黑蕓豆中花色苷的提取工藝優(yōu)化試驗

趙雯俊++趙煜午

摘要 本研究對黑蕓豆的花色苷色素提取工藝進行研究。將黑蕓豆放在不同乙醇濃度、不同溫度、不同時間、不同鹽酸濃度、不同料液比的條件下，進行5類單因素試驗，并通過L16（45）正交表進行5因素4水平優(yōu)化試驗，確定黑蕓豆中花色苷提取率最佳工藝。結果表明：乙醇濃度70%、料液比1∶20、提取溫度50 ℃、提取時間45 min、0.5% HCl溶液為最佳提取工藝。

關鍵詞 黑蕓豆；花色苷；提取工藝

中圖分類號 TS201.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）16-0244-04

Abstract This paper studied the extraction of anthocyanin pigment from black kidney bean.By different types of ethanol concentration，temperature，time and soaking liquid，5 types of the single factors and L16（45）orthogonal design were done to study the best range of extracting.The results showed that the optimum conditions were as follows：70% ethanol concentration and 0.5% hydrochloric acid as soaking liquid，rate of solid 1∶20，temperature 50 ℃，time 45 min.

Key words black kidney bean；anthocyanin pigment；extraction process

食用色素按其來源分為天然色素和化學合成色素兩大類[1]。隨著醫(yī)學毒理學和生物學研究的不斷深入，人們對合成食用色素有了新的認識，發(fā)現(xiàn)曾允許使用的人工合成食用色素中，多數(shù)對人體都有不同程度的傷害，有的甚至有致癌或誘發(fā)染色體變異的作用[2]。因此，世界各國已先后禁止使用多數(shù)種類的合成食用色素，由此天然色素的研究引起了人們的興趣。目前，國內(nèi)的科技工作者已經(jīng)從五味子、紫蘇、篤斯、火棘等果蔬中提取分離出花色苷天然食用色素[3]。相關研究表明，該類色素對人類許多疾病有預防和治療作用，因而在食品、化妝品、醫(yī)藥領域有著巨大的應用潛力[4]?，F(xiàn)代營養(yǎng)素研究進一步發(fā)現(xiàn)，黑色食品中的天然花色苷類物質(zhì)有極強的防止活性氧危害和抗氧化作用，可消除機體代謝過程中產(chǎn)生的過多自由基，具有延緩衰老、預防各種疾病等功能[5]。黑蕓豆富含花色苷類化合物，是天然色素的重要來源。本試驗擬采用溶液萃取法從黑蕓豆皮中提制花色苷天然色素并研究探討其功能特性，為其下一步開發(fā)及應用提供一定的理論依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料有黑蕓豆（購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場）、乙醇、鹽酸、花色苷標準樣品（分析純）。

供試儀器與設備：FC204型電子分析天平（分度值0.000 1 g，上海民橋精密科學儀器有限公司）；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；722 s可見光分光光度計（上海分析儀器總廠制造）；DS-1型高速組織搗碎機（上海標本模型廠制造）；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；TD4A臺式離心機（長沙英泰儀器有限責任公司）。

1.2 花色苷含量測定方法

1.2.1 花色苷最大吸收波長的確定。取1 g標準花色苷樣品溶于去離子水，定容至100 mL，取少量加入比色杯，用去離子水調(diào)零，分別在500、505、510、515、520、525、530、535、540 nm處測定吸光度值，以確定最大吸收波長[7]。

1.2.2 標準曲線的制作。用無水乙醇配制濃度為0.5 mg/mL的標準液。分別移取花色苷標準液1、2、3、4、5、6、7 mL，用無水乙醇定容至10 mL，以無水乙醇溶液作空白，利用722 s可見光分光光度計測定最大吸收波長處（510 nm）的吸光值。繪制花色苷標準溶液的標準曲線，并計算出回歸方程（A—510 nm處吸光度，C—花色苷標樣濃度）[8]。

1.2.3 黑蕓豆豆皮中花色苷的提取方法。先洗滌黑蕓豆，再將黑蕓豆放到燒杯中，加水剛好浸沒，將燒杯放入水浴鍋中40 ℃水浴5～6 min[9]，此時黑蕓豆皮起褶，水浴的水顏色微黑，相對透明，將起褶的黑蕓豆放入小桶中，用鈍物壓碎蕓豆，此時豆與皮較易分離，用水浸泡，能先分離出一部分豆皮，沉底的豆子與豆皮搓落，然后將豆皮放入45 ℃鼓風干燥箱中干燥2～3 h，然后放入組織粉碎機粉碎，用分析天平準確量取1 g豆皮粉末[10]，加入適當料液比的提取劑提取，取提上清液于離心管中以3 000 r/min離心10 min，再取上清液于100 mL容量瓶定容，取少量于比色杯，用提取液調(diào)零，于510 nm處測吸光度值。根據(jù)花色苷標準曲線計算花色苷含量[11]。

花色苷提取率（%）=[（A-0.000 2）/0.304 3×V1/m樣]×100

式中，A—測得的吸光度值；V1—離心后的上清液定容的體積，mL；m樣—測得干燥的黑蕓豆皮質(zhì)量，mg。

1.3 提取工藝的優(yōu)化試驗設計

通過研究浸提液乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度、鹽酸濃度各單因素對浸提效果的影響，確定影響較大因素的水平范圍，然后進行正交試驗確定最佳提取工藝條件[12]。評價指標是在最大吸收波長下測吸光度，并計算得出色價。

1.3.1 單因素試驗設計。①浸提液乙醇體積分數(shù)對花色苷提取的影響。稱取1 g種皮，浸提乙醇體積分數(shù)20%、30%、40%、50%、60%、70% 6個水平（配好后各留取20 mL樣液取15 mL做比色標準溶液），料液比1∶15，提取溫度40 ℃，浸提30 min，取上清液離心3 000 r/min，10 min取清液定容100 mL放入分光光度計比色[13]。②料液比對花色苷提取的影響。稱取1 g種皮，浸提試劑0.1%HCl 30%、乙醇溶液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 6個水平，回流浸提30 min，取上清液離心3 000 r/min，10 min，取上清液定容100 mL，測吸光度值。③提取時間對花色苷提取的影響。用0.1%HCl、30%乙醇溶液在60 ℃、料液比1∶15分別回流提取15、30、45、60、75、90 min取上清液離心3 000 r/min，10 min，取清液定容100 mL放入分光光度計比色。④提取溫度對花色苷提取的影響。稱取1 g種皮，0.1%HCl、30%乙醇溶液浸提，料液比1∶15分別在20、30、40、50、60、70 ℃回流提取30 min。取上清液離心3 000 r/min，10 min，取上清液定容100 mL放入分光光度計比色。⑤鹽酸濃度對花色苷提取的影響。稱取1 g種皮，料液比1∶15，0.1%HCl溶液、0.5%HCl溶液、1.0%HCl溶液、1.5%HCl溶液、2.0%HCl溶液、2.5%HCl溶液6個水平，浸提30 min。取上清液離心3 000 r/min，10 min，取清液定容100 mL放入分光光度計比色。

1.3.2 正交試驗。在單因素的基礎上，以乙醇、鹽酸溶液作浸提劑，進行浸提時間、浸提溫度和料液比5因素4水平L16（45）正交試驗，優(yōu)化提取工藝。正交試驗各因素水平設置見表1。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

最大吸收波長的確定見圖1，可以看出在510 nm處黑蕓豆中花色苷有最大吸收波長。

2.2 標準曲線的制作

以原花色苷為標準樣，標準曲線結果見圖2?；ㄉ瘴舛汝P于濃度的線性回歸方程為：y=0.304 3x+0.000 2，相關系數(shù)為0.996 3。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 浸提液乙醇體積分數(shù)對花色苷提取的影響。花色苷易溶于水更易溶于乙醇，在水中加入適當?shù)囊掖伎梢栽黾踊ㄉ盏奶崛÷蔥14]。由圖3可知，當乙醇濃度在20%～50%時，提取率呈上升趨勢，當乙醇濃度在50%～70%時下降，最大提取濃度為50%，其可能的原因是適當?shù)囊掖加欣诨ㄉ盏娜芙猓^量的乙醇可能使花色苷變性或者抑制花色苷的溶解。

2.3.2 提取時間對花色苷提取的影響。由圖4可知，當提取時間在15～60 min時，提取率呈上升趨勢，當提取時間超過60 min，提取率基本不變或者緩慢下降。其可能的原因是在60 min時花色苷基本已經(jīng)提取完全，當提取時間超過60 min，可能導致花色苷被破壞或者沒有能夠被提取液提取的花色苷[15]。

2.3.3 料液比對花色苷提取的影響。由圖5可知，適當增加溶劑的量有利于色素溶出，可以提高花色苷得率，料液比為1∶20（g/mL）時浸提效果最好。繼續(xù)增加溶劑的用量時，花色甘得率卻逐漸下降，這可能是由于過多的溶劑降低了花青素濃度，增加了溶解的雜質(zhì)。

2.3.4 提取溫度對花色苷提取的影響?；ㄉ赵诟邷叵虏环€(wěn)定，而低溫不利于花色苷溶解。由圖6可知，當提取溫度在20～40 ℃時，提取率呈上升趨勢，當溫度在40～70 ℃時呈下降趨勢，40 ℃時最大。其原因可能是花色苷在40 ℃時提取率最大，超過40 ℃其化學結構被破壞導致提取率下降。

2.3.5 鹽酸濃度對花色苷提取的影響。由圖7可知，當鹽酸濃度在0～1%時，花色苷提取率呈上升趨勢，當鹽酸濃度在1.0%～2.5%時，花色苷提取率呈下降趨勢，鹽酸濃度為1%時最大。其可能的原因是黑蕓豆豆皮細胞在1%的鹽酸濃度下細胞壁被破壞，有利于花色苷的提取，而當鹽酸濃度上升，可能導致花色苷被鹽酸破壞或者從豆皮細胞中提取出干擾測定的物質(zhì)，從而導致提取率降低。

2.4 正交試驗結果分析

由表2可知，黑蕓豆色素的提取效果影響因素為A>E>B>C>D，即乙醇濃度>鹽酸濃度>料液比>提取溫度>提取時間。正交試驗得到的最佳組合為A4B3C2D1E2，即乙醇濃度70%、料液比1：20、提取溫度50℃、提取時間 45 min、鹽酸濃度0.5%HCl溶液為最佳提取組合。

3 結論與討論

利用分光光度法測黑蕓豆豆皮提取液的吸光度，得到的數(shù)據(jù)比較理想，而且分光光度法操作簡便，儀器檢測費用較低，適用于大多數(shù)檢測機構，食品生產(chǎn)企業(yè)應用分光光度法進行檢測更具有現(xiàn)實可行性。同時本次試驗提取劑只是酒精、鹽酸和水，沒有選取有害試劑和放射性試劑，在保護環(huán)境的同時也保證了試驗人員的身心健康。

由5因素4水平正交試驗數(shù)據(jù)表極差分析可知，黑蕓豆色素的提取效果影響因素為乙醇濃度>鹽酸濃度>料液比>提取溫度>提取時間。

4 參考文獻

[1] KREIMEYER J，PETEREIT F，NAHRSTEDT A. Separations of flavan-3-ols and dimeric proanthocyanidins by capillary electrophoresis [J].Plant Medica，1998，64：6367.

[2]杜宏等.蓮房原花青素對人肝癌細胞HepG2生長及凋亡的作用[J].實用醫(yī)學雜志，2008，24（6）：891.

[3] ARIGA T，HAMANO M.Radical Scavenging Action and its Mode in Procyanidins B-1 and B-3 from Azuki Beans to Peroxyl Radicals [J].Agric Biol Chem，1990，54（10）：2499-2504.

[4] BAHORUN T，AUMJAUD E，RAMPHUL H，et al.Phenolic constituents and antioxidant capacities of Crataegus monogyna（Hawthorn）callus extra-cts [J].Nahrung/Food.47，2003（3）：191-198.

[5] 張長貴，董加寶，王禎旭.原花色素及其開發(fā)應用[J].食品與藥品，2006，5（8）：13-17.

[6] 梨源倩.食品理化檢驗保健食品中原花青素的測定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：72-73.

[7] 楊玉紅，張慧霞.葡萄原花青素的生物學活性研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2008（5）：40-42.

[8] 姜貴全，方桂珍.地榆根中花色苷的提取工藝[J].東北林業(yè)大學學報，2008，36（1）：41-42.

[9] 丁麗，王敏，杜連祥.荔枝核中黃烷-3-醇的鑒定及花色苷的提取[J].食品研究與開發(fā). 2006，27（7）：67-73.

[10] 劉睿，謝筆鈞，潘思軼，等.高粱種子外種皮中原花青素提取、純化及其抗氧化活性的研究[J].中國糧油學報，2003，18（4）：43-47.

[11] 胡靜.玫瑰花總原花青素的分離、純化及分析[D].杭州：浙江大學，2006.

[12] 董瑞霞，李立祥，張桂敏，等.茶籽殼中原花表素提取工藝參數(shù)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2008（2）：243-245.

[13] 張興茂，林松毅，劉靜波，等.長白山篤斯越桔果實原花青素浸提工藝的研究[J].食品科學，2007（28）：186-188.

[14] 羅寶生，戴萬生.大黃花色苷提取純化工藝研究[J].云南中醫(yī)藥雜志，2007，28（1）：36-38.

[15] 于立梅，趙謀明，李瑩.基于響應面法的馬尾松樹皮花色苷提取及抗氧化性研究[J].科研開發(fā)，2007，23（1）：64-68.