寧腎顆粒對IgA腎病大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡的影響?

趙 林，王志學(xué)，齊芳華，牟林茂，李安源

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021)

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【實(shí)驗(yàn)研究】

寧腎顆粒對IgA腎病大鼠腎臟系膜細(xì)胞凋亡的影響?

趙 林，王志學(xué)，齊芳華，牟林茂，李安源△

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021)

目的：研究寧腎顆粒對IgA腎病(IgAN)大鼠系膜細(xì)胞(MsC)凋亡的影響。方法：32只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、寧腎顆粒低劑量和高劑量組并復(fù)制IgAN模型，造模后藥物干預(yù)4周分別給予生理鹽水，生理鹽水，低、高劑量(12g/kg·d、24g/kg·d)寧腎顆粒。干預(yù)后，檢測尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白、系膜區(qū)病理、MsC的凋亡率、皮質(zhì)Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組的尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和24 h尿蛋白定量均有增高，系膜區(qū)病理損害加重，MsC凋亡率、皮質(zhì)區(qū)Bax蛋白表達(dá)均降低；較模型組，寧腎顆粒低劑量和高劑量組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白定量均減少，寧腎顆粒高劑量組系膜區(qū)病理損害減輕、MsC凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均升高。結(jié)論：寧腎顆?？蓽p輕IgAN模型大鼠的血尿、蛋白尿，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax蛋白表達(dá)促進(jìn)MsC凋亡，進(jìn)而抑制MsC異常增殖有關(guān)。

寧腎顆粒；IgA腎??；系膜細(xì)胞；凋亡

IgA腎病(IgA nephropathy， IgAN)是臨床常見原發(fā)性腎小球疾病[1]，其患病率在我國有快速增長趨勢[2]。其主要特征性病理表現(xiàn)為以IgA為主的免疫球蛋白在腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢的沉積。IgAN發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，常病程遷延，每年約有1%～2%的患者進(jìn)入終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)[3]，臨床治療有一定困難。寧腎顆粒是治療IgAN的臨床驗(yàn)方，前期研究明確其有效性及對系膜細(xì)胞異常增殖的影響[4-5]。該研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究寧腎顆粒對IgAN系膜細(xì)胞凋亡的影響，以明確其療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)系美國MBCHEM公司產(chǎn)品，Bax(ab5714)多克隆抗體、GAPDH (ab9485)多克隆抗體購自abcam公司，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗系北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒及流式細(xì)胞儀FACSCan均系美國BD公司產(chǎn)，計(jì)算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)(Alphaimager2200型)系美國Pharmacia Biotech公司生產(chǎn)，酶標(biāo)儀(Spectra Max M2型)購自美國MOLECULAR DEVICES公司，蛋白垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)膜器械， 均系BIO-RAD公司生產(chǎn)，恒流/恒壓電泳儀(EC250-90，Hybiad)購自IEC儀器公司，低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(IEC Micranax RF型)購自德國Beckman公司，病理切片機(jī)(Leica RM2135型)購自德國LEICA公司。

1.2 IgAN大鼠模型復(fù)制

根據(jù)湯穎[6]和陸慧瑜[7]等報(bào)道的方法，復(fù)制IgAN大鼠模型。運(yùn)用BSA+ LPS+四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)法建立實(shí)驗(yàn)性IgAN大鼠模型。32只大鼠分籠飼養(yǎng)于山東省立醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)室，人工照明明暗時(shí)間各半，飼養(yǎng)室濕度(55±5%)、溫度(22±2)℃，適應(yīng)1周。將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組(Con組)、模型組(Mod組)、寧腎顆粒低劑量組(NSL組)和高劑量組(NSH組)4組。用蒸餾水溶解BSA，最終濃度100g/L，按照400 mg/kg(即4 mL/kg)劑量隔天灌胃8周；蓖麻油0.3 ml/次，CCl40.1 ml/次每周皮下注射1次共9周；第6周靜脈注射LPS溶液0.05 mg(0.2 ml)1次，用生理鹽水溶解LPS，制成最終濃度0.25 g/L的LPS溶液。Con組隔天灌胃等量蒸餾水(4 ml/kg)共8周，每周皮下注射生理鹽水0.4 ml共9周；第6周給予生理鹽水0.2 ml，尾靜脈注射1次。

1.3 藥物干預(yù)

寧腎顆粒由黃芪、仙茅、仙靈脾、白花蛇舌草、生地、萆薢、金櫻子、覆盆子、益母草組成(6∶2∶2∶3∶2∶2∶2∶2∶3)，中藥配方顆粒為華潤三九產(chǎn)品(批號(hào)070415S～081251H)，造模9周后開始給藥干預(yù)。NSL組給予寧腎顆粒12 g/kg·d灌胃(相當(dāng)于臨床成人等效劑量的1倍)，NSH組給予寧腎顆粒24 g/kg·d灌胃(相當(dāng)于臨床成人等效劑量的2倍)，Con組和Mod組大鼠給予等體積0.9% NaCL溶液灌胃，藥物治療共4周。

1.4 標(biāo)本留取

第14周內(nèi)收集24 h尿液備用，第14周末處死大鼠。腹腔注射戊巴比妥鈉(3%、30 mg/kg)麻醉大鼠。固定大鼠，于劍突下剖開腹壁顯露膈肌，沿胸正中線剖開胸壁暴露心臟；剖開腹壁暴露腎臟，用 9# 針頭從心尖插入左心室，然后插入升主動(dòng)脈并固定，剪開右心耳用生理鹽水快速灌注(壓力為 85 cm 水柱)。待右心耳灌注出的液體澄清，且腎臟由紅褐色變?yōu)樯n白色后停止灌注，剖取腎臟分離皮質(zhì)以備進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 尿液紅細(xì)胞、蛋白測定

留取24 h尿液，定量尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測IgAN大鼠尿紅細(xì)胞數(shù)，考馬斯亮蘭法檢測IgAN大鼠24 h尿蛋白定量。

1.6 腎小球系膜區(qū)病理觀察

取少量腎組織在 4% 多聚甲醛中預(yù)處理24 h，然后取出標(biāo)本常規(guī)包埋切片。將標(biāo)本投入生物組織自動(dòng)脫水機(jī)分別進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，然后入石蠟包埋機(jī)包埋。取制備好的腎組織切片做常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎小球系膜區(qū)病理改變，形態(tài)分0～Ⅲ級。0級:正常腎小球；Ⅰ級：系膜區(qū)寬度大于毛細(xì)血管直徑呈節(jié)段性分布；Ⅱ級:系膜增生寬度大于毛細(xì)血管直徑呈彌漫性分布;Ⅲ級:系膜增生寬度呈團(tuán)塊狀聚集,彌漫指狀分布。

1.7 細(xì)胞凋亡率測定

單細(xì)胞懸液的配置[9]:取小塊兒腎組織剝?nèi)∑べ|(zhì)部分，置于不銹鋼網(wǎng)上(120目)、下置平皿，用剪刀剪碎，眼科鑷輕搓組織，邊搓邊用0.9%氯化鈉溶液沖洗，直至將組織搓完。采用銅質(zhì)濾網(wǎng)(300目)濾過平皿中的組織研磨混懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，采集細(xì)胞懸液低速離心2 min(800 r/min)；細(xì)胞凋亡或DNA含量的染色[9]：取0.1 ml單細(xì)胞懸液(1×105)，加入10%雞血紅細(xì)胞作內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)與樣本同步染色，加入碘化丙啶(PI) (PI: 50 mg/L， Triton-X100 1.0% )1 ml，置于2～8℃冰箱染色30 min，用銅質(zhì)濾網(wǎng)(500目)濾過，制備合格的單細(xì)胞懸液，即可上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blot檢測腎組織Bax蛋白表達(dá)

稱取大鼠腎組織50 mg用剪刀剪碎，研磨器內(nèi)研磨，常規(guī)組織總蛋白提取。根據(jù)BCA試劑盒操作說明測定樣本內(nèi)總蛋白質(zhì)含量，計(jì)算樣本內(nèi)總蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，接通電源，電壓70 V，進(jìn)行30 min預(yù)電泳，使膠中的雜質(zhì)跑出。上樣20 μg待測蛋白及5 μL的預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白電泳。第一階段電壓30 V 60 min，第二階段電壓100 V大約90 min。常規(guī)蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移后，封閉電轉(zhuǎn)移后模1 h。用5%脫脂奶封閉液稀釋Bax抗體(1∶500)或GAPDH抗體(1∶2 000)配制一抗反應(yīng)液。將PVDF膜浸入一抗反應(yīng)液中，置于搖床上搖蕩，4℃過夜。用1×TBST 洗膜3次后，將PVDF膜浸入二抗反應(yīng)液(1∶5 000)中，置于搖床上搖蕩，室溫下1 h。洗膜3次后，常規(guī)放射自顯影留存定影膠片，應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)掃描定量，計(jì)算PDGF-BB條帶與內(nèi)參的光密度比值作為其相對含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白定量

表1顯示，與空白對照組比較，模型組IgAN大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和24 h尿蛋白定量均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而應(yīng)用寧腎顆粒治療后，尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白定量較模型組均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2 寧腎顆粒對IgAN大鼠系膜區(qū)組織病理的影響

表2顯示，模型組大鼠腎臟組織病理系膜區(qū)增殖較空白組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；寧腎顆粒高劑量組腎臟系膜區(qū)增殖較模型組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而寧腎顆粒低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 寧腎顆粒對IgA大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響

表1圖1顯示，模型組大鼠系膜細(xì)胞凋亡率較空白對照組明顯降低(P<0.01)；寧腎顆粒高劑量組系膜細(xì)胞凋亡率較對照組提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而寧腎顆粒低劑量組未見明顯差異。

2.4 寧腎顆粒對IgA大鼠皮質(zhì)區(qū)Bax蛋白表達(dá)的影響

表1圖2顯示，模型組皮質(zhì)區(qū)Bax蛋白較空白對照組表達(dá)降低，寧腎顆粒高劑量組較模型組皮質(zhì)區(qū)Bax蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P=0.01)。

表1 寧腎顆粒治療后各組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白定量、系膜細(xì)胞凋亡、Bax蛋白表達(dá)情況比較±s)

注：與空白對照組比較：*P< 0.01；與模型組比較：&P<0.05 ，#P< 0.01(下同)

圖1 寧腎顆粒治療對各組大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響

組別鼠數(shù)病理改變/例0ⅠⅡⅢ空白組88000模型組80026*寧腎顆粒低劑量組80233寧腎顆粒高劑量組80431&

圖2 寧腎顆粒治療后各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bax蛋白表達(dá)注：從左至右依次為空白對照、模型組、寧腎顆粒低劑量組、寧腎顆粒高劑量組

3 討論

IgAN臨床特點(diǎn)以血尿?yàn)橹?，可伴有蛋白尿甚至出現(xiàn)腎病綜合征，部分病例遷延不愈而發(fā)展為終末期腎病。目前治療以免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物為主，但有時(shí)糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物的副作用讓患者較難接受，而中醫(yī)藥治療IgAN確有一定的療效。

“IgA腎病”在中醫(yī)學(xué)中無此病名。結(jié)合其臨床癥狀、體征、病程發(fā)展特點(diǎn)，IgA腎病屬于中醫(yī)“尿血、尿濁、水腫、腰痛、虛勞等范疇。課題組認(rèn)為，脾腎虛弱、濕熱內(nèi)蘊(yùn)為IgAN的重要病機(jī)，以健脾益腎、清熱利濕之法擬定寧腎顆粒。方中黃芪、仙靈脾、仙茅可溫補(bǔ)脾腎為君，輔以白花蛇舌草、萆薢、生地清熱解毒、利濕化濁，佐以金櫻子、覆盆子益腎固精，益母草以活血利水。組方用藥寒溫并用、攻補(bǔ)兼施，以奏補(bǔ)益脾腎、清利濕熱之效。前期臨床觀察顯示，寧腎顆粒聯(lián)合糖皮質(zhì)激素潑尼松治療小兒難治性腎病綜合征起到較好效果，且較為安全[5]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，寧腎顆粒對IgAN大鼠的腎臟有保護(hù)性作用，可以有效抑制系膜區(qū)增殖，抑制腎小球系膜區(qū)以IgA為主的免疫球蛋白沉積，且具有一定的量效關(guān)系[4]，但對于系膜細(xì)胞凋亡的影響尚不明確。

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式[9]。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制十分繁復(fù)，目前尚不十分明確，但近年研究人蛋白酶系統(tǒng)的聯(lián)級反應(yīng)和各種凋亡基因及其產(chǎn)物調(diào)節(jié)作用在細(xì)胞凋亡調(diào)控中十分重要。bcl基因家族是迄今研究最熱門和深入的凋亡調(diào)控基因之一。bax基因?qū)儆赽cl癌基因家族，這類基因本身不直接誘導(dǎo)凋亡，但能明顯加速死亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。另一方面，其高表達(dá)也能對bcl-2的凋亡抑制活性起到拮抗作用[11]。

研究表明，腎臟系膜細(xì)胞凋亡是防止MsC過度增殖的重要機(jī)制，是腎小球增生性疾病進(jìn)展得以控制或消除的方式之一[12-13]。在各種腎小球疾病早期，細(xì)胞凋亡可以抑制過度增殖的細(xì)胞，對機(jī)體器官、組織保持正常機(jī)能是有益的。但在腎臟病晚期，凋亡程度又與腎功能惡化呈正相關(guān)[14]。多數(shù)研究顯示，細(xì)胞凋亡不足與系膜增殖性腎炎的腎細(xì)胞數(shù)目增多相關(guān)。UDA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腎小球腎炎與Bcl-2基因表達(dá)異常相關(guān)。在IgAN患者腎活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)且陽性發(fā)現(xiàn)主要集中在腎小球系膜損傷區(qū)，這提示系膜增殖性腎炎的發(fā)生發(fā)展與Bcl-2表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致系膜細(xì)胞凋亡減少相關(guān)，系膜細(xì)胞增殖過度或凋亡不足可能是系膜增殖性腎炎系膜增生的重要因素[14]。本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，IgAN大鼠腎臟系膜細(xì)胞存在凋亡率下降。前期研究表明，寧腎顆粒能抑制IgAN系膜細(xì)胞的增殖[4]。本研究表明，寧腎顆粒能上調(diào)Bax蛋白表達(dá)促進(jìn)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的凋亡，可能進(jìn)而抑制系膜細(xì)胞的增殖。

綜上，寧腎顆粒可減輕IgAN模型大鼠的血尿、蛋白尿，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax蛋白表達(dá)促進(jìn)MsC凋亡，進(jìn)而抑制MsC異常增殖有關(guān)。

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Effects of Ning Shen Granule on the Apoptosis of Renal Mesangial Cells in Iga Nephropathy Rats

ZHAO Lin，WANG Zhi-xue，QI Fang-hua，MU Lin-mao， LI An-yuan△

(ShandongProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity，Jinan250021，China)

Objective: To research the effects of Ningshen Granule on apoptosis of mesangial cells (MsC) in rats with IgA nephropathy. Methods Thirty-two rats were randomly divided into normal control group, model group, Ningshen granula low-dose and high-dose groups (12 and 24 g/kg). The IgA nephropathy rats were established by lipopolysaccharide, bovine serum albumin and carbon tetrachloride. After the models were established, the rats of the four groups were administrated in the morning and evening on every day for consecutive 4 weeks. After the above treatment, red blood cell count of urine, 24 hours urine protein quantity, MsC apoptosis rate were detected. Expression of Bax protein of renal cortex tissue was detected by Western blot. Results: Compared with the control group, the red blood cell count of urine, 24 hours urine protein quantity, MsC apoptosis rate and the expression of Bax protein were significantly increased. Compared with the model group, the red blood cell count of urine and 24 hours urine protein quantity of the rats in Ningshen granula low-dose and high-dose groups were decreased. Compared with the model group, the MsC apoptosis rate and the expression of Bax protein in Ningshen granula high-dose group were decreased significantly. Conclusion： Ningshen granula could relieve the hematuria and albuminuria, and its mechanism may be related to up-regulation the expression of Bax protein in MsC, enhancement the apoptosis and inhibited the proliferation of MsC.

Ningshen granula；IgA nephropathy；Mesangial cells；Apoptosis

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007-124)

趙 林(1981-)，男，山東濟(jì)南人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究。

△通訊作者：李安源(1952-)，男，山東嘉祥人，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事小兒腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel：0531-68776357，E-mail：sdslyy999@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)06-787-04

2017-01-06