕16 h，6～7 d后進(jìn)行調(diào)查，采用0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病率[16]。設(shè)3次重復(fù)，蒙古稻發(fā)病率達(dá)5級(jí)及以上。

1.5稻瘟病菌28 S rDNA檢測(cè)及分析

將-80 ℃超低溫冰箱保存的菌株置于液氮中，2 min后將樣品置于高通量組織細(xì)胞研磨破碎儀中進(jìn)行破碎。DNA提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

根據(jù)NCBI上公布的稻瘟病菌28S核糖體RNA基因（GenBank：KM484999.1）設(shè)計(jì)引物28SF-TAGGACGCCGAACCTCTGTA，28SR-GGTATTACGCAACGGGCTA；根據(jù)NCBI上公布的無(wú)毒基因（GenBank：KM004023.1）起始密碼子前1 170 bp到起始密碼子后254 bp設(shè)計(jì)引物 F-GAGATTGTCAGAGAAGTCCGA，R-GCTTATTTACCCATCATCGC。

反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；隨后30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃ 變性1 min，55 ℃（引物52 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s（引物90 s）；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳成像分析。

2結(jié)果與分析

2.1接種檢測(cè)分析

將24株菌株孢子懸液均勻的噴霧接種在IRBL9-W和蒙古稻葉片上，結(jié)果如表1所示，24株菌株均能侵染蒙古稻，且病級(jí)都達(dá)5級(jí)及以上。吉林稻區(qū)的2號(hào)菌株、通化稻區(qū)9號(hào)菌株和松原稻區(qū)的16號(hào)菌株均能侵染IRBL9-W，病級(jí)達(dá)到4級(jí)水平；松原稻區(qū)的18號(hào)菌株在IRBL9-W水稻上產(chǎn)生病斑達(dá)到5級(jí)水平，其他菌株均不能侵染IRBL9-W。根據(jù)基因?qū)蚣僬f(shuō)，未侵染水稻的稻瘟菌含有對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因，侵染水稻的菌株不含有對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因，因此，24個(gè)菌株中有20個(gè)菌株含有無(wú)毒基因。其中長(zhǎng)春、四平、延邊、白城及遼源等稻區(qū)的供試菌株都含有無(wú)毒基因，而吉林、通化及松原分別檢測(cè)到1、1、2株不含有無(wú)毒基因[WTBX][STBX]AvirPi9[WTBZ][STBZ]的菌株。

2.2稻瘟病菌28S rDNA檢測(cè)及無(wú)毒基因基因分析

根據(jù)稻瘟病菌28S rDNA序列設(shè)計(jì)引物檢測(cè)24個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株的DNA，所有供試菌株均擴(kuò)增到342 bp大小的特異性片段（圖1），說(shuō)明該方法提取的稻瘟病菌DNA完全可以用于稻瘟病菌無(wú)毒基因的PCR檢測(cè)分析。

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增24個(gè)菌株的無(wú)毒基因，經(jīng)檢測(cè)吉林地區(qū)2號(hào)菌株、通化地區(qū)株9號(hào)菌株、松原地區(qū)16號(hào)菌株未擴(kuò)增出目的條帶，與接種鑒定結(jié)果一致，而松原的18號(hào)菌株擴(kuò)增出目的條帶，與接種鑒定結(jié)果不一致，說(shuō)明18號(hào)菌株無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變。其他菌株均擴(kuò)增到 1 425 bp 大小的目的條帶（圖2），PCR檢測(cè)結(jié)果與接種鑒定結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

接種鑒定與PCR檢測(cè)結(jié)果表明，長(zhǎng)春、四平、延邊、白城及遼源稻區(qū)供試稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌株均含有無(wú)毒基因且[CM（25]不能侵染IRBL9-W葉片；吉林、通化和松原稻區(qū)分別有[CM）]

1、1、2株稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌株不存在無(wú)毒基因結(jié)構(gòu)且能夠侵染 IRBL9-W 葉片；松原稻區(qū)有1株菌株存在基因結(jié)構(gòu)但可以侵染IRBL9-W葉片，具體原因需要進(jìn)一步研究分析。

3.2討論

本研究從2014年吉林、長(zhǎng)春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源各稻區(qū)栽培稻上分離病菌鑒定了24株稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌株。吉林省位于中緯度歐亞大陸的東側(cè)，地處長(zhǎng)白山脈，東部為山區(qū)、半山區(qū)，中部為松遼平原區(qū)，西部為草原區(qū)。從東南向西北由濕潤(rùn)氣候過(guò)渡到半濕潤(rùn)氣候再到半干旱氣候，有明顯的季節(jié)變化和地域差異[17]。根據(jù)地域特點(diǎn)吉林省稻區(qū)可以劃分為平原稻作區(qū)、半山區(qū)稻作區(qū)、山區(qū)冷涼稻作區(qū)及高

寒山區(qū)稻作區(qū)，不同稻區(qū)活動(dòng)積溫存在顯著差異，水稻品種覆蓋極早熟至晚熟所有熟期的品種。根據(jù)各地區(qū)生產(chǎn)水平，吉林省可分為8個(gè)稻作區(qū)域[18]，所分離的8個(gè)地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌株基本代表了吉林省稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌群遺傳特點(diǎn)，分析這些菌株的無(wú)毒基因，對(duì)了解吉林省整體稻瘟病菌菌群的變化和特點(diǎn)有重要的參考價(jià)值。

2014年吉林省各稻區(qū)整體稻瘟病菌無(wú)毒基因存在頻率較高。松原地區(qū)3株優(yōu)勢(shì)菌株中存在1株優(yōu)勢(shì)菌株含無(wú)毒基因，該菌株分離自吉粳88，由于吉粳88種植面積逐年縮小，該優(yōu)勢(shì)菌株群可能存在下降的趨勢(shì)。吉林、通化及松原稻區(qū)PCR未檢測(cè)到無(wú)毒基因的菌株均分離自稻花香品種。稻花香2號(hào)品種目前對(duì)吉林省稻瘟病菌具有一定的抗性，但在稻田中已經(jīng)出現(xiàn)零星發(fā)病的稻穗，稻花香種植

面積在吉林省各稻區(qū)呈逐年增加的趨勢(shì)，因此該稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)菌群富集可能是吉林省未來(lái)稻瘟病暴發(fā)的原因。所得結(jié)果對(duì)含[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗病基因水稻育種及推廣具有重要的參考價(jià)值。

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