UPLC指紋圖譜結(jié)合模式識別分析不同產(chǎn)地生/制何首烏

肖榕+林艷+雷思敏+章瑩+黃杰+夏伯候+李春+廖端芳+吳萍+林麗美

[摘要] 采用超高效液相色譜（UPLC），建立不同產(chǎn)地生/制何首烏二苯乙烯苷（TSG）的含量測定方法和指紋圖譜。大孔樹脂柱處理各樣品，UPLC分析，Waters ACQUITY UPLC@BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），乙腈-0.5%甲酸溶液梯度洗脫，流速0.3 mL·min^-1，波長254 nm，柱溫（25±5） ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大孔樹脂分離后藥材二苯乙烯苷含量均在25.0%以上；成功建立不同產(chǎn)地生/制何首烏藥材UPLC指紋圖譜；標(biāo)定了17個色譜峰，聚類分析不能完全將生/制首烏分開，而主成分分析可明顯地將其分為兩類；二苯乙烯苷是兩類何首烏自變量投影重要性指標(biāo)（VIP）差異最大的組分。前處理方法可獲得高含量的二苯乙烯苷，測定方法簡單，靈敏，可靠，可用于生/制何首烏的快速鑒別，可作為何首烏藥材整體質(zhì)量控制的方法之一。

[關(guān)鍵詞] 何首烏； 二苯乙烯苷； UPLC指紋圖譜； 聚類分析； 主成分分析

[Abstract] To establish a content determination method for 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside （TSG） of the crude/processed root of Polygonum multiflorum from different habitats in China and set up the fingerprint by using UPLC. Various samples were pretreated by macro-porous resin. Then UPLC analysis was performed on Waters ACQUITY UPLC@BEH C₁₈ chromatographic column （2.1 mm×50 mm，1.7 μm） at （25±5） ℃. A binary gradient elution system was composed of acetonitrile （phase A） and 0.5% acetic acid solution （phase B）. Detection was performed at the wavelength of 254 nm， and the mobile flow rate was set at 0.3 mL·min^-1. Results showed that the yield of extraction of the 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside from root of P. multiflorum was all over 25.0% after macro-porous resin separation； an exclusive UPLC fingerprint method of the crude/processed root of P. multiflorum from different habitats was successfully set up and 17 chromatographic peaks were calibrated. Cluster analysis can not entirely distinguish the crude one from the processed one， while principal component analysis absolutely can. 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside is the composition that has largest differences in variable importance in projection （VIP） between crude and processed root of P. multiflorum. The separating method can gain high-purity 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside， and the determination method is simple， sensitive， reliable and can be used in fast identifying the crude/processed root of P. multiflorum or as a method for overall quality control of root of P. multiflorum.

[Key words] Polygonum multiflorum； 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside； UPLC fingerprint； cluster analysis； principal components analysis

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根[1]，具有保護神經(jīng)、抗衰老、降血脂、抗動脈粥樣硬化和促進生長等多方面的藥理作用[2]，主要活性成分包含蒽醌類、二苯乙烯苷類、黃酮類、磷脂類等[3]。其中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（簡稱二苯乙烯苷，TSG）是何首烏最具代表性的特征性成分，有降低膽固醇，增強免疫，抗骨質(zhì)疏松，調(diào)節(jié)脂質(zhì)，抗動脈粥樣硬化等功效[4]，現(xiàn)已被2015年版《中國藥典》采納作為何首烏質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[5]。傳統(tǒng)上，何首烏有生首烏和制首烏之分。生首烏是取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切塊，干燥后所得；制首烏是生首烏經(jīng)不同炮制方法而成[2]。所以不同產(chǎn)地、是否炮制均影響何首烏TSG含量、化學(xué)成分及功效[6]。

目前，指紋圖譜結(jié)合模式識別方法已被應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制、差異標(biāo)記物的篩選等方面[7-8]。因此，本文采用UPLC建立何首烏指紋圖譜，并通過相似度分析、聚類分析、主成分分析等模式識別方法比較不同產(chǎn)地何首烏中TSG的含量，評價生/制何首烏指紋圖譜，尋找其主要的差異成分，為何首烏藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供新的參考方法。

1 材料

Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀，Empower 工作站，含四元梯度泵、自動進樣器（美國Waters公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP114型電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司，1/1萬]、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

二苯乙烯苷為實驗室自制獲得，通過NMR和MS鑒定其結(jié)構(gòu)，采用面積歸一化法通過UPLC檢測其純度大于98%；甲醇，乙腈（色譜純，Honeywell 公司）；甲酸（色譜純，天津市化學(xué)試劑研究所），水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

何首烏藥材由作者收集，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室龔力民副教授鑒定為何首烏的P. multiflorum的干燥塊根，其中S1～S9為生首烏，S10～S16為制首烏，具體見表1。

2 方法

2.1 樣品的前處理

何首烏藥材粉末，每份稱取20 g，共計48份。用8，6，6倍的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇水溶液至40 mL。濃縮液通過大孔樹脂分離，分別采用蒸餾水，50%，75%，95%乙醇溶液洗脫藥材，收集50%乙醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥得固體，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC@BEH-C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流速0.3 mL·min^-1，檢測波長254 nm，柱溫（25±5） ℃，進樣量2 μL，流動相乙腈（A）-0.5%甲酸（C），梯度洗脫（0～3 min，10%～15%A；3～8 min，15%～20%A；8～11 min，20%～30%A；11～14 min，30%～50%A；14～19 mim，50%～68%A；19～24 min，68%～69%A；24～25 min，69%～100%A）。

2.3 對照品溶液的制備

取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定為12.68 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對照品儲備液。取一定量對照品儲備液用甲醇逐次稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為50.72，101.44，202.88，304.32，405.76，507.20 mg·L^-1的對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

分別將不同產(chǎn)地何首烏樣品，取50%乙醇洗脫部位的何首烏各樣品粉末約2.0 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，UPLC分析。

2.5 線性關(guān)系考察

以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），二苯乙烯苷的回歸方程為Y=2×10⁶X-81 541，r=0.999 5，在0.101 4～1.014 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

取何首烏樣品，按供試品溶液的制備方法制備，用2.2項下條件連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜。以二苯乙烯苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012版），進行相似度評價[9]。結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD<0.61%，相對峰面積RSD<2.7%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取何首烏樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液6份，用2.2項下色譜條件進樣，記錄指紋圖譜。以二苯乙烯苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012版），進行相似度評價。結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD<0.61%，相對峰面積RSD均<2.2%，表明重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取何首烏樣品，按供試品溶液的制備方法制備，用2.2項下色譜條件進樣，分別于0，1，2，4，6，8，12 h依法進行UPLC測定并記錄色譜峰。以二苯乙烯苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積，利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012版），進行相似度評價。結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD<0.62%，相對峰面積RSD均<2.6%，表明12 h內(nèi)供試品溶液的成分是穩(wěn)定的。

3 結(jié)果

3.1 含量測定

UPLC測定得到不同產(chǎn)地何首烏樣品色譜圖，并計算各樣品中二苯乙烯苷的含量。所有批次樣品二苯乙烯苷的含量都達到25.0%以上，說明此樣品前處理方法分離效果良好，結(jié)果見表2。

3.2 指紋圖譜建立及相似度評價

3.2.1 參照峰的選擇 二苯乙烯苷作為何首烏中的主要成分，在每個批次中分離度都良好且峰面積較大，因此選擇二苯乙烯苷（4號峰）作為參照峰，將各色譜保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，相對保留時間在規(guī)定值的±3.0%以內(nèi)。

3.2.2 共有峰的確定 根據(jù)16批生、制何首烏藥材UPLC分析，發(fā)現(xiàn)17個共有峰，構(gòu)建何首烏UPLC色譜圖特征指紋圖譜，以此作為何首烏鑒別的依據(jù)。

3.2.3 相似度計算及對照指紋圖譜的生成 經(jīng)試驗測定得到16批不同產(chǎn)地生、制何首烏指紋圖譜，見圖1，將16批樣品指紋圖譜的CDF數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），進行相似度計算，設(shè)置樣品S5圖譜為參照圖譜，對照圖譜生成方法采用平均數(shù)法，時間窗寬度為0.3，自動匹配，生成對照指紋圖譜，見圖2，其相似度結(jié)果見表3。

3.2.4 何首烏指紋圖譜相似度評價 與16批何首烏所生成的對照指紋圖譜比較，各批次的何首烏樣品相似度在0.904～0.997，表明各批次何首烏質(zhì)量相對穩(wěn)定；由圖1，2可知各產(chǎn)地何首烏內(nèi)在成分與對照指紋圖譜基本相似，則表明各化學(xué)成分基本一致，但各峰的峰面積有所差異，表明各成分的量有所不同；從表3可以看出，樣品S1，S2，S8相似度相對較低，其余各樣品相似度較高，其中S8相似度最低。

3.3 不同產(chǎn)地何首烏藥材指紋圖譜聚類分析

以不同產(chǎn)地生、制何首烏樣品的共有峰峰面積為變量，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行聚類分析，結(jié)果見圖3。采用離差平方和（ward）法選取歐式距離平方和作為樣本測度。結(jié)果顯示，當(dāng)歐式距離平方和為15時，何首烏藥材可以分為2類，Ⅰ類S11，S14，S15，S16，S10，S12，S2，S13；Ⅱ類S6，S7，S4，S5，S9，S1，S3，S8?；痉譃樯?、制2類，只有S2被歸類成Ⅰ類，可能是由于其中二苯乙烯苷的含量稍較低所導(dǎo)致。

3.4 主成分分析（PCA）

為了合理評價、綜合分析何首烏的品質(zhì)，將何首烏共有峰峰面積進行主成分分析，將16批何首烏樣品的共有峰面積導(dǎo)入SIMCA 13.0中，得到3大特征主成分PC1，PC2，PC3，結(jié)果見圖4。從所得的方差貢獻率來看，建立的模型累計解釋能力參數(shù)R2Y、預(yù)測能力參數(shù)Q2分別為0.923，0.746，說明該模型的區(qū)分程度和預(yù)測程度都較好，所以對前3個主成分分析已基本能反映出何首烏的主要特征。

以主成分建立坐標(biāo)系，得到16批樣品的PCA得分圖和三維得分圖，見圖5，6，表明生、制何首烏之間有一定的區(qū)分，說明炮制后的何首烏與何首烏生藥在化學(xué)成分的量上具有一定的差異性。根據(jù)PLS-DA模型的VIP值來篩選導(dǎo)致差異性的主要化學(xué)成分，結(jié)果見圖7。一般認(rèn)為VIP>1的變量對分類起著關(guān)鍵作用，從圖7可知：4號峰、9號峰、3號峰的VIP均大于1，且4號峰的VIP值為3.2937，因此導(dǎo)致生、制何首烏最大差異的是4號峰（二苯乙烯苷）。根據(jù)PCA得分圖可以看出樣品S1～S9為一類，S10～S16為一類。從三維得分圖可以看出：不同產(chǎn)地制首烏經(jīng)炮制后都聚集在一起，差異不大；生何首烏除樣品S8外其他樣品基本聚集在一起。

4 討論

本試驗對樣品的提取方法，分離條件進行考察，最終前處理方法采用大孔樹脂進行分離純化，研究表明大孔樹脂具有吸附量大，易再生，可反復(fù)使用等特點[10]，經(jīng)過本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)此方法能得到較高含量和純度的二苯乙烯苷，是純化二苯乙烯苷的最佳工藝方法。

本試驗選用了甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.5%甲酸作為流動相，對檢測波長254，280，320 nm進行了優(yōu)選。最終確定采用Waters ACQUITY UPLC@BEH-C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）柱，乙腈-0.5%甲酸為流動相，254 nm為檢測波長[11-12]。得到UPLC特征指紋圖譜色譜峰較多，分離效果較好，此方法簡便，用時短，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

對16批樣品建立不同產(chǎn)地生/制何首烏指紋圖譜，共確認(rèn)17個共有峰，從所得圖譜可知各批次藥材的共有峰保留時間差異較小，但峰面積卻有一定差異，表明不同批次生/制何首烏之間部分化學(xué)成分的量有所不同。但根據(jù)其相似度可以看出，16批藥材的相似度計算結(jié)果均大于0.900，說明各批次藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定，有較好的一致性。聚類分析除S2樣品外，基本將生、制何首烏區(qū)分開來。結(jié)合二苯乙烯苷的含量測定結(jié)果，可能是由于S2的二苯乙烯苷含量低于其他各產(chǎn)地生何首烏的量，同時PLS-DA模型的VIP值表明對此成分貢獻最大峰為二苯乙烯苷，因此導(dǎo)致將S2分至制何首烏一類。但從主成分分析結(jié)果來看，完全將生/制何首烏區(qū)分開來；同時樣品S8較偏離生何首烏這組其他樣品，這與16批樣品的相似度結(jié)果基本一致，進一步驗證了所建指紋圖譜的可靠性與準(zhǔn)確性。

運用UPLC指紋圖譜結(jié)合模式識別對不同產(chǎn)地生/制何首烏藥材質(zhì)量進行評價，此識別模式能對不同產(chǎn)地生/制何首烏進行多指標(biāo)，整體性分析，此結(jié)論較之單一的測定更為全面準(zhǔn)確，且建立的方法簡便，可靠，可用于何首烏藥材質(zhì)量評價和控制。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]