紡錘形賴氨酸芽孢桿菌P-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

紡錘形賴氨酸芽孢桿菌P-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

曾承露，李鋒*，黃德娜

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000）

利用響應(yīng)面法對(duì)紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3產(chǎn)胞外多糖（EPS）發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選到顯著因素，對(duì)顯著因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立EPS產(chǎn)量與各因素的多元回歸方程；最終確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3%、初始pH 7、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min。在此優(yōu)化條件下，EPS平均產(chǎn)量為2.92 g/L。關(guān)鍵詞：紡錘形賴氨酸芽孢桿菌；胞外多糖；響應(yīng)面法；發(fā)酵工藝

微生物胞外多糖（exocellular polysaccharides，EPS）是微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的粘液或者莢膜多糖[1-3]。近年來(lái)因其具有多種生物活性[4-6]和生理功能[7-8]，以及生產(chǎn)成本低受到普遍關(guān)注。微生物產(chǎn)胞外多糖的研究熱點(diǎn)主要集中在篩選優(yōu)良安全的菌種及優(yōu)化發(fā)酵工藝提高多糖產(chǎn)率兩方面[9-13]?；诙嗵菓?yīng)用安全方面考慮，從可食用食品中篩選產(chǎn)多糖微生物倍受研究者青睞，如于靜等[14]從新疆酸馬奶中分離到一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌RB2，其胞外多糖產(chǎn)率為511 μg/mL。JOSHI S R等[15]從印度的一種部落飲料中分離出乳酸明串珠菌（Leuconostoclactis），在含有蔗糖MRS培養(yǎng)基和釕紅牛奶瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測(cè)得其EPS產(chǎn)量為340.82 mg/L，在之后對(duì)影響產(chǎn)量的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在28℃、pH值為6.5、以蔗糖為碳源的條件下，其EPS產(chǎn)量顯著提高。

我國(guó)西南地區(qū)具有獨(dú)特的自然環(huán)境和氣候特點(diǎn)，當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族利用自然環(huán)境中的微生物，采用傳統(tǒng)方法制作蔬菜發(fā)酵食品，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然馴化，這些食品中保留了大量?jī)?yōu)勢(shì)菌種，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供寶貴資源。本實(shí)驗(yàn)室從獨(dú)山鹽酸菜中分離得到一株能夠分泌多糖的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3，為進(jìn)一步深入研究和促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)開(kāi)發(fā)，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著因素及水平，再運(yùn)用響應(yīng)面分析方法（response surface method，RSM）對(duì)菌株P(guān)-3產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高菌株P(guān)-3的胞外多糖產(chǎn)量。目前微生物產(chǎn)胞外多糖量還較低，優(yōu)化產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3由本實(shí)驗(yàn)室篩選自獨(dú)山農(nóng)家自制鹽酸菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在以上液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉。121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5g/L，NaCl10g/L，蔗糖25 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨3 g/L，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、NaNO3、K2HPO4、MgSO4、NaCl（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；ZF-C紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海滬西分析儀器公司；5804R小型臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendoff公司；APlus730R回轉(zhuǎn)式振蕩恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó)APlus公司；FE-20KpH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-20型超凈工作臺(tái)：蘇州華科凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

取-80℃保存的菌株，解凍后取50 μL菌液接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，置于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min活化12 h，取少量菌液涂布于LB平板，待長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同上），作為發(fā)酵種子液。

1.3.2 粗多糖提取

發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min，取上清液5 mL，加入20 mL無(wú)水乙醇沉淀多糖，4℃放置1 h后，8 000 r/min離心10 min，棄上清。所得沉淀用2 mL蒸餾水溶解，制得多糖粗提液[16]。

1.3.3 胞外多糖含量測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[17]測(cè)定發(fā)酵液中粗多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支15mL具塞試管分別吸取0.1 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL分別置于試管中，然后每只試管再用蒸餾水補(bǔ)足1 mL，空白對(duì)照取1 mL蒸餾水。依次加入6%苯酚溶液1mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后，室溫靜置30 min，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.561 71x-0.0369 33，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多糖含量。

1.3.4 發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)EPS產(chǎn)量影響的單因素試驗(yàn)

裝液量為100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3在接種量2%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定不同初始pH（5、6、7、8、9）對(duì)其EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量為3%、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定不同發(fā)酵溫度（25℃、30℃、35℃、40℃）對(duì)EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量為3%、溫度30℃的條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定不同轉(zhuǎn)速（120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）對(duì)EPS產(chǎn)量的影響；在初始pH值為7、接種量2%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min的條件下，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間（24h、36h、48h、60 h、72 h）對(duì)EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選擇對(duì)EPS產(chǎn)量影響較顯著的因素發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和轉(zhuǎn)速（C）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始pH對(duì)EPS產(chǎn)量影響

pH值的變化可能會(huì)影響菌株細(xì)胞膜形態(tài)的穩(wěn)定性以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，進(jìn)而影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和代謝產(chǎn)物積累[18-19]，不同初始pH對(duì)EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株P(guān)-3在初始pH值為5～7時(shí)，EPS產(chǎn)量隨著初始pH值的增加而增加；菌株P(guān)-3在初始pH值為7時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值1.69 g/L；菌株P(guān)-3在初始pH值為7～9時(shí)，EPS產(chǎn)量隨著初始pH值的增加而減少；培養(yǎng)基過(guò)酸或者過(guò)堿都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌代謝能力變差。在初始pH 5～9范圍內(nèi)該菌都可以產(chǎn)多糖，并且產(chǎn)量差異不顯著。因此選擇培養(yǎng)基最適初始pH值為7。

圖1 初始pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of initial pH on exopolysaccharides yield

2.1.2 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量影響

接種量直接影響發(fā)酵液中最初活菌數(shù)，菌體數(shù)的多少直接影響菌體的生長(zhǎng)代謝，不同接種量對(duì)EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)接種量在1%～3%時(shí)，隨著接種量的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)接種量達(dá)到3%時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值1.75 g/L；當(dāng)接種量為3%～5%時(shí)，EPS產(chǎn)量開(kāi)始下降。這可能是由于接種量過(guò)大，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，發(fā)酵液中菌體濃度過(guò)高，發(fā)酵中后期碳源消耗殆盡而導(dǎo)致合成胞外多糖的前體物質(zhì)減少，從而降低EPS產(chǎn)量；而接種量過(guò)小，發(fā)酵液中菌體較少，導(dǎo)致生長(zhǎng)延滯期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法得到有效利用，不利于EPS代謝合成。因此選擇最適接種量為3%。

圖2 接種量對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculum on exopolysaccharides yield

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量影響

發(fā)酵溫度直接影響微生物生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝，微生物產(chǎn)不同代謝產(chǎn)物所需溫度也不盡相同，不同發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為25～35℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到35℃時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.23 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于35℃之后，EPS產(chǎn)量開(kāi)始下降。由此可以推斷溫度過(guò)高或者過(guò)低可能會(huì)影響參與細(xì)菌代謝過(guò)程中酶的活力，從而對(duì)菌體代謝產(chǎn)物積累造成影響。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為35℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides yield

2.1.4 轉(zhuǎn)速對(duì)EPS產(chǎn)量影響

菌株P(guān)-3是好氧菌，細(xì)菌生長(zhǎng)與繁殖需要一定的氧氣參與其代謝。發(fā)酵液中溶氧量的大小直接與轉(zhuǎn)速有關(guān)，不同轉(zhuǎn)速對(duì)EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在120～150 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/min時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.257 g/L；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞150 r/min之后，EPS產(chǎn)量開(kāi)始下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)，發(fā)酵液中溶氧量不足影響細(xì)菌代謝，而提高轉(zhuǎn)速后雖有利于菌體生長(zhǎng)，但同時(shí)養(yǎng)分消耗過(guò)快，碳源只作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供菌體繁殖，而導(dǎo)致菌體合成EPS能力降低；且轉(zhuǎn)速過(guò)高，對(duì)菌體產(chǎn)生機(jī)械性損傷，引起菌體自溶，從而抑制EPS合成[20]。因此選擇最佳轉(zhuǎn)速為150r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of rotate speed on exopolysaccharides yield

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在24～36h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，EPS產(chǎn)量也隨之增大；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36 h時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到2.276 g/L；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞36 h之后，EPS產(chǎn)量開(kāi)始下降。EPS含量呈逐漸下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)樘荚醇盃I(yíng)養(yǎng)成分減少，無(wú)法繼續(xù)提供菌體細(xì)胞生長(zhǎng)及EPS分泌，也可能是被細(xì)菌產(chǎn)生相關(guān)酶降解的原因[21]。因此選擇最適發(fā)酵時(shí)間為36 h。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on exopolysaccharides yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化Lysinibacillus fusiformisP-3發(fā)酵條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，即以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和轉(zhuǎn)速（C）作為自變量，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiments design

利用Desing-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，建立數(shù)學(xué)模型回歸方程：Y=-37.091+1.387 05A+ 0.327 79B+0.135 71C+7.916 67×10-4AB-2.333 33×10-4AC-8.40278×10-4BC-0.01924A2-2.55903×10-3B2-3.12222×10-4C2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該數(shù)學(xué)模型極顯著（P＜0.000 1）；試驗(yàn)所選取3個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)EPS產(chǎn)量的影響從大到小依次為B＞A＞C。失擬項(xiàng)P=0.075 2＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著；決定系數(shù)為R2=0.992 0，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)，擬合度＞99%。同時(shí)，回歸方程的一次項(xiàng)A、B、C對(duì)結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖6。由圖6可以直觀找到最佳工藝參數(shù)，以及對(duì)任意兩因素之間交互作用影響EPS產(chǎn)量進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并從中確定提取工藝的最佳水平范圍。由圖6可知，在所選的因素水平范圍內(nèi)存在最大值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and rotate speed on exopolysaccharides yield

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度34.41℃、發(fā)酵時(shí)間32.28 h和轉(zhuǎn)速161.02 r/min，預(yù)測(cè)響應(yīng)值（EPS產(chǎn)量）為2.988 g/L。為檢驗(yàn)回歸方程的可靠性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)；考慮到試驗(yàn)的可操作性，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得EPS產(chǎn)量平均值為2.92 g/L，達(dá)到預(yù)測(cè)值的97.7%，說(shuō)明所建立方程模型具有較高準(zhǔn)確性。

通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件使EPS產(chǎn)量高于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌S-1多糖產(chǎn)量（1.5g/L），低于文獻(xiàn)[21]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量（104.37 g/L）。胞外多糖產(chǎn)量低的原因可是由于蔗糖質(zhì)量濃度不同，培養(yǎng)基成分有明顯差異，并且不同種細(xì)菌之間合成多糖能力存在差異。微生物發(fā)酵的是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，除了與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)外，培養(yǎng)基配方也直接影響微生物的代謝產(chǎn)物。因此，需進(jìn)一步研究培養(yǎng)基配方及尋找廉價(jià)原料作為碳源，使其具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

首先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化建立二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著性，探討各因素交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響，最終確定紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）P-3產(chǎn)胞外多糖最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3%、初始pH 7、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時(shí)間32 h和轉(zhuǎn)速161 r/min。在此最佳條件下，EPS產(chǎn)量為2.92 g/L。

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Optimization of fermentation technical parameters ofLysinibacillus fusiformisP-3 for exopolysaccharides production

ZENG Chenglu,LI Feng*,HUANG Dena
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Qiannan Normal College for Nationalities,Duyun 558000,China)

The fermentation technical parameters of exopolysaccharides(EPS)-producingLysinibacillus fusiformisP-3 were optimized by response surface methodology.The significant factors were screened and optimized by single factor and Box-Behnken experiments.The multiple regression equation of EPS yield and all the factors was established.Finally,the optimum fermentation technical parameters were determined as followed:inoculum 3%,initial pH 7,fermentation temperature 34℃,time 32 h and rotate speed 161 r/min.Under the optimal conditions,the average yield of EPS was 2.92 g/L.

Lysinibacillus fusiformis;exopolysaccharides;response surface methodology;fermentation technology

TQ920.6

0254-5071（2017）06-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.023

2017-03-13

貴州省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（黔教合KY[2014]286）；貴州省科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7418）

曾承露（1986-），女，講師，碩士，研究方向食品微生物。

*通訊作者：李鋒（1982-），男，講師，博士研究生，研究方向微生物代謝機(jī)理。