高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂毒中五種生物胺含量

張文文金玥周金慧

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093；2農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），100093）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂毒中五種生物胺含量

張文文1，2金玥1，2周金慧1，2

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093；2農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），100093）

開發(fā)了一種靈敏準(zhǔn)確的測(cè)定蜂毒中組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素含量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）方法。蜂毒樣品用純水溶解后，離心取上清液，直接上機(jī)進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，蜂毒樣品中的五種生物胺在0.5～1000 ng/kg范圍內(nèi)線性良好，R2＞0.998，檢測(cè)限和定量限范圍分別為0.09～0.17 ng/kg和0.30～0.59 ng/ kg，在線性范圍內(nèi)的平均回收率范圍為80.9～111.4%，日內(nèi)RSD＜7.51%，日間RSD＜10.17%。該方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性，并且簡(jiǎn)單快速、綠色環(huán)保，適用于蜂毒中生物胺的測(cè)定。

蜂毒；生物胺；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

蜂毒一種由蜜蜂的毒腺和副毒腺分泌，存儲(chǔ)在毒囊中的有毒液體。當(dāng)處于危險(xiǎn)境況中，蜜蜂即會(huì)通過(guò)毒針將蜂毒液射入人體或者捕食者體內(nèi)，這種毒液很容易使人體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)危及生命[1]。蜂毒含有活性酶、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸和胺類等多種活性化合物[2]，因此具有抗癌[3]、防輻射[4]、抗菌[5]、消炎[6]和抗突變[7]等多種藥理學(xué)性質(zhì)和生物活性。傳統(tǒng)中醫(yī)中，人們成功地使用蜂毒療法減輕由類風(fēng)濕、多發(fā)性硬化癥關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)等引起的慢性疼痛。近幾年，關(guān)于蜂毒能夠阻礙白細(xì)胞遷移從而抑制局部炎癥，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素分泌和改善微循環(huán)的集體效應(yīng)已被發(fā)現(xiàn)，因此蜂毒已被廣泛用于某些免疫相關(guān)疾病、腫瘤、肌肉骨骼疼痛等疼痛疾病的治療。

組織胺（histamine，His）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腎上腺素（adrenaline，E）和去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）等生物胺是蜂毒中一類重要化合物。組織胺大部分由組氨酸在肥大細(xì)胞中脫羧形成，參與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能[8]。多巴胺在腦部分泌，在下丘腦和垂體部位發(fā)揮作用，是一種神經(jīng)遞質(zhì)[9]。90%以上的5-羥色胺由腸嗜鉻細(xì)胞釋放，是一種強(qiáng)力的血管收縮劑和平滑肌興奮劑[10]。組織胺、多巴胺和5-羥色胺分別在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周邊神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)不同部門的工作，并且在抑郁癥治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腎上腺素和去甲腎上腺素在腎上腺髓質(zhì)中合成，腎上腺素去甲基化后形成去甲腎上腺素，在緩解頻率心動(dòng)過(guò)緩，低血壓和呼氣性呼吸困難中起到協(xié)同作用[11]。

與蜂毒肽或酶的含量相比，蜂毒中生物胺的含量相對(duì)低[12]。但是，在蜂毒攝入人體時(shí)所引起的疼痛、瘙癢和過(guò)敏等反應(yīng)卻與這類低含量小分子含氮化合物密切相關(guān)[13-14]，然而，關(guān)于蜂毒中生物胺含量的測(cè)定目前尚無(wú)研究，因此本研究第一次探索對(duì)蜂毒中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

組織胺（CAS：51-45-6，純度＞99.9%）、多巴胺（CAS：51-61-6，純度＞99.9%）、5-羥色胺（CAS：50-67-9，純度＞99.9%）、腎上腺素（CAS：51-43-4，純度＞99.9%）、去甲腎上腺素（CAS：51-40-1，純度＞99.9%），均購(gòu)于Sigma公司；甲醇（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)），購(gòu)于Fisher Scientific公司；超純水。

Agilent 1290高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），6495三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司），Milli-Q純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司），G560E渦旋混勻器（美國(guó)Scientific Industries公司），CR22G高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）。

1000 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，分別溶于10.0 ml色譜純甲醇中，定容至10 ml，得到濃度為1000 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該溶液在4℃冰箱中避光可保存6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：通過(guò)使用純水系列稀釋1000 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，獲得五種生物胺的0.5 ng/ml，5.0 ng/ml，25 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml和1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與制備

蜂毒樣品采用電擊法獲得，每隔一周采用輕度電脈沖沖擊刺激蜜蜂，使蜜蜂釋放毒液到蜂毒采集裝置玻璃板上，待晾干呈粉末狀后收集進(jìn)行冷凍干燥，即為蜂毒凍干粉（crude bee venom lyophilized powder，CBVLP）樣品。所有CBVLP樣品在處理分析前儲(chǔ)存在-20℃的冷凍器中。

1.2.2 蜂毒樣品前處理方法

稱取蜂毒樣品10.0±0.1 g置于5 ml具塞離心管中，加入2 ml純水，渦旋10 min混勻，從離心管中吸取部分蜂毒試樣溶液用純水稀釋25倍，分別取1.0 ml母液和稀釋25倍之后的樣品溶液分別待分析。

1.2.3 HPLC-MS/MS條件

流動(dòng)相為0.1%甲酸水和甲醇溶液；洗脫條件見表1；PFP色譜柱（100×2.7 mm，3.0 μm，安捷倫），柱溫為30℃；流速為0.3 ml/min；進(jìn)樣量為2.0 μl。

表1液相梯度洗脫表

霧化器溫度：350℃，霧化器流速：6 l/min，霧化器壓力35 psi，毛細(xì)管電壓：2000 V，鞘流氣溫度：350℃，鞘流氣流速：9 l/min，錐孔電壓：1000 V。目標(biāo)化合物的母離子、子離子、傳輸電壓和碰撞能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

生物胺的極性很大，因此高水溶性而低溶于脂肪。所以實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了純水、乙腈和甲醇等不同極性萃取劑對(duì)化合物的提取效率。比較發(fā)現(xiàn)，純水顯示出更高的提取效率和更少的基質(zhì)效應(yīng)。與其他兩種有機(jī)溶劑相比，純水也更環(huán)保，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成的危害更小。因此，選擇純水作為最佳提取劑。

2.2 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

由于組織胺、5-羥色胺、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的結(jié)構(gòu)特征（圖1）十分相似，所以需要通過(guò)優(yōu)化色譜條件以獲得五種生物胺較高的響應(yīng)值、最佳的分離、尖銳的峰形以及適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間。首先對(duì)比了兩種常用的有機(jī)相乙腈和甲醇對(duì)生物胺的洗脫能力，在極性比較大的乙腈洗脫下，五種生物胺表現(xiàn)出更好的響應(yīng)值和分離度。然而，乙腈作為有機(jī)相時(shí)組織胺的保留時(shí)間比較靠前，在體積內(nèi)出峰，這種情況下將會(huì)由于內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量和鑒定。因此，選擇甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相，以增加溶質(zhì)保留并提高分辨率。

表2質(zhì)譜參數(shù)

圖1五種生物胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

五種生物胺的在電噴霧離子源正模式（Electronic Spray Ion，ESI）下的離子化效率，通過(guò)在水相流動(dòng)相中加入甲酸或乙酸來(lái)提高。實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了甲酸的比例從0.05%變化到0.5%時(shí)，五種生物胺的在儀器中的響應(yīng)值高低和峰形的尖銳程度。最終，選擇0.1%甲酸水和甲醇的組合作為最佳流動(dòng)相。優(yōu)化適當(dāng)?shù)奶荻认疵摮绦颍粌H可以增加目標(biāo)分析物的響應(yīng)值，還可以縮短總體的運(yùn)行時(shí)間。為了使五種生物胺的保留時(shí)間合適并且完全分離，甲醇的比例在0～98%改變，8分鐘內(nèi)五種生物胺出峰完畢。

表3方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限

五種生物胺（5.0 μg/g）的單標(biāo)工作溶液直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行過(guò)渡，以獲得最強(qiáng)豐度的分子離子峰。每種化合物在全掃描模式（Scan）下選取一個(gè)母離子，并優(yōu)化傳傳輸電壓（Fragmentor）將選取的母離子以最高的效率送入二級(jí)質(zhì)譜中；在選擇離子模式（selected ion mode，SIM）下選取兩個(gè)子離子，并優(yōu)化合適的碰撞能量（Collision energy，CE）得到最大強(qiáng)度的子離子色譜峰。同時(shí)，為了在MRM模式下獲得最佳響應(yīng)值，試驗(yàn)中對(duì)駐留時(shí)間、氣體溫度、干燥氣體流速、霧化器壓力、毛細(xì)管電壓、鞘氣溫度、鞘氣流量和噴嘴電壓等參數(shù)進(jìn)行了微調(diào)。在1000V～3500V范圍內(nèi)對(duì)毛細(xì)管電壓進(jìn)行優(yōu)化，由于目標(biāo)化合物的分子量很小，易發(fā)生源內(nèi)碎裂解，所以選擇2000V作為最佳毛細(xì)管電壓。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中去甲腎上腺素由于在離子源的高溫環(huán)境下容易失去一個(gè)H2O，所以其母離子選擇 m/z 152.1，而非 m/ z170.1?；贖PLC-MS/MS分析的五種生物胺的MRM圖譜見圖2。

圖2 5種生物胺的MRM色譜圖（10μg/kg）

3 方法驗(yàn)證

為了評(píng)估開發(fā)方法的性能，研究從選擇性、線性、檢測(cè)限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quan－titation，LOQ）、回收率和精密度方面對(duì)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)驗(yàn)證。

表4方法的回收率和日內(nèi)、日間RSD

由于缺乏空白樣品，質(zhì)譜檢測(cè)器中色譜峰很可能受到來(lái)自基質(zhì)的其他內(nèi)源性組分的干擾。測(cè)定峰純度的一種簡(jiǎn)單方法是用二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）[15]記錄的光譜進(jìn)行比較，通過(guò)DAD檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍上覆蓋蜂毒液樣品中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的每個(gè)峰的光譜，得以確認(rèn)該方法的選擇性。

實(shí)驗(yàn)中以加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品之間的分析物峰面積的差值為縱坐標(biāo)，添加濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線y=kx+b，其中y指峰面積（y=yn-y0；yn是添加樣品中目標(biāo)化合物的峰面積，y0是對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)化合物的峰面積），x為添加樣品中的添加量。為了提高較低濃度范圍的精確度，將加權(quán)因子1/x應(yīng)用于所有校準(zhǔn)曲線，每個(gè)校準(zhǔn)曲線包含6個(gè)濃度。在濃度范圍0.5～1000 ng/ml內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.998。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的斜率（k）和y截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）計(jì)算所有分析物的LOD和LOQ，并以此評(píng)價(jià)方法靈敏度（LOD=3S/k；LOQ=10S/k）[12]?；谠摲匠蹋?種生物胺的LODs和LOQs值分別確定為：組織胺0.09μg/kg和0.31μg/kg；多巴胺0.17μg/kg和0.59μg/ kg；5-羥色胺0.10μg/kg和0.30μg/kg，腎上腺素0.17μg/ kg和0.56μg/kg，去甲腎上腺素為0.14μg/kg和0.45μg/ kg。

回收率在三個(gè)添加濃度（多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素：0.2 μg/kg，2.0 μg/kg和20.0 μg/ kg；組織胺2.0 μg/kg，20.0μg/kg和200.0μg/kg）下獲得。分別測(cè)定質(zhì)控樣品（C），加入三種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)控樣品（B）和響應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）的目標(biāo)化合物濃度，通過(guò)公式[(B-C）/A]×100計(jì)算回收率，五種化合物在蜂毒樣品中的回收率高于80.95%，方法精密度由回收率的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來(lái)評(píng)價(jià)，日內(nèi)RSD范圍為0.17～7.51%之間，5批次的日間RSD小于10.17%，符合要求，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，適用于蜂毒中五種生物胺的定性定量分析。

4 結(jié)論

本研究第一次采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)蜂毒中的組織胺、多巴胺、5-羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素進(jìn)行了定性定量分析，樣品制備程序簡(jiǎn)單環(huán)保，分析方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠，對(duì)于今后采用生物胺含量的差異對(duì)不同亞種蜂毒進(jìn)行鑒別提供技術(shù)支撐。

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Determination of five ammonia amines in bee venom by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Zhang Wenwen1，2，Jin Yue1，2，Zhou Jinhui1，2
（1 Institute of Apicutural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093；2 Bee Product Quality Supervision and Testing Center Ministry of Agriculture，Beijing 100093）

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of histamine,dopamine,serotonin,epinephrine and norepinephrine in bee venom was developed.Bee venom samples were dissolved in pure water,centrifuged to take the supernatant,and analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The results showed that the five kinds of biogenic amines in the venom samples were linear in the range of 0.5～1000 ng/kg,R2＞0.998,the limitsof detection and the limits of quantification were 0.09～0.17 ng/kg and 0.30～0.59 ng/kg,the average recoveries range in the linear range is 80.9～111.4%,intraday RSD＜7.51%,interday RSD＜10.17%.The method has good precision and reproducibility,and is simple and rapid,green,suitable for the determination of biogenic amines in bee venom.

bee venom,biogenic amines,high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

張文文（1991-），女，碩士，蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全與分析，E-mail：bijihaierla@163.com

金玥（1985-），女，博士，蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全與分析，E-mail：yue_yue_jin@126.com；周金慧（1977-），男，博士，蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全與分析，E-mail：zhoujinhui@caas.cn