晚期糖基化終末產(chǎn)物調(diào)控平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究

何虎強(qiáng)，曾 宏，孫曉磊，張 雷，王偉明，胥雄飛，何延政，劉 勇

·論著·

晚期糖基化終末產(chǎn)物調(diào)控平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究

何虎強(qiáng)，曾 宏，孫曉磊，張 雷，王偉明，胥雄飛，何延政，劉 勇*

目的 探討晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)調(diào)控其受體促進(jìn)人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制。方法 2014年1月—2015年3月，將股動(dòng)脈中膜平滑肌層剪成1～2 mm組織塊培養(yǎng)，選取3～8代平滑肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將平滑肌細(xì)胞分為4組，A組單純于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，B組于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，C、D組分別于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)基中加入20、40 mg/L AGEs，各組平滑肌細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)96 h。合成3對(duì)隨機(jī)AGEs受體(RAGE)siRNA，以50 nmol/L轉(zhuǎn)染C組平滑肌細(xì)胞，24 h后進(jìn)行siRNA沉默效果檢測(cè)，選取轉(zhuǎn)染效率較高的序列用于實(shí)驗(yàn)。分別取轉(zhuǎn)染前后平滑肌細(xì)胞，采用Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)觀察平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣沉積情況，采用Western blotting法檢測(cè)RAGE、β-catenin、骨保護(hù)素(OPG)表達(dá)水平。結(jié)果 未轉(zhuǎn)染的平滑肌細(xì)胞中，A組無(wú)鈣化斑塊形成，B組可見明顯的鈣化斑塊；C、D組細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈現(xiàn)粉紅色的數(shù)量增加，鈣化斑塊明顯增多。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，C組平滑肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈現(xiàn)粉紅色的數(shù)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞減少，鈣化斑塊形成受到抑制。未轉(zhuǎn)染的各組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，C組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平高于B組，D組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平高于B、C組(P<0.05)。C組平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平均低于轉(zhuǎn)染前(P<0.01)。結(jié)論 AGEs通過與其受體結(jié)合而介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能為RAGE激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使β-catenin下游蛋白OPG表達(dá)水平升高。

糖尿??；血管鈣化；晚期糖基化終末產(chǎn)物；骨保護(hù)素

何虎強(qiáng)，曾宏，孫曉磊，等.晚期糖基化終末產(chǎn)物調(diào)控平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(20)：2490-2494.[www.chinagp.net]

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糖尿病(DM)是一種高度流行的代謝性疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。大血管和外周血管鈣化是導(dǎo)致DM發(fā)生和患者死亡的主要原因[2]。DM患者體內(nèi)晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)代謝增強(qiáng)，致使AGEs增多[3]?，F(xiàn)已證明，人血管平滑肌細(xì)胞存在AGEs受體(RAGE)，AGEs與RAGE結(jié)合，導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)和氧化應(yīng)激，是誘發(fā)DM患者血管病變的主要原因之一[4]。AGEs通過與RAGE結(jié)合，改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致多種因子表達(dá)發(fā)生變化，從而刺激平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，加快DM患者動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)一步演變[5]。AGEs在誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生過程中具有重要作用[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，AGEs誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生，并通過脫氫酶輔酶(NADPH)氧化酶促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)導(dǎo)致鈣沉積。本研究通過對(duì)鈣化培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞采用不同濃度的AGEs干預(yù)，并檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，探討AGEs調(diào)節(jié)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)HyClone公司)，DAPI染液(美國(guó)Sigma公司)，肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)單克隆抗體(美國(guó)Bioworld公司)，羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，山羊封閉血清(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(武漢碧云天生物技術(shù)研究所)，AGEs(日本Biovision公司)，細(xì)胞鈣離子測(cè)定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，一抗RAGE、β-catenin、骨保護(hù)素(OPG，美國(guó)Cell Signaling公司)，二抗、上樣緩沖液、一抗二抗稀釋液(武漢碧云天生物技術(shù)研究所)，RAGE siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 2014年1月—2015年3月，取遺體捐獻(xiàn)者股動(dòng)脈(中山大學(xué)附屬醫(yī)院惠贈(zèng))，無(wú)菌環(huán)境下手術(shù)刀片刮除外膜和內(nèi)膜,將中膜平滑肌層剪成1～2 mm組織塊。貼壁培養(yǎng)3周后，在倒置顯微鏡下觀察，有平滑肌細(xì)胞從組織塊周圍爬出。4周時(shí)，平滑肌細(xì)胞呈典型的“峰谷狀”生長(zhǎng)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，隨著傳代次數(shù)的增多，平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)周期逐漸縮短，5代以后維持在3～5 d，8代以后維持在1～2 d。選取3～8代平滑肌細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種于24孔板，完成下述實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將平滑肌細(xì)胞分為4組，A組單純于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，B組于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，C、D組分別于含10 mmol/L β磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)基中加入20、40 mg/L AGEs，各組細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)96 h。

1.4 RAGE siRNA轉(zhuǎn)染 根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)人工合成3對(duì)隨機(jī)RAGE siRNA(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)。siRNA 1靶序列：CCTCTTTCCTGGAGTAAAT，正義鏈：5′-CCUCUUUCCUGGAGUAAAU dTdT-3′,反義鏈：5′-AUUUACUCCAGGAAAGAGG dTdT-3′；siRNA 2靶序列：GCACTAATATGTAACTTA，正義鏈：5′-GCACUAAUAUGUGAACUUA dTdT-3′,反義鏈：5′-UAAGUUCACAUAUUAGUGC dTdT-3′；siRNA 3靶序列：CACCGGAACCACTCAGTAA，正義鏈：5′-CACCGGAACCACUCAGUAA dTdT-3′，反義鏈：5′-UUACUGAGUGGUUCCGGUG dTdT-3′。轉(zhuǎn)染前24 h將C組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔鋪于24孔板,使轉(zhuǎn)染時(shí)密度能夠達(dá)到80%。以lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA于24孔板，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，按照試劑盒說(shuō)明完成轉(zhuǎn)染步驟。轉(zhuǎn)染完成后24 h進(jìn)行siRNA沉默效果檢測(cè)，Cy3標(biāo)記的RAGE siRNA模擬物轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞8 h后換液，24 h后熒光顯微鏡下觀察siRNA不同序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Cy3標(biāo)記的紅色熒光表達(dá)量。通過篩選發(fā)現(xiàn)，siRNA 2的轉(zhuǎn)染效率較高,Cy3紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率接近100%(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章)，選用該轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 Von Kossa染色實(shí)驗(yàn) 分別取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，采用Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)(試劑盒購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)觀察細(xì)胞內(nèi)鈣沉積情況。6孔板中放入蓋玻片，讓細(xì)胞爬到蓋玻片上；待細(xì)胞在蓋玻片上融合度達(dá)90%時(shí)，用37 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；加入4%多聚甲醛溶液固定30 min,將固定的蓋玻片依次加入100%、95%、80%梯度乙醇溶液后水洗；加入1%硝酸銀溶液1 ml，日光照射30 min；移棄硝酸銀溶液，加入1 ml 5%硫代硫酸鈉溶液放置1 min；核固紅復(fù)染后，用95%和無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水兩次；天然樹脂膠封固，光鏡觀察。在光鏡下，核固紅復(fù)染后若有鈣沉積，則細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均呈現(xiàn)紅色或淡粉色。

圖1 siRNA 2轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下可見Cy3紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率接近100%(×10)

Figure 1 siRNA transfection,under the Fluorescence microscope,Cy3 in cell positive rate close to 100%,Shows that successful transfection

1.6 Western blotting法 分別取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，檢測(cè)RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平。應(yīng)用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，稀釋一抗經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中搖床37 ℃，封閉1 h，PVDF膜浸泡于稀釋好的一抗RAGE(1∶500)、β-catenin(1∶500)、OPG(1∶500)、GAPDH(1∶500)中，4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h，TBST緩沖液洗膜5 min，洗3次。二抗孵育后加入預(yù)先稀釋好的辣根過氧化物酶(1∶3 000)標(biāo)記，密封，室溫孵育1 h，洗膜，TBST緩沖液漂洗5 min，洗3次；暗室中向蛋白條帶加ECL發(fā)光液，使發(fā)光液與條帶充分混勻，放入成像儀中拍照。采用Quantity one軟件分析蛋白灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值×100%表示其相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1VonKossa染色實(shí)驗(yàn) 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，A組無(wú)鈣化斑塊形成，B組可見明顯的鈣化斑塊；C、D組細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈現(xiàn)粉紅色的數(shù)量增加，鈣化斑塊明顯增多(見圖2)。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，C組平滑肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈現(xiàn)粉紅色的數(shù)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞減少，鈣化斑塊形成受到抑制(見圖3)。

圖2 未經(jīng)轉(zhuǎn)染的各組平滑肌細(xì)胞Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Figure2ExperimentalresultsofVonKossastainingofsmoothmusclecellsinnontransfectedgroups

圖3 轉(zhuǎn)染后的C組平滑肌細(xì)胞Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Figure 3 Experimental results of Von Kossa staining of the smooth muscle cells of C group after transfection

2.2 未經(jīng)轉(zhuǎn)染的各組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平比較 未轉(zhuǎn)染的各組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，C組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平高于B組，D組平滑肌細(xì)胞RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平高于B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of expression levels of RAGE，β-catenin，OPG among each group before RAGE siRNA interference

組別RAGEβ-cateninOPGB組0.141±0.0051.170±0.0390.269±0.017C組0.489±0.023a1.601±0.009a0.750±0.026aD組1.039±0.041ab1.839±0.082ab1.084±0.048abF值274.69241.176157.166P值<0.001<0.001<0.001

注：RAGE=晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，OPG=骨保護(hù)素；與B組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.3 C組平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平比較 C組平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RAGE、β-catenin、OPG表達(dá)水平均低于轉(zhuǎn)染前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

Table 2 Comparison of expression levels of RAGE，β-catenin，OPG before and after RAGE siRNA interference in group C

RAGEsiRNARAGEβ-cateninOPG轉(zhuǎn)染前1.419±0.0441.718±0.0382.327±0.037轉(zhuǎn)染后0.810±0.0050.876±0.0281.147±0.019t值13.76017.66528.610P值<0.001<0.001<0.001

3 討論

3.1 AGEs通過RAGE誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化 AGEs是與DM患者血管病變和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥相關(guān)的信號(hào)蛋白，對(duì)DM模型小鼠的研究證實(shí)，AGEs/RAGE在血管病變的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用[7]。RAGE作為當(dāng)前研究最廣泛且最成熟的AGEs受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，由細(xì)胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞外區(qū)組成，其帶有高度電荷的細(xì)胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合，在RAGE信號(hào)傳導(dǎo)中起核心作用。RAGE可由多種細(xì)胞表達(dá)，生理?xiàng)l件下低表達(dá)，但在某些病理?xiàng)l件下則持續(xù)表達(dá)，且配體與RAGE表達(dá)之間存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在血管系統(tǒng)AGEs配體增多的病變部位常伴隨RAGE表達(dá)增加，這種正反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)并增強(qiáng)RAGE與配體的致病作用。RAGE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性血管鈣化[8]。YAMAGISHI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生。CECIL等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Enpp1-/-小鼠在給予siRAGE或敲除RAGE后，動(dòng)脈壁鈣化明顯受到抑制。多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，AGEs能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化，同時(shí)誘導(dǎo)Runx2 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)堿性磷酸酶(ALP)活性，提高降鈣素水平；阻斷RAGE后，能抑制AGEs誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化[11-12]。高血糖暴露及AGEs蓄積已被證明有助于DM的發(fā)生、發(fā)展[13]。AGEs具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化的能力，從而促進(jìn)血管鈣化的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，激活的RAGE不僅抑制心肌素依賴的平滑肌細(xì)胞基因的表達(dá)，而且引起血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而參與血管鈣化[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著AGEs干預(yù)濃度的增加，平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣沉積數(shù)量增加，同時(shí)RAGE表達(dá)增強(qiáng)，表明AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞鈣化與RAGE表達(dá)有關(guān)。單純鈣化培養(yǎng)細(xì)胞RAGE表達(dá)減弱,進(jìn)一步驗(yàn)證了AGEs通過與RAGE結(jié)合誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化。給予RAGE siRNA沉默RAGE基因后,RAGE表達(dá)降低，反向證明了AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化。

3.2 HSMCs鈣化與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活相關(guān) AGEs-RAGE的相互作用決定了平滑肌細(xì)胞的增殖和活化可能與RAGE激活了某些信號(hào)通路相關(guān)。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過對(duì)成骨細(xì)胞功能、分化的調(diào)節(jié)，在骨生長(zhǎng)發(fā)育、骨量平衡、骨折愈合等過程中發(fā)揮舉足輕重的作用，Wnt/β-catenin信號(hào)的激活促進(jìn)了Runx2、OPG、OSX、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、cyclinD1、基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)等與骨形成有關(guān)的蛋白表達(dá)。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被認(rèn)為是骨形成過程中最關(guān)鍵的信號(hào)通路[15]。平滑肌細(xì)胞的鈣化模型建立后，其細(xì)胞表型由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣煞置谛停⒆罱K發(fā)展為成骨樣細(xì)胞表型。KWAN等[16]認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞形成過程，并且β-catenin在成骨細(xì)胞線性分化中起到關(guān)鍵作用。有實(shí)驗(yàn)證明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了血管平滑肌細(xì)胞的鈣化[17]。CHENG等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制后，可降低DM模型小鼠主動(dòng)脈鈣化，其下游與骨形成相關(guān)的蛋白Col1A1、Runx2、Nox1表達(dá)下降。本研究發(fā)現(xiàn)，RAGE的表達(dá)隨著AGEs濃度的增加而增強(qiáng)，同時(shí)伴隨AGEs濃度的增加，β-catenin的表達(dá)相應(yīng)增加。進(jìn)一步說(shuō)明AGEs通過與RAGE結(jié)合后促進(jìn)了人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鈣化，同時(shí)可能激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促使下游蛋白β-catenin的表達(dá)增強(qiáng)。

OPG表達(dá)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,是β-catenin下游信號(hào)蛋白，在骨的形成、發(fā)展中扮演重要角色[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著AGEs濃度的增加，β-catenin及其下游蛋白OPG表達(dá)升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路在AGEs促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化中扮演了重要角色，初步提示可能是由于RAGE的介導(dǎo)作用引起；RAGE siRNA轉(zhuǎn)染后，平滑肌細(xì)胞鈣化明顯受到抑制，同時(shí)，β-catenin及其下游蛋白OPG的表達(dá)均降低，進(jìn)一步論證AGEs促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化可能是通過RAGE介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路完成。

近年研究發(fā)現(xiàn)，sRAGE作為RAGE的誘餌受體可以抑制AGEs與RAGE結(jié)合，從而防止動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[20]。本研究選用RAGE siRNA干預(yù)細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞鈣化受到抑制，RAGE、β-catenin及其下游蛋白OPG表達(dá)降低，說(shuō)明siRNA對(duì)β-catenin及其下游蛋白有下調(diào)機(jī)制。

綜上所述，AGEs通過與RAGE結(jié)合而介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能為RAGE激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使β-catenin下游蛋白OPG表達(dá)水平升高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，單純鈣化培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞RAGE、OPG表達(dá)水平低于對(duì)照，推測(cè)鈣化引起了平滑肌細(xì)胞的程序性死亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目降低從而使其蛋白表達(dá)降低，這也為進(jìn)一步研究鈣化導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制建立了基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：劉勇進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；何虎強(qiáng)進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集，并撰寫論文；曾宏進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；孫曉磊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；張雷進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；王偉明、胥雄飛進(jìn)行論文的修訂；何延政對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Mechanism of Action of Advanced Glycation End Products in the Regulation of Smooth Muscle Cells Calcification

HEHu-qiang，ZENGHong，SUNXiao-lei，ZHANGLei，WANGWei-ming,XUXiong-fei,HEYan-zheng，LIUYong*

DepartmentofVascularSurgery,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

*Correspondingauthor：LIUYong,Chiefphysician；E-mail：lyong74@163.com

Objective To investigate the mechanism of action of advanced glycation end products(AGEs) in regulating the receptor of AGEs(RAGE) for promoting calcification of human femoral arterial smooth muscle cells.Methods This study was carried out between January 2014 and March 2015.The tunica media of femoral artery was cut into tissue blocks of 1-2 mm in length for adherent culture.We selected the cultured smooth muscle cells of 3-8 generation for the experiment and divided them into 4 groups for further culture,group A with DMEM culture medium;group B using DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate;group C using DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate+AGEs 20 mg/L;and group D with DMEM+10 mmol/L β-sodium phosphate+AGEs 40 mg/L.Cells in each group were intervened for 96 hours.Three pairs of random RAGE siRNA were synthesized,and used to transfect the smooth muscle cells of group C with a concentration of 50 nmol/L.The efficacy of siRNA was measured 24 h later.The sequences with high transfection efficiency were selected for experiment.The calcium deposition in smooth muscle cells were observed by Von Kossa staining before and after RAGE-specific siRNA transfection.The expression levels of RAGE,β-catenin,and osteoprotegerin(OPG) were detected by Western blotting.Results In the non-transfected cells,there was no calcified plaque in group A,while group B showed obvious calcification plaques;in groups C and D,the number of cytoplasm and nucleus of the smooth muscle cells in red increased and calcified plaques increased significantly.After RAGE-specific siRNA transfection,the number of cytoplasm and nucleus of the smooth muscle cells in red in group C was decreased compared with that before transfection,and the formation of calcified plaque was inhibited.Before RAGE-specific siRNA transfection,the expression levels of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells differed significantly among the groups(P<0.05),specifically,the expression levels of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells were higher in group C than in group B,and they were higher in group D than in groups B and C(P<0.05).The expressions of RAGE,β-catenin,and OPG in smooth muscle cells in group C were lower after RAGE-specific siRNA transfection compared with those before transfection(P<0.01).Conclusion AGEs mediate smooth muscle cells calcification by regulating RAGE，the mechanism may be that RAGE activates the Wnt/ β-catenin signaling pathway and by which the expression level of β-catenin downstream protein OPG is increased.

Diabetes mellitus；Vascular calcification；Advanced glycation end products;Osteoprotegerin

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81270358)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y03

2016-08-12；

2017-02-08)

646000四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科

*通信作者：劉勇,主任醫(yī)師；E-mail：lyong74@163.com