魚類促性腺激素基因研究進展

呂紹巾， 張?zhí)烀瘢?趙 文

(大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院， 大連 116021)

魚類促性腺激素基因研究進展

呂紹巾， 張?zhí)烀瘢?趙 文

(大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院， 大連 116021)

促性腺激素在魚類性成熟及排卵過程中起著至關(guān)重要的作用，而對于魚類促性腺激素的種類的爭論也在1975年之后逐漸平息。普遍認為，魚類的兩種促性腺激素亞基GtHI和GtHII，其生化結(jié)構(gòu)與生物學特征與哺乳動物的促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)亞基相類似。隨著分子生物學的逐漸發(fā)展，對促性腺激素的研究也越來越深入。綜述了促性腺激素的基礎(chǔ)生物學研究概況，包括其生化結(jié)構(gòu)、生理功能以及調(diào)控機制等，同時總結(jié)了目前硬骨魚類促性腺激素基因克隆現(xiàn)狀，以及魚類促性腺激素的定量分析和重組表達，為魚類的繁育生理研究工作提供方便，為進一步探究促性腺激素的作用機理奠定基礎(chǔ)。

促性腺激素；基因；表達；魚類

魚類的性成熟及產(chǎn)卵過程受腦垂體-性腺激素調(diào)節(jié)控制，促性腺激素(gonadotropic hormone，GtH)是在腦-垂體-性腺軸中十分重要的激素，它的分泌和合成涉及信號轉(zhuǎn)導、協(xié)調(diào)基因表達、蛋白質(zhì)翻譯、修飾、折疊和最后分泌等[1]。隨著分子生物學的逐漸發(fā)展，越來越多的研究把焦點放在了魚類的繁殖生理方向上，對魚類促性腺激素的研究逐漸深入。而激素調(diào)控是一個十分復(fù)雜的過程，一種激素的改變很有可能會引發(fā)其他激素的變化。許多因素都可以影響到硬骨魚類的生殖發(fā)育，其中由垂體分泌的GtH起主要作用。有研究表明，生長激素的分泌受到促性腺激素含量的影響，在金魚(Carassiusauratus)體內(nèi)，生長激素對卵泡的發(fā)育也起到了一定程度上的調(diào)節(jié)作用。因此，進一步探究硬骨魚類的促性腺激素在生殖周期調(diào)控作用中的分子機制，從而完善魚類繁殖內(nèi)分泌的研究勢在必行。同時也為魚類人工繁殖提供催產(chǎn)途徑奠定基礎(chǔ)。本文綜述了魚類GtH的結(jié)構(gòu)和功能、GtH基因的克隆和表達研究進展，目的是為了魚類的繁育生理研究工作提供參考。

1 促性腺激素的基礎(chǔ)生理學研究

促性腺激素是由脊椎動物腦垂體分泌的促進性腺發(fā)育和繁殖的主要內(nèi)分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormon，LH)、促甲狀腺素(throtroid stimulating horme, TSH)共同構(gòu)成的糖蛋白激素家族。由垂體分泌的促性腺激素的生成和釋放受促黃體生成素釋放激素(LH-RH)和促卵泡激素釋放激素(FSH-RH)直接調(diào)控(圖1)。作為FSH和LH的靶腺產(chǎn)物，性激素也同樣可以通過反饋調(diào)節(jié)來影響垂體或下丘腦的分泌功能。

細胞外液中的促性腺激素與靶器官細胞表面的糖蛋白激素受體具有很強的親和力和特異性。受體與激素的相互作用會誘導受體發(fā)生一定的構(gòu)象改變，進一步來激活細胞膜相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)的信號系統(tǒng)。促性腺激素的受體通常認為局限于性腺細胞。而FSH受體和LH受體表達于不同的細胞，F(xiàn)SH受體表達于卵巢顆粒細胞和精巢的支持細胞；而LH受體存在于輸卵管、大腦、子宮內(nèi)膜和基層中。在卵巢中，LH受體在分化的顆粒細胞、黃體、卵泡膜細胞和精巢細胞中有所表達。大多數(shù)學者認為，促性腺激素作用于性腺的主要信使是環(huán)磷酸腺苷(cAMP)。LH和FSH受體是一組鳥苷三磷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白或G蛋白偶聯(lián)在一起，這種受體可以激活蛋白激酶A系統(tǒng)。促性腺激素與受體形成復(fù)合物后,導致連在α亞單位上的鳥苷二磷酸被GTP替代，引起G蛋白的α亞單位從βγ復(fù)合體上解離。游離的α亞單位與腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合，將腺苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP,細胞內(nèi)cAMP水平因而增加，蛋白激酶A從而被激活。在特異的絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化作用下，蛋白激酶A可以調(diào)節(jié)許多細胞內(nèi)蛋白的功能。

圖1 腦-垂體-性腺調(diào)節(jié)機制

Fig 1 Hypothalamus-Pituitary-Gonad regulating mechanism

LH和FSH通過卵巢內(nèi)顆粒細胞和卵泡膜細胞，以及精巢的支持細胞和間質(zhì)細胞等細胞膜表面的促性腺激素受體而發(fā)揮作用。正常情況下，LH和FSH可以相互協(xié)同來對性腺發(fā)生作用，同時還需要其他激素進行協(xié)同。FSH通過增加LH受體的數(shù)目來加強作用，曲細精管的發(fā)育從而得到刺激，進而可以參與一些激素的生成，誘導精子的發(fā)生。在卵巢中的FSH可以刺激卵泡顆粒細胞的有絲分裂，生成卵泡細胞。隨著卵泡的生長，LH受體在FSH的誘導下進一步的生成，因此卵泡能和兩種促性腺激素相結(jié)合，來刺激卵母細胞發(fā)育和卵子發(fā)生。來刺激卵母細胞的發(fā)育和卵巢卵泡內(nèi)各種細胞的生長發(fā)育，促進卵子的成熟，活化顆粒細胞內(nèi)的芳香酶，使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。在LH的配合下，F(xiàn)SH還能夠促使卵泡細胞分泌其他激素。在精巢中，生精上皮發(fā)生和精子成熟受FSH的調(diào)控。LH在卵巢中可與FSH相協(xié)同，從而促進卵泡最后成熟并分泌甾體激素，觸發(fā)排卵并促進黃體形成、維持其功能。LH在精巢中主要作用于間質(zhì)細胞，促進睪酮的生成。在FSH的作用下，促進雄激素在精巢內(nèi)的運轉(zhuǎn)和增加曲細精管內(nèi)睪酮含量，有利于共同發(fā)揮生精作用。促性腺激素可單獨地或協(xié)同地或頡頏地作用于性腺，支配生殖細胞成熟、性激素分泌和性腺其他活動，如果沒有這些促性腺激素的作用，性腺可發(fā)生萎縮[2]。腦垂體前葉促性腺激素的分泌，受丘腦下部促性腺激素釋放因子的調(diào)節(jié)。另一方面，由性腺分泌的激素反過來又影響丘腦下部和腦垂體前葉的機能，因此丘腦下部、垂體前葉和性腺三者之間有著復(fù)雜的內(nèi)分泌相關(guān)現(xiàn)象。

2 魚類促性腺激素基因克隆研究

在早期研究中，大多數(shù)學者認為魚類只有一種類似于LH的GtH細胞。隨著對魚類GtH研究的不斷深入，20世紀80年代在大麻哈魚(Oncorhynchusketa)中成功分離出了兩種GtH，其化學性質(zhì)完全不同，于是將其命名為GtHI和GthII。隨后通過分子克隆和蛋白純化，在銀大麻哈魚、金槍魚(Thunnusthynnus)、鯉(Cyprinuscarpio)、真鯛(Chrysophrysmajor)等20余種魚類中分離出了兩種GtH，其化學結(jié)構(gòu)和免疫活性成分與GtHI和GtHII類似，并有研究通過系統(tǒng)分析兩種GtHI的β亞基編碼區(qū)核酸基與哺乳動物的FSHβ亞基非常接近，GtHII的β亞基與哺乳動物的LHβ亞基接近，因此將魚類的GtHI和GtHII分別歸類為FSH激素和LH激素。它們都是以非共價鍵相連接的α和β兩個亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu)，其中α亞基相對保守，兩種激素的組成相同，而具有特異性的β亞基的氨基酸組成明顯不同，具有特定的生物學作用。GtH的亞基屬于半胱氨酸結(jié)家族，每一個亞基由大約100個氨基酸構(gòu)成，并且包含著保守的半胱氨酸殘基，這種殘基通過硫鍵以0-或者N-L與寡糖鏈相連接[3]。GtHα亞基被所有腦垂體糖蛋白共享，因此在進化的過程中具有更高的選擇性壓力。而對于特異性的β亞基，F(xiàn)SH和LH的保守程度也有所不同。在褐石斑魚(Epinephelusbruneus)體內(nèi)，fshβ亞基不含有任何的N-糖基化位點，而LHβ亞基含有1個N-連接的糖基化位點[4]。在日本真鱸(Lateolabraxjaponicus)和斑馬魚(Daniorerio)中發(fā)現(xiàn)LH比FSH更保守，我們可以解釋為在進化過程中，F(xiàn)SH比LH進化更加迅速[5]。另外，在不同魚體內(nèi)半胱氨酸殘基的數(shù)量也有所不同。

在GtH的功能方面，研究表明，魚類的GtH的功能與哺乳動物促性腺激素的功能十分類似。FSH主要是在魚類性腺發(fā)育的早期，刺激性腺分泌雌二醇和睪酮等性類固醇激素，來調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和配子的生成，而LH則主要刺激產(chǎn)生17α，20β一二羥黃體酮，促使卵母細胞和精子的最后成熟及排放。還有研究表明GtH可能是通過調(diào)節(jié)芳香化酶基因的表達和芳香化酶的活性來刺激卵巢分泌雌二醇的。而GtH在體內(nèi)主要受到促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)和內(nèi)固醇激素的調(diào)節(jié)，研究還表明了二者對LH的分泌有聯(lián)合作用。

隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，1988年快速擴增cDNA的5′和3′末端的技術(shù)隨之出現(xiàn)。越來越多的魚類促性腺激素基因被發(fā)現(xiàn)并克隆。實驗方法基本相似，提取RNA后合成cDNA單鏈，再利用GenBank中的GtH mRNA進行引物設(shè)計，進行PCR擴增，進行3′末端和5′段擴增拼接成全長。大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)并克隆的魚類促性腺激素基因可以在GenBank中查找，如下整理了魚類促性腺激素的NCBI搜索編號，可根據(jù)其搜索編號查詢到基因全長序列。

表1 魚類促性腺激素基因NCBI編號

魚類促性腺激素基因的cDNA全長數(shù)量是不定的，銀漢魚(Atherinableekeri)的LH亞基cDNA長度為366 bp，而大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的LH基因的cDNA全長為3184 bp，包含了685個氨基酸。相似物種間的同源性要遠遠高于不同目間的同源性，而同一物種的FSH和LH亞基之間的核苷酸、氨基酸相似度很低，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的LH和FSH亞基只有31.6%的核苷酸相似度和21.9%的氨基酸相似度，其LH亞基與其他的硬骨魚類相比較，與大麻哈魚有67%的同源性，而與褐石斑魚有97%的同源性[6]。不屬于同一目的魚類之間的氨基酸序列變化取決于他們的系統(tǒng)發(fā)育。例如:鱸形目(N=7)的氨基酸序列鑒定與鰈形目(N=2)的同源性平均在82.5%,而與鰻鱺目(N=3)的同源性平均只有59.1%[7]。二級結(jié)構(gòu)分析表明鳙(Aristichthysnobilis)的FSH 主要是β轉(zhuǎn)角， LH B是β轉(zhuǎn)角和β折疊為主，GtHα為α折疊和β轉(zhuǎn)角[8]。

3 魚類促性腺激素的定量分析

早有研究者提出假設(shè)“促性腺激素可能參與了魚類早期的性別分化”，為驗證這一假設(shè)，很多學者對促性腺激素在魚類性腺發(fā)育的各個時期進行了表達分析。幾乎所有的研究都證明了魚類促性腺激素的二重性，其表達圖譜的研究為一些硬骨魚類的生殖功能也提供了線索。早在性腺發(fā)育的5日齡，尼羅羅非魚的FSH和LH受體已經(jīng)得到了表達[9]。隨著性腺的逐漸成熟 ，LHβ基因的表達和LH激素的分泌都逐漸增加。在大菱鲆性腺發(fā)育的各個時期中，卵巢發(fā)育I期到V期間逐漸增加[10]。對于FSH的表達模式，在不同的產(chǎn)卵模式的硬骨魚類中也有所不同。在銀大麻哈魚體內(nèi)，F(xiàn)SHβ的表達開始時很低，而后逐漸增強并在產(chǎn)卵前達到高峰，但在產(chǎn)卵后迅速降低。在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和日本鰻鱺(Anguillajaponica)中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。而在金魚、藍線鰭魚(Trichogastertrichopterus)和金頭鯛(Sparusaurata)體內(nèi)，F(xiàn)SHβ的mRNA在其性腺發(fā)育的產(chǎn)卵期達到峰值。在黃鰭短須石首魚(Umbrinaroncador)體內(nèi)，F(xiàn)SH基因在早期的卵黃發(fā)生階段和精子發(fā)生過程中強烈表達，而LH基因在精子排放期的表達含量最高[11]。而在雌性的褐石斑魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，所有的促性腺激素亞基的mRNA在腦垂體表達水平含量上均為:未成熟魚體遠高于成熟魚體。并且在未成熟魚體中，F(xiàn)SH亞基 的mRNA含量比GtHα亞基高出5倍，比LH亞基高出3倍。有研究探究了黃鱔(Monopterusalbus)體內(nèi)的FSH和LH在不同性腺發(fā)育時期的垂體中的表達情況，性腺中FSH的表達量隨著雌性到雄性的性逆轉(zhuǎn)全部過程逐漸升高。這有可能意味著性腺產(chǎn)生的FSH在雄性精子生成過程中起著重要的旁分泌或自分泌的調(diào)控作用[12]。研究表明，經(jīng)過CPE與hCG處理的花鰻鱺的LHβ和GtHα的表達量不斷上調(diào)，其中發(fā)育早期GtHα的表達量極顯著升高，而FSHβ的表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，也就是說CPE與hCG的組合注射能夠誘導魚類卵巢發(fā)育成熟[13]。在花鱸體內(nèi)，GtHα和LHβ亞基的表達量隨著精巢發(fā)育而逐漸增加；FSHβ整體變化不大這種現(xiàn)象在其他魚類中未有過報道，其原因可能是腦源的FSH不如腦源的LH與性腺發(fā)育相關(guān)性高[14]。而在性逆轉(zhuǎn)過程中，LH和FSH也同樣參與調(diào)控。在赤點石斑魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在性逆轉(zhuǎn)早期(ET)階段FSHβ 表達量處于低水平，但在性逆轉(zhuǎn)后期(LT)階段和雄性階段表達量升高;LHβ的表達模式與FSHβ相似，但從ET階段到LT階段，與FSHβ相比其表達量的升高幅度較低[15]。而對黃鱔體內(nèi)促性腺激素受體的研究表明，LH對誘導黃鱔卵母細胞的成熟與排放有關(guān)，F(xiàn)SH和LH對調(diào)節(jié)早期精巢的發(fā)育，精子的發(fā)生以及成熟具有重要作用[16]。

而在魚類不同組織內(nèi)，促性腺激素的表達量也有所不同。在史氏鱘(Acipenserschrenckii)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，腦區(qū)的表達量普遍高于外周組織。FSH在脊髓中沒有檢測到表達，在腦垂體表達量最高；外周組織中精巢表達量最高。LH在腦區(qū)都有表達，仍然是垂體表達量最高；性腺表達量較其他外周組織高[17]。LH在大菱鲆的各個組織中，卵巢的表達含量最高，其次是肝臟，而在眼、腸道、肌肉、鰓等組織中幾乎不表達。更多研究表明，魚類的促性腺激素在腦垂體中的表達量最多，其次為性腺，而在肌肉、心臟等諸多其他組織內(nèi)幾乎沒有表達。利用免疫組化方法在尼羅羅非魚體內(nèi)的前腦到下丘腦以及神經(jīng)垂體都檢測到了LH和FSH的分泌細胞。這表明了腦和腦垂體都是兩種促性腺細胞的發(fā)源地[18]。在金頭鯛的卵細胞中也同樣可以檢測到促性腺激素的分泌細胞，而在中華鱉(TrionyxSinensis)中，僅在腦垂體中表達，其他組織均未檢測到表達[19]。因此可推斷出在魚類中，促性腺激素分泌細胞的存在是十分廣泛的[20]。

4 魚類促性腺激素基因重組表達

在硬骨魚類促性腺激素功能研究障礙之一就是缺乏高純度的激素蛋白，其解決問題的一種方法就是利用不同的生物反應(yīng)器來生產(chǎn)激素蛋白。之前研究促性腺激素的主要方法是放射免疫測定法，隨著分子生物學的發(fā)展，基因工程技術(shù)拓寬了研究促性腺激素的領(lǐng)域，突破了促性腺激素必須從腦垂體中純化的限制。因而越來越多的魚類促性腺激素基因重組表達，運用了多種表達體系。在大腸桿菌表達體系中，成功表達出了大麻哈魚LH、草魚(Ctenopharyngodonidella)3種促性腺激素、鯉魚LH和FSH[20]、史氏鱘FSH和LH；而在畢赤酵母表達體系中，日本鰻鱺FSH[21]、斑馬魚FSH[22]以及羅非魚LH[23]得到表達；變形蟲表達體系中表達了非洲鯰(Silurusasotus)的FSH和LH[24]，在昆蟲細胞中可以表達鯰LH和FSH[25]以及鯉GtHα亞基；在哺乳動物的細胞中表達了條紋鱸(MorontSaxatuis)FSH和LH[26]以及虹鱒LH[27]；斜帶石斑魚促性腺激素在桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)中得到表達[28]，并且獲得的重組蛋白具有生物學活性，經(jīng)過驗證可以刺激石斑魚性類固醇激素的分泌，這一研究結(jié)果更為魚類繁育生理學奠定了理論基礎(chǔ)，并為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)實踐提供了理論依據(jù)與技術(shù)路線。目前的研究結(jié)果表明，硬骨魚類的GtH的分子總量具有一定的變化范圍，亞基大小的范圍是14～42 ku[29]。表2是大腸桿菌表達體系中，幾種硬骨魚類蛋白的大小。表2中的3種魚，均以新西蘭大白兔作為載體制備了多抗，為進一步制備單抗，建立放射免疫測定法，為測定催產(chǎn)前后魚類GtH的變化量做準備。

表2 大腸桿菌表達體系中硬骨魚類促性腺激素亞基蛋白大小[18]

5 結(jié)語與展望

近年來，越來越多的學者關(guān)注于硬骨魚類的促性腺激素，并取得了一定的進展，可仍然有許多問題等待著進一步探究。魚類促性腺激素的功能和作用機制許多細節(jié)仍然不清楚，LH、FSH、GtHα亞基各自的作用機制需進一步探索。GtHα亞基的具體作用尚不明確。促性腺激素與其他激素的相互作用有待探究。促性腺激素釋放激素和內(nèi)固醇激素對GtH的調(diào)劑機理是十分復(fù)雜的，可能也涉及體內(nèi)其他調(diào)控因子的共同作用。比如對條石鯛的研究表明，F(xiàn)SH調(diào)節(jié)作用可能具有更為復(fù)雜的模式，除了一種BPG軸調(diào)控方式以外，可能還有自分泌和旁分泌的調(diào)控模式，這需要進一步研究[30]。另外，對魚類促性腺激素基因轉(zhuǎn)錄因子的探究還需進一步地深入。已有研究表明，單鏈重組的促性腺激素能夠誘導精子的發(fā)生，以此為基礎(chǔ)，可進一步探索促性腺激素對性腺的調(diào)節(jié)作用。魚類的性別分化不僅受到遺傳因素的影響，還受環(huán)境因子的調(diào)控。然而到目前為止，促性腺激素對魚類性別分化的作用仍然缺少直接的證據(jù)。因此促性腺激素對魚類性別分化的作用還需要進一步證實。結(jié)合離體實驗和體內(nèi)實驗，研究促性腺激素在魚類性腺發(fā)育與成熟中的生理功能及作用機理，完善魚類的繁殖內(nèi)分泌學理論；能否利用重組激素蛋白進行人工催產(chǎn)實驗的研究，為魚類人工繁殖提供一條新的催產(chǎn)途徑更是值得關(guān)注的問題。還可以將內(nèi)分泌學、發(fā)育生物學、分子生物學和生物信息學等其他學科聯(lián)系起來，找到新的突破口，相信會有更大的突破。

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Research advance in gonadotropins gene in fish

LYU Shao-jin, ZHANG Tian-min, ZHAO Wen

(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province, College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116021, China)

Gonadotropin plays an important role in the sexual maturation and ovulation of fishes. The controversy about the types of fish gonadotropins has come to an end after 1975. It is generally believed that there are two kinds of gonadotropin subunits, GTHI and GTHII, whose biochemical structure and biological characteristics are similar to those of the FSH and LH in the mammalian. Along with the gradual development of molecular biology, research on gonadotropin has been accrurd over the years. In this paper, authors first review the literature on the biological basis, including biochemical structure, physiological function and regulation mechanism and so on. The current research of molecular cloning of gonadotropins of teleost, the quantitative analysis and recombinant expression of gonadotropins in fishes were summarized. The purpose of this paper is to provide a valuable reference for the study on the physiology of aquaculture and to lay the foundation for further research on the mechanism of gonadotropins.

gonadotropin；gene；expression；fish

2016-10-18；

2016-11-01

遼寧省教育廳“近岸海洋生物多樣性及其可持續(xù)利用創(chuàng)新團隊”(2015)

呂紹巾，碩士研究生，研究方向為魚類分子生物學，E-mail：ssssharky@outlook.com

趙 文，教授，博士生導師，研究方向為水域生態(tài)學,E-mail：zhaowen@dlou.edu.cn

Q78

A

2095-1736(2017)03-0082-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.082