瑞香狼毒根中總香豆素的提取工藝研究

張等宏+陳娥+肖春芳+張遠(yuǎn)學(xué)+葉興枝+楊國(guó)才+沈艷芬+高劍華

摘要：為研究瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）根中總香豆素的提取工藝，以紫外可見分光光度法作為分析手段，以化合物瑞香苷為標(biāo)準(zhǔn)化合物，繪制了瑞香狼毒根中總香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為總香豆素得率的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。采用乙醇為提取溶劑，對(duì)冷浸、熱回流、超聲波輔助提取法比較發(fā)現(xiàn)，超聲提取效果最好。因此用單因素法對(duì)超聲輔助提取條件進(jìn)行了選擇，考察了提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)總香豆素提取的影響，確定了最佳單因素條件。乙酸乙酯作為提取溶劑、溫度55 ℃、提取時(shí)間40 min、料液比1∶15（g/mL）。選用的5種大孔吸附樹脂中對(duì)AB-8型樹脂純化效果最好，50%乙醇洗脫液對(duì)香豆素的純化效率可達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：瑞香苷；總香豆素；提取工藝；超聲輔助提取；大孔吸附樹脂

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）12-2328-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.032

Extraction Technology of Total Coumarines in Root of Stellera chamaejasme L.

ZHANG Deng-hong，CHEN E，XIAO Chun-fang，ZHANG Yuan-xue，YE Xing-zhi，

YANG Guo-cai，SHEN Yan-fen，GAO Jian-hua

（Enshi Academy of Agricultural Science/Enshi South-China Potato Research Center， Enshi 445000， Hubei，China）

Abstract： To study the extraction technology of total coumarin from the root of Stellera chamaejasme L.，the content of total coumarin is determined by UV spectrophotometry. This study has been used daphin as control，the content of total coumarin in root of Stellera was determined by standard curve. The yield of total coumarin is as the detective marker. Ethyl alcohol was used as extracts solvents，compared and analysis cold impregnation， hot reflux and ultrasonic assisted extraction. The results showed that ultrasonic assisted extraction were the best mehod. The effects of solvent，extraction temperature，extraction time and ratio of solid to liquid in extraction procedure on the extraction rate of total coumarins in Stellera was researched by single factor experiment. The optimal extraction technology of total coumarins in Stellera was：ethyl acetate solvent，extraction temperature 55 ℃，extraction time 40 min，the material-liquid ration 1∶15. The AB-8 was the most suitable type for the purification of total coumarin from Stellera among the five kinds of macroporous resin，the extraction efficiency of 50% ethanol eluent was 90%，get the most of coumarin.

Key words： daphin；total coumarin；extraction technology；ultrasonic assisted extraction；Daphnetin， Macroporous adsorption resin

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）是多年生的草本植物，為瑞香科狼毒屬，俗稱打碗花、斷腸草、饅頭花等，盛花期7～9月，色澤鮮艷[1-5]。分布在海拔2 000～4 000 m的干燥向陽(yáng)坡地[6，7]，在中國(guó)的北部和西南等地有大面積分布，在西北干旱地區(qū)具有很強(qiáng)的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力[8-11]，其根系可達(dá)地下1 m，生態(tài)適應(yīng)能力強(qiáng)，在逆境中生命力頑強(qiáng)。其根部有劇毒，常引起牛羊誤食中毒，嚴(yán)重影響放牧[11-16]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒對(duì)截形葉螨（Tetranychus truncates Ehara）、二斑葉螨（Tetranychus urticae Koch）和豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）具有較強(qiáng)的觸殺活性，其中石油醚部位和氯仿部位的活性最強(qiáng)，通過活性跟蹤分離確定了6個(gè)活性化合物，其中5個(gè)是香豆素類化合物，5個(gè)香豆素化合物對(duì)截形葉螨、二斑葉螨、豌豆蚜均表現(xiàn)出一定的觸殺活性，而化合物傘形花內(nèi)酯和瑞香苷具有很強(qiáng)的觸殺活性。為了實(shí)現(xiàn)瑞香狼毒殺蟲劑的制劑化研究，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，能夠高效快捷的提取出瑞香狼毒中的主要成分，本研究以瑞香苷作為瑞香狼毒中總香豆素的提取標(biāo)準(zhǔn)，以紫外分光光度計(jì)為檢測(cè)儀器，對(duì)提取方法及提取條件進(jìn)行研究，選擇最佳提取方法及最佳提取工藝，在此基礎(chǔ)上對(duì)提取物進(jìn)一步分離純化，以期得到高含量的殺蟲活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞香狼毒：瑞香狼毒根部試驗(yàn)樣品采自四川阿壩，陰干，切段，粉碎，備用。瑞香苷為分離得到。D101、D201、HPD400、HPD600、AB-8型大孔吸附樹脂，所用試劑均為分析純。

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SW-CJ-2G（瑞士Buchi公司）；循環(huán)水式多用真空泵SHB-B95（鄭州市亞榮儀器有限公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；UV2550 型紫外可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；JY98-3D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取10 mg瑞香苷單體化合物，乙醇定容至50 mL，吸取2 mL至比色皿中，在波長(zhǎng)245～600 nm之間掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為310 nm。

1.2.2 總香豆素含量測(cè)定 以瑞香苷為標(biāo)準(zhǔn)品，參照叢建明等[17]試驗(yàn)方法，進(jìn)行瑞香狼毒中總香豆素含量的測(cè)定。稱取10 mg瑞香苷單體化合物，置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度（0.20 g/L）得對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 mL分置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，于310 nm處測(cè)定其吸光度，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到方程為A=36.151x+0.031 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3，線性關(guān)系良好。稱取100 g樣品用95%乙醇提取3次，提取液濃縮至一定體積后，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，得到待測(cè)樣品。稱取待測(cè)樣品比重，將待測(cè)樣品于310 nm處測(cè)定吸光度，最后將結(jié)果代入所得曲線方程中，計(jì)算出x值，重復(fù)3次。通過上述方法計(jì)算總香豆素含量。

M=xV/m

式中，x為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為樣品定容體積（mL）；m為瑞香狼毒粉的質(zhì)量（g）。

1.2.3 比重測(cè)定 將定容后的樣品稱取其總質(zhì)量，減去容量瓶質(zhì)量即為樣品定容至500 mL體積時(shí)的比重，重復(fù)3次。

1.2.4 提取物制備 用超聲輔助提取法，以乙酸乙酯作為提取溶劑，溫度55 ℃，提取40 min，料液比 1∶15（g/mL，下同），濃縮陰干后備用。

1.2.5 提取物純化 將“1.2.4”制備的提取物用不同型號(hào)的大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，孔徑2 cm的玻璃柱填料300 g，經(jīng)堿洗（1% NaOH）酸洗（1% HCl）活化后，準(zhǔn)確稱取用“1.2.4”中方法制備好的1 g樣品，去離子水充分懸浮后上樣，分別用0、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液梯度洗脫2個(gè)柱體積，將得到的洗脫液分別減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，得到待測(cè)樣品。稱取待測(cè)樣品比重，將待測(cè)樣品于310 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，最后將結(jié)果代入“1.2.2”所得曲線方程中，計(jì)算出x值。

1.2.6 提取物的純化效率計(jì)算 用選取的超聲輔助方法提取得到的樣品中總香豆素含量為0.434 2 mg/g，純化后測(cè)定吸光度可以計(jì)算出洗脫液中香豆素含量，與加入的總香豆素比值得到香豆素的純化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝研究結(jié)果

2.1.1 總香豆素提取方法的選擇 狼毒根粉分別用冷浸、熱回流、超聲提取總香豆素，提取2 h，料液比1∶40（g/mL，下同），95%乙醇。熱回流溫度選擇80 ℃，超聲功率為300 W。由表1可知，冷浸提取出的香豆素含量最低，超聲提取效果最好，與其他2種提取方法差異顯著，因此選用超聲提取法對(duì)瑞香狼毒根中總香豆素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2 超聲提取溶劑的選擇 選用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水作為提取溶劑進(jìn)行提取溶劑的選擇，提取時(shí)間設(shè)為30 min，料液比1∶10，提取功率為300 W，常溫提取。由表2可知，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物中總香豆素含量顯著高于其他溶劑提取物，而乙醇提取物的比重顯著高于其他溶劑提取物，乙醇的滲透性強(qiáng)，提取出的樣品比重最大，可以將狼毒根中多數(shù)物質(zhì)提取出來(lái)，而乙酸乙酯提取物的比重低于乙醇提取物的比重，因此選用乙酸乙酯作為提取溶劑有利于對(duì)香豆素的進(jìn)一步純化。

2.1.3 超聲提取時(shí)間的選擇 選用乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行提取時(shí)間的選擇，料液比1∶10，提取功率為300 W，常溫提取。由表3可知，在40 min時(shí)總香豆素的含量達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總香豆素含量下降，長(zhǎng)時(shí)間的超聲振蕩可能引起香豆素化合物的分解，比重隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明其他非香豆素化合物進(jìn)入了提取液中，因此選用40 min作為最佳提取時(shí)間進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.4 超聲提取溫度的選擇 選用乙酸乙酯作為提取溶劑，提取時(shí)間為40 min，料液比1∶10，提取功率為300 W，進(jìn)行提取溫度的選擇。由表4可知，隨著提取溫度的增加比重呈增加趨勢(shì)，總香豆素含量在55 ℃達(dá)到最大值，因此選用55 ℃作為最佳提取溫度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.5 超聲提取料液比的選擇 選用乙酸乙酯作為提取溶劑，提取溫度為55 ℃，提取時(shí)間為40 min，提取功率為300 W，進(jìn)行料液比的選擇。由表5可知，隨著溶劑的增加，比重和總香豆素含量均呈增加趨勢(shì)，比重大于15后總香豆素含量增加不明顯而比重增加相對(duì)較多，說(shuō)明提取物中其他雜質(zhì)增加明顯，因此選用1∶15作為最佳料液比進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 純化制備研究結(jié)果

2.2.1 D101型大孔吸附樹脂的純化效果 由表6可知，D101型大孔吸附樹脂用水（0%）洗脫后，洗脫液中香豆素含量較少，純化效率和損失率分別為9.43%、90.57%；30%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為22.46%、77.54%；50%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為39.02%、60.98%；70%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為31.63%、68.37%；90%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為3.89%、96.11%。說(shuō)明D101吸附作用集中在30%～70%之間，占總香豆素含量的80%以上。

2.2.2 D201型大孔吸附樹脂的純化效果 由表7可知，D201型大孔吸附樹脂用水（0%）洗脫后，洗脫液中香豆素含量較少，純化效率和損失率分別為6.24%、93.76%；30%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為35.20%、64.80%；50%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為42.21%、57.79%；70%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為18.89%、81.11%；90%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為10.26%、89.74%。說(shuō)明D201吸附作用集中在30%～50%之間，占總香豆素含量的70%以上。

2.2.3 HPD400型大孔吸附樹脂的純化效果 由表8可知，HPD400型大孔吸附樹脂用水（0%）洗脫后，洗脫液中香豆素含量較少，純化效率和損失率分別為6.50%、93.50%；30%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為3.41%、96.59%；50%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為23.13%、76.87%；70%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為40.93%、59.07%；90%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為6.88%、93.12%。說(shuō)明HPD400吸附作用集中在50%～70%之間，占總香豆素含量的60%以上。

2.2.4 HPD600型大孔吸附樹脂的純化效果 由表9可知，HPD600型大孔吸附樹脂用水（0%）洗脫后，洗脫液中香豆素含量較少，純化效率和損失率分別為3.22%、96.78%；30%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為6.75%、93.25%；50%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為26.31%、73.69%；70%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為31.57%、68.43%；90%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為29.21%、70.79%。說(shuō)明HPD600吸附作用集中在50%～90%之間，占總香豆素含量的80%以上。

2.2.5 AB-8型大孔吸附樹脂的純化效果 由表10可知，AB-8型大孔吸附樹脂用水（0%）洗脫后，洗脫液中香豆素含量較少，純化效率和損失率分別為9.49%、90.51%；30%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為9.24%、90.76%，50%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為90.18%、9.82%；70%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為21.95%、78.05%；90%乙醇水溶液洗脫后對(duì)香豆素的純化效率和損失率分別為5.86%、94.14%。說(shuō)明AB-8吸附作用集中在50%洗脫液部分，占總香豆素含量的90%以上。

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)瑞香狼毒根的活性篩選及活性跟蹤分離發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物對(duì)截形葉螨、二斑葉螨和豌豆蚜具有較強(qiáng)的觸殺活性，具有一定的除草作用。其中以瑞香苷的殺蟲活性最強(qiáng)，本研究以活性化合物瑞香苷為標(biāo)準(zhǔn)化合物，繪制了狼毒根中總香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用乙醇為提取溶劑比較了冷浸、熱回流、超聲波輔助提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取出的總香豆素含量高、雜質(zhì)少、效果好。同時(shí)用單因素法對(duì)超聲輔助提取條件進(jìn)行了選擇，研究了提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)總香豆素提取的影響，確定了最佳單因素條件為乙酸乙酯作為提取溶劑，溫度55 ℃，提取40 min，料液比1∶15。

為了對(duì)提取物進(jìn)一步純化，選用了5種大孔吸附樹脂，對(duì)提取物進(jìn)行了純化處理。結(jié)果顯示，D101吸附作用集中在30%～70%之間，占總香豆素含量的80%以上；D201吸附作用集中在30%～50%之間，占總香豆素含量的70%以上；HPD400吸附作用集中在50%～70%之間，占總香豆素含量的60%以上；HPD600吸附作用集中在50%～90%之間，占總香豆素含量的80%以上；AB-8吸附作用集中在50%洗脫液部分，占總香豆素含量的90%以上。AB-8型化合物對(duì)香豆素類化合物具有明顯的純化效果，50%的乙醇水洗脫液對(duì)香豆素的純化效率可達(dá)90%以上，通過比較分析，選擇AB-8型大孔吸附樹脂進(jìn)行進(jìn)一步純化，以50%乙醇水洗脫液為主要活性部位。

本研究建立的提取工藝、檢測(cè)方法及純化方法為瑞香狼毒的進(jìn)一步開發(fā)及有效利用提供了理論依據(jù)，對(duì)中國(guó)設(shè)施農(nóng)業(yè)害蟲的防治具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] CUI H，JIN H，LIU Q，et al.Nematicidal metabolites from roots of Stellera chamaejasme against Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus[J].Pest Manag Sci，2014，70（5）：827-835.

[2] 張程輝，張煜明.瑞香狼毒防治舞毒蛾的研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2007（5）：40.

[3] LIU Y，LONG R，YAO T.Research progress on Stellera chamaejasme L.in grassland[J].Pratacul Sci，2004，21：55-61.

[4] XING F，SONG R.Population distribution pattern and dynamic of Stellera chamaejasme，a poisonous grassland plant[J].Pratacul Sci，2002.19：16-19.

[5] QUINTANA N，WEIR T L，DU J，et al.Phytotoxic polyacetylenes from roots of Russian knapweed Acroptilon repens（L.） DC.[J].Phytochemistry，2008，69：2572-2578.

[6] CAO C Y，F(xiàn)U Y，WANG W X，et al.Inhibition influence of extraction liquids from Stellera chamaejasme root on seed germination[J].J. Northeast Univ Nat Sci，2007，28：729-732.

[7] ZHOU S Q，WANG H，HUANG Z J，et al.Research on allelopathy of Stellera chamaejasme in decompose process in the soil on Alfalfa[J].Chin J Grassl，2008，30：78-32.

[8] XU Z H，QIN G W，LI X Y，et al.New biflavanones and bioactive compounds from Stellera chamaejasme L.[J].Acta Pharmaceutica Sinica，2001，36：668-671.

[9] YAN Z Q，GUO H R，YANG J Y，et al.Phytotoxic flavonoids from roots of Stellera chamaejasme L.（Thymelaeaceae）[J].Phytochemistry，2014，106：61-68.

[10] YANG G H，LIAO Z X，XU Z Y，et al.Antimitotic and antifungal C-3/C-3-biflavanones from Stellera chamaejasme[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2005，53：776-779.

[11] 王 偉，仝寶勝，師光祿，等.瑞香狼毒粗提物對(duì)朱砂葉螨的生物活性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：36-39.

[12] TIKHOMIROVA L I，MARKOVA L P，TUMBAA H. Coumarins from stellera chamaejasme L.[J].Khim Prir Soedin，1974，3：402.

[13] 劉文程，王 臣.瑞香狼毒的化學(xué)成分、生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（1）：26-30.

[14] 楊乾栩，程孟春，王 莉，等.活性數(shù)據(jù)離散分布下的瑞香狼毒抗腫瘤活性成分篩選研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（6）：927-931.

[15] 卓兆蓮，高 英，李衛(wèi)民，等.瑞香狼毒藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥材，2008，31（1）：135-137.

[16] 張國(guó)洲，王亞維，徐漢虹.瑞香狼毒殺蟲活性成分的提取與分離[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，27（4）：340-344.

[17] 叢建明，陳鳳清，野俊雙，等.草木犀香豆素的提取工藝及抑菌活性研究[J].天然產(chǎn)物研究開發(fā)與應(yīng)用，2014（26）：588-593.