高效液相色譜法測(cè)定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

王麗君，禹潔，蘇阿龍，賈紅芳，朱書強(qiáng)*

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅蘭州730030）

高效液相色譜法測(cè)定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

王麗君，禹潔，蘇阿龍，賈紅芳，朱書強(qiáng)*

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅蘭州730030）

利用純水溶解提取糧谷類樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，經(jīng)過免疫親和柱凈化，并優(yōu)化提取凈化條件，通過高效液相色譜檢測(cè)其含量。結(jié)果表明，采用2 mL濾液上樣，經(jīng)氮吹儀在40℃吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波長(zhǎng)220 nm條件下進(jìn)行檢測(cè)，色譜峰分離效果良好。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 8），檢出限2 μg/kg，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為2.4%，回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%，表明該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確性，適用于糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的定量分析檢測(cè)。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；糧谷類；免疫親和柱；高效液相色譜

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是鐮刀菌屬（Fusarium）產(chǎn)生的一種B型單端孢霉烯族真菌毒素，對(duì)動(dòng)物和人都具有很強(qiáng)的致嘔吐能力，因此又被稱為“嘔吐毒素（vomitoxin）”[1]。其主要存在于小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米、大米等谷物及其制品中，在全球范圍內(nèi)具有很高的污染率[2]。DON既能引起急性中毒也可造成慢性損害。動(dòng)物急性中毒主要表現(xiàn)為嘔吐、拒食、體質(zhì)量降低和腹瀉，人群DON急性中毒癥狀包括惡心、嘔吐、胃腸紊亂、頭暈、頭痛和腹瀉，慢性中毒表現(xiàn)為攝食減少、生長(zhǎng)緩慢及血清免疫球蛋白水平改變[3]。因此建立DON的分析檢測(cè)方法，對(duì)于糧谷類食品中DON的暴露和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

目前對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（highperformance liquidchromatography，HPLC）、柱凈化法結(jié)合電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜法（column purification methodcombinedwithelctroncapturedetectorgaschromatography，GC-ECD）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、放射性免疫測(cè)定法（radioimmunoassays，RIAs）等[4-9]；馬冬月等[10]采用酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分別檢測(cè)了小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米、大米等谷物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，檢測(cè)結(jié)果回收率低，不能準(zhǔn)確定量。游淑珠[11]提出了采用乙腈-水提取糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，以用N-七氟丁酰咪唑衍生，GC-ECD檢測(cè)；唐吉旺等[12]提出谷物樣品經(jīng)乙腈-水溶液提取，離心后經(jīng)自制中性氧化鋁-活性炭-二氧化硅固相萃取柱凈化，氣相色譜檢測(cè)；李華[13]提出了酶聯(lián)免疫吸附的測(cè)定方法；張鵬等[14]提出了采用免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC）或多功能凈化柱（multifunctional purification column，MFC）凈化，用高效液相色譜法檢測(cè)。上述方法前處理步驟繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)，試驗(yàn)成本高，提取效率低，靈敏度和特異性差，結(jié)果存在一定的假陽性，不能準(zhǔn)確地定量。因此，本研究采用免疫親和柱凈化，建立高效液相色譜檢測(cè)糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，以期為快速準(zhǔn)確地測(cè)定糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉樣品、啤酒大麥、小麥粉、糧谷制品：市售；脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)液（質(zhì)量濃度100 μg/mL）：上海酶聯(lián)生物有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純）：北京百靈威科技有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）天津新沃化工有限責(zé)任公司；磷酸氫二鈉（分析純）：北京康普匯維科技有效責(zé)任公司；氯化鉀（分析純）：武漢興眾誠(chéng)科技有限公司；鹽酸（分析純）：河北固安清遠(yuǎn)化工試劑廠；聚乙二醇（純度＞99%）：天津中和盛泰化工有限責(zé)任公司；玻璃纖維濾紙（直徑11cm，孔徑1.5 μm）：杭州沃華濾紙有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器）：美國(guó)沃特世公司；H1650型離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀科技有限責(zé)任公司；Vortex-Genie渦旋儀：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；1 250 ng/3 mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：ROMER國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；AccuPrep SPE48位高通量正壓固相萃取儀：美國(guó)J2 Scientific公司；GenPure UV-TOC/UF× CAD plus超純水器：賽默飛世爾科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.00 mL 100 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈+水（2+8）定容，得到10 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80，V/V）定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度分別為20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，經(jīng)0.45 μm過濾后，采用高效液相色譜儀檢測(cè)，以脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取糧谷類樣品25 g于100 mL離心管中，加入80 mL超純水，高速渦旋5 min，超聲提取30 min，加水定容至100 mL，靜置10 min，用玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱放置至室溫，頂部連接一支30 mL注射器，置于高通量正壓固相萃取儀上，取2 mL濾液于30 mL注射器內(nèi)，控制流速1滴/s的速度通過免疫親和柱。用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5mL去離子水先后淋洗免疫親和柱。直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入3 mL甲醇洗脫，流速控制在1滴/s，收集流出液于10 mL離心管中，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)吹干，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）溶解，經(jīng)0.45 μm過濾后，待高效液相色譜儀測(cè)定[15-16]。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（20∶80，V/V）等度洗脫；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，進(jìn)樣量50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的提取與凈化柱的選擇

[17]報(bào)道，糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇大多采用純水或甲醇水提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化，但甲醇毒性大，損害人體健康，且對(duì)環(huán)境有危害。本試驗(yàn)采用純水提取，在渦旋儀上高速渦旋5 min，超聲提取30 min，提取液分別用硅膠柱和經(jīng)有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異抗原的免疫親和柱凈化，結(jié)果表明特異抗原的免疫親回收率高，特異性強(qiáng)。

2.2 上柱體積的優(yōu)化

在糧谷類樣品中加入不同體積（0.5 mL、1.0 mL、5 mL）的10 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中脫氧血腐鐮刀菌烯醇的含量分別為1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，按照1.3的方法測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率，評(píng)價(jià)試驗(yàn)效果?？疾焐现w積對(duì)回收率的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，上柱體積為1.0mL時(shí)，回收率為56.01%～60.10%；上柱體積為2.0 mL時(shí)，回收率為95.62%～100.81%；上柱體積為5.0 mL時(shí)，回收率為64.21%～74.32%；上柱體積為10.0 mL時(shí)，回收率為50.32%～60.32%。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用上柱體積為2.0 mL。

表1 上柱量?jī)?yōu)化結(jié)果(n=4)Table 1 Optimization results of sampling volume(n=4)

2.3 色譜條件的優(yōu)化

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是極性化合物，流動(dòng)相以水作為基礎(chǔ)溶劑，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在波長(zhǎng)220 nm處有最大吸收。且雜峰和基線噪音干擾少。通過上述優(yōu)化的方法，采用乙腈-水（20∶80，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)，考察對(duì)色譜分離效果的影響，對(duì)脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，目標(biāo)物色譜峰目標(biāo)峰與樣品雜峰分離良好，色譜峰形尖銳對(duì)稱，沒有產(chǎn)生拖尾及前沿等現(xiàn)象。且采用乙腈-水（20∶80，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，流動(dòng)相的配比簡(jiǎn)單，毒性小。

圖1 脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPCL chromatogram of deoxynivalenol standard substance (A)and the sample(B)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用上述優(yōu)化的色譜條件對(duì)脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行檢測(cè)，以脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（limit of detection，LOD）結(jié)果見表2。

表2 脫氧血腐鐮刀菌烯醇線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection of deoxynivalenol

由表2可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=67.891x+0.033，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。將樣品標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋，以3倍信噪比時(shí)的質(zhì)量濃度為能檢測(cè)的最低質(zhì)量濃度，該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。當(dāng)3倍信噪比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物最低響應(yīng)濃度為儀器最低檢出限，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算方法檢出限。樣品前處理方法采用稀釋2倍的形式，根據(jù)本方法中樣品的取樣量和定容體積，測(cè)得方法的檢出限為2.0 μg/kg。

2.4.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

取6份100 ng/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，按上述優(yōu)化的方法進(jìn)行處理、測(cè)定，平行測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品的RSD值為2.4%＜5.0%，說明該檢測(cè)方法精密度良好。

2.4.3 回收率試驗(yàn)

在糧谷類樣品中分別加入10 μg/mL的脫氧血腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中脫氧血腐鐮刀菌烯醇添加量分別為1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL，按照1.3的方法測(cè)定其含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇的回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%，表明方法準(zhǔn)確度較高，可以用于檢測(cè)糧谷類中脫氧血腐鐮刀菌烯醇含量的檢測(cè)。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rate tests

2.5 樣品的測(cè)定

應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法分別檢測(cè)小麥粉、玉米粉、啤酒大等樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，結(jié)果表明部分樣品有污染現(xiàn)象，其中小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量范圍在0.41～2.88μg/kg，玉米粉其含量范圍在10.63～25.88μg/kg，啤酒大麥其含量范圍在10.63～55.23 μg/kg，從檢測(cè)結(jié)果看小麥粉中污染風(fēng)險(xiǎn)較低，3種糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量均符合GB/T 2761—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》[18]中規(guī)定的限量。

3 結(jié)論

本研究建立了免疫親和柱結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的分析檢測(cè)方法。采用2 mL濾液上樣，經(jīng)氮吹儀在40℃時(shí)吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波長(zhǎng)220 nm條件下進(jìn)行檢測(cè)，色譜峰分離效果良好。結(jié)果表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 8），方法檢出限為2 μg/kg。精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD值為2.4%，回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%。表明該方法準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可作為糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇快速定量分析。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉慶新，高利華，周闖，等.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇純品制備工藝的研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī)，2014，46（12）：112-116.

[2]孟剛.面粉中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇有害嗎[J].老同志之友，2016（10）：55-55.

[3]邱雨樓.納米抗體N-28模擬DON抗原的分子機(jī)制研究及定點(diǎn)改造[D].南昌：南昌大學(xué)，2016.

[4]鮑蕾，吳振興，石媛媛，等.多功能柱凈化-高效液相色譜法檢測(cè)糧谷及其制品中的嘔吐毒素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014（3）：776-782.

[5]王照鵬，李小兵，王哲.玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（5）：216-218.

[6]許偉，耿芳芳，范夢(mèng)雪，等.DON提取、純化及其HPLC檢測(cè)方法的建立[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015（z1）：380.

[7]張華，趙麗芬.飼料中霉菌和霉菌毒素的檢測(cè)方法[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32（5）：86-87.

[8]于學(xué)雷.棒曲霉素硅膠表面印跡聚合物的制備及其SPE-HPLC應(yīng)用[D].上海：上海交通大學(xué)，2009.

[9]王葉群，姚剛，張紹英.污染黃曲霉毒素花生的檢測(cè)及分選技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程，2014，4（6）：59-63.

[10]馬冬月.農(nóng)產(chǎn)品中嘔吐毒素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2010.

[11]游淑珠.小麥、玉米中DON氣相色譜檢測(cè)方法的建立及OTA單克隆抗體免疫親和柱的研制[D].南昌：南昌大學(xué)，2005.

[12]唐吉旺，周叢，林源，等.毛細(xì)管柱-氣相色譜法測(cè)定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇含量[J].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2012，48（12）：1441-1443.

[13]李華.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）人工抗原的合成及其酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[14]張鵬，張藝兵，鮑蕾，等.出入境糧谷中嘔吐毒素檢測(cè)方法的研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2003，13（2）：8-10.

[15]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.111—2003谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[16]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局，全國(guó)信息與文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).GB/T 23503—2009食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009. [17]何敏，王一凡，鄧銜柏.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008，25（4）：40-43.

[18]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2761—2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

Determination of deoxynivalenol in cereals by HPLC

WANG Lijun,YU Jie,SU Along,JIA Hongfang,ZHU Shuqiang*
(Gansu Institute of Food Inspection,Lanzhou 730030,China)

The deoxynivalenol in cereals samples was extracted by purified water and purified by immunoaffinity column,and the conditions of extraction and purification were optimized.The condition of deoxynivalenol was determined by HPLC.The results showed that filtrate 2 ml was dried at 40℃by termovap sample concentrator,with 1 ml acetonitrile-water(20∶80,V/V)constant volume,and then detected at wavelength of 220 nm. The separation effect of chromatographic peak was good.The deoxynivalenol had a good linear relationship in the range of 20-500 ng/ml(R2=0.999 8). The limit of detection was 2 μg/kg.The relative standard deviation(RSD)of precision tests results was 2.4%.The recovery rate was 87.6%-98.9% and the RSD was 2.04%-2.68%,which indicated the method could be used for the quantitative analysis and detection of deoxynivalenol content in cereals since it had the good precision and accuracy.

deoxynivalenol;cereals;immunoaffinity column;HPLC

O657.7

0254-5071（2017）06-0179-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.037

2017-02-21

王麗君（1981-），女，助理工程師，大專，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。

*通訊作者：朱書強(qiáng)（1981-），男，工程師，博士，研究方向?yàn)槭称范舅胤治雠c研究。