茉莉酸甲酯調(diào)控下人參發(fā)狀根皂苷合成相關(guān)基因表達(dá)的研究

王康宇+于麗莉+張美萍+尹銳+林彥萍+趙明珠+孫春玉+王義

[摘要] 通過外源添加茉莉酸甲酯（MeJA），研究其調(diào)控液體培養(yǎng)條件下人參發(fā)狀根中皂苷生物合成途徑相關(guān)酶基因在誘導(dǎo)子作用時(shí)表達(dá)情況。以四年生吉林人參主根誘導(dǎo)的人參發(fā)狀根無性系為材料，利用香草醛-硫酸比色法測定MeJA 處理前后人參發(fā)狀根的總皂苷含量；同時(shí)，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定MeJA 處理前后人參發(fā)狀根中鯊烯合成酶（squalene synthase，SQS）、鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE）、氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidized squalene cyclase，OSC）、達(dá)瑪烷二醇合成酶（dammarenediol synthase，DS）、β-香樹脂合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）和環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase，CAS）基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明：獲得MeJA添加到人參發(fā)狀根中最佳添加濃度為6×10^-4μmol·L^-1、添加時(shí)間為22 d、作用時(shí)間為5 d；MeJA的添加可以提高人參發(fā)狀根中過氧化物酶（PPD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（PPD）的酶活性；經(jīng)過MeJA處理后人參發(fā)狀根中人參皂苷生物合成途徑的SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)變化均有顯著提高，然而CAS基因的表達(dá)變化不顯著。因此說明在添加MeJA處理后，皂苷生物合成途徑中SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因表達(dá)情況與PPD，CAT，PPO的酶活性的變化趨勢也相一致。

[關(guān)鍵詞] 人參發(fā)狀根； 人參皂苷生物合成； 茉莉酸甲酯（MeJA）； 基因表達(dá)

[Abstract] In order to obtain the expression of ginsenoside biosynthetic pathway related enzyme gene in ginseng hairy root under the control of elicitors， methyl jasmonate （MeJA） was added exogenously as elicitors. Ginseng hairy root clones induced by 4-year-old ginseng root was used as material， total saponin content in ginseng hairy root before and after MeJA treatment was determined by vanillin-sulfuric acid colorimetry， Meanwhile， relative expression of squalene synthase genes， squalene epoxidase genes， oxidized squalene cyclase genes， dammarenediol synthase genes， β-amyrin synthase genes， cycloartenol synthase genes before and after MeJA treatment were determined by Real-time PCR. The optimum conditions of MeJA which added to ginseng hairy root were obtained， the optimum additional concentration was 6×10^-4μmol·L^-1， the optimum additional time was 22 d， and the optimum action time was 5 d. The addition of MeJA could improve the enzymatic activity of peroxidase （PPD）， catalase （CAT） and peroxidase （PPD） in ginseng hairy root. The expression of SQS，SQE，OSC，DS and β-AS genes of ginsenoside biosynthetic pathway increased significantly after MeJA treatment， while the change of CAS gene expression were not significant. The expression of key enzyme SQS，SQE，OSC，DS and β-AS genes in ginsenoside biosynthetic pathway was consistent with the changes of PPD，CAT，PPO enzymatic activity.

[Key words] ginseng hairy root； ginsenoside biosynthesis； methyl jasmonic acid（MeJA）； gene expression

人參Panax ginseng C. A. Meyer是馳名中外的五加科人參屬植物，聞名遐邇的“東北三寶”之一[1]。吉林省是我國人參的主要產(chǎn)地，占全球人參總產(chǎn)量的70%，人參產(chǎn)業(yè)不僅是吉林省重要的經(jīng)濟(jì)組成部分，更是我國國民經(jīng)濟(jì)中最具特色的新興產(chǎn)業(yè)之一。人參中的主要活性成分為人參皂苷，按其化學(xué)性質(zhì)可分為：人參皂苷二醇型（A型），包括Ra，Rbl，Rb₂，Rc，Rd，Rh₂等；人參皂苷三醇型（B型），包括Re，Rf，Rg1，Rg₂，Rh1等；齊墩果酸型（C型），如Ro[2-3]。按苷元的基本類型可以分為：達(dá)瑪烷型、齊墩果酸型和奧克梯隆型[3-4]。人參組織培養(yǎng)中人參發(fā)狀根具有生長速度快，周期短，皂苷含量較高等特點(diǎn)，似的利用人參發(fā)狀根組織培養(yǎng)作為細(xì)胞工廠定向生產(chǎn)人參皂苷的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)問題。但目前，我國對人參發(fā)狀根的研究主要集中在發(fā)狀根的誘導(dǎo)[5-7]、有效成分的提取分析[8-9]，關(guān)于人參皂苷生物合成途徑中調(diào)控皂苷合成的關(guān)鍵酶在人參發(fā)狀根中的研究甚少。

研究表明茉莉酸類化合物可以在植物生長發(fā)育過程起到脅迫信號的重要作用[10]。外源性添加茉莉酸類物質(zhì)（茉莉酸或茉莉酸甲酯等）不僅對植物的生長起作用，也能顯著的影響植物的次級代謝活動[11-12]。當(dāng)外源添加時(shí)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，迫使植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物應(yīng)對各種脅迫病害[14-16]。因此，目前使用茉莉酸甲酯等小分子化合物作為誘導(dǎo)子成為了研究的熱門方法，刺激植物合成大量具有商業(yè)價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物[13，17]。

本研究以吉林人參為材料，誘導(dǎo)和篩選獲得人參發(fā)狀根無性系，通過篩選MeJA調(diào)控人參發(fā)狀根生物合成人參皂苷的最佳作用濃度，最佳添加時(shí)間、最佳作用時(shí)間的條件，從而研究MeJA調(diào)控人參皂苷生物合成途徑中重要的相關(guān)酶基因的表達(dá)情況。利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)檢測MeJA調(diào)控下人參皂苷生物合成途徑中重要相關(guān)酶基因的表達(dá)，不僅可以為研究誘導(dǎo)子調(diào)控人參皂苷的生物合成提供數(shù)據(jù)支持，更可以為人參發(fā)狀根體系作為細(xì)胞工廠定向生產(chǎn)人參皂苷提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為四年生人參主根誘導(dǎo)獲得的人參發(fā)狀根，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)-吉林省人參基因資源開發(fā)與利用工程研究中心提供。

人參皂苷Rg1單體對照品（批號110754-200826）采購于中檢所、茉莉酸甲酯購于美國Sigma公司、RevertAidTM first strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒采購于美國MBI公司、熒光實(shí)時(shí)定量qPCR試劑盒購于德國Qiagen公司、其他試劑均購于百泰克公司和北京化工廠（分析純）。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司的7500型、高速冷凍離心機(jī)為美國Thermo公司的Fresco21型、恒溫振蕩培養(yǎng)箱為哈東聯(lián)公司的HZQ-F160型、超微量核酸蛋白濃度檢測儀為德國耶拿公司的Scandrop250型。

2 方法

2.1 篩選吉林人參發(fā)狀根無性系

配置1/2MS固體培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿背面畫1.0 cm×1.0 cm的正方格用于測量人參發(fā)狀根生長速度。選取生長良好的人參發(fā)狀根切取發(fā)狀根根尖部位1.0 cm長度，接于畫好正方格的平板上于黑暗處培養(yǎng)。選擇生長狀況良好的，接種于1/2MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為22 ℃，110 r·min^-1振蕩培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 茉莉酸甲酯（MeJA）的制備及添加

利用本實(shí)驗(yàn)室條件下構(gòu)建好的人參發(fā)狀根動力培養(yǎng)模型[18]，分別考察MeJA最佳添加濃度、時(shí)間、作用時(shí)間對人參發(fā)狀根的影響。選擇配置MeJA溶液的基礎(chǔ)濃度為200 μmol·L^-1，設(shè)置7個(gè)添加濃度梯度分別為0，1，2，3，4，5，6 μL，篩選出MeJA最佳添加濃度；設(shè)置7個(gè)添加時(shí)間梯度分別為第14，16，18，20，22，24，26天，添加已經(jīng)篩選出最佳添加濃度的MeJA，篩選出MeJA最佳添加時(shí)間；在已經(jīng)確定MeJA最佳添加濃度和最佳添加時(shí)間的條件下，設(shè)置7個(gè)MeJA作用時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7 d，作用時(shí)間過后更換新鮮1/2MS培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，篩選出MeJA最佳作用時(shí)間。每次篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)，均設(shè)置相同條件下不做任何處理的5瓶對照組，篩選實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 人參發(fā)狀根生長量及皂苷含量的測定

以干、鮮重為指標(biāo)進(jìn)行發(fā)狀根生長量的測定，干重為將新鮮材料取出后置于40 ℃以下條件的烘箱中烘干至恒重。

鮮重增加量（g/瓶）=收獲時(shí)鮮重（g/瓶）- 接種時(shí)鮮重（g/瓶）

干重增加量（g/瓶）=收獲時(shí)干重（g/瓶）- 接種時(shí)干重（g/瓶）

人參發(fā)狀根中總皂苷提取方法是利用的索氏回流提取法、總皂苷含量檢測方法是使用的硫酸香草醛-硫酸比色法 [18-19]。以人參皂苷Rg1對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度對照品吸光度為縱坐標(biāo)，繪制人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.230 7X+0.002 7，R²=0.996 8，從而可以檢測出待測樣本中皂苷含量。

2.4 過氧化物酶（PPD）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化氫酶（CAT）活力的測定

稱取1.0 g發(fā)狀根于研缽中，加入2 mL磷酸緩沖液（PPO活力pH 8.0，POD活力pH 5.5，CAT活力pH 7.8）充分研磨后，將勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，再次向研缽中加入1.5 mL磷酸緩沖液，充分沖洗研缽后，將其轉(zhuǎn)入離心管中，8 000 r·min^-1離心10 min（POD，CAT），4 000 r·min^-1離心15 min（PPO），取上清液3 mL至于干凈試管中。向空白管和測定管中依次加入0.5 mol·L^-1磷酸緩沖液2.5 mL（POD活力pH 5.5），4 mL（PPO活力pH 8.0），3 mL（CAT活力pH 7.8）。隨后分別對POD，CAT，PPO活力進(jìn)行測定。

2.4.1 POD活力測定[20] 在已經(jīng)準(zhǔn)備好的預(yù)處理溶液中加入1.0 mL 2% H₂O₂溶液、1.0 mL 0.5 mol·L^-1愈創(chuàng)木酚溶液和0.5 mL酶溶液。先將對照組置于沸水浴中5 min使加入的酶失活，然后對照組和待測組同時(shí)置于37 ℃水浴處理10 min，取出后分別加入2 mL 20% TCA溶液終止反應(yīng)，最在470 nm處檢測A，并計(jì)算POD活力。POD活力=ΔA470 nm /（0.01×T） ×D（T為反應(yīng)時(shí)間；D為稀釋倍數(shù)）。

2.4.2 PPO活力測定[20] 在已經(jīng)準(zhǔn)備好的預(yù)處理溶液中加入1 mL 0.2 mol·L^-1兒茶酚溶液，向?qū)φ战M和待測組中分別加入1 mL酶溶液。置于37 ℃水浴處理10 min，取出后立即加2 mL 20% TCA溶液混勻終止反應(yīng)，最后在525 nm處檢測A，并計(jì)算PPO活力。PPO活力=ΔA525 nm/（0.01×t） ×D（T為反應(yīng)時(shí)間；D為稀釋倍數(shù)）。

2.4.3 CAT活力測定[20] 在已經(jīng)準(zhǔn)備好的預(yù)處理溶液中加入2 mL蒸餾水，在待測組中加入0.4 mL酶溶液，置于25 ℃水浴中預(yù)熱處理3 min后加入0.6 mL 0.1 mol·L^-1的H₂O₂，最后在240 nm處檢測A，并計(jì)算CAT活力。CAT活性=（ΔA240×VT）/（0.1×V1×t×FW）（VT為粗酶溶液總體積；V1為使用粗酶溶液體積；FW為待測樣本鮮重；t為反應(yīng)時(shí)間）。

2.5 MeJA對人參發(fā)狀根中皂苷生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5.1 吉林人參發(fā)狀根的總RNA的提取 利用Trizol法提取吉林人參發(fā)狀根的總RNA。對總RNA使用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化處理，并將其回溶于20 μL DEPC處理過的ddH₂O中，最后利用核酸濃度檢測儀Scandrop250測定RNA濃度。

2.5.2 人參發(fā)狀根RNA的反轉(zhuǎn)錄 利用美國MBI公司的RevertAidTM first strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR的引物設(shè)計(jì)與合成 利用Vector NTI Advance 11.0軟件設(shè)計(jì)GADPH，SQS，SQE，OSC，DS，β-AS，CAS基因的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物，并委托由華大基因（BGI）公司完成合成，引物序列見表1。

2.5.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系參照試劑盒，根據(jù)常規(guī)PCR結(jié)果設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，每個(gè)模板3次重復(fù)。PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性 95 ℃ 10 min；變性 95 ℃ 15 s；退火60 ℃ 1 min；延伸72 ℃ 30 s。將熒光實(shí)時(shí)定量PCR過程中收集的全部數(shù)據(jù)，使用美國ABI公司提供的SDS V2.3軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，并計(jì)算2-ΔΔCT，獲得每個(gè)基因的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 吉林人參發(fā)狀根無性系的篩選

本實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)獲得的吉林人參的發(fā)狀根通過單根培養(yǎng)，共篩選出23個(gè)人參發(fā)狀根無性系，并將其命名為R1-R23。當(dāng)培養(yǎng)到第3天時(shí)，人參發(fā)狀根在1/2MS平板培養(yǎng)中開始有明顯伸長；當(dāng)培養(yǎng)到第12天時(shí)，人參發(fā)狀根的伸長長度約為剛培養(yǎng)時(shí)長度的2倍，且出現(xiàn)較多分枝；當(dāng)培養(yǎng)到第28天時(shí)，人參發(fā)狀根伸長長度約為剛培養(yǎng)時(shí)長度的4倍，且出現(xiàn)根系的分枝上再次分枝，伴隨愈傷化現(xiàn)象出現(xiàn)；當(dāng)培養(yǎng)到第35天，發(fā)狀根的分枝可達(dá)到30根以上，見圖1。綜合比對結(jié)果，人參發(fā)狀根系無性系R9在35 d培養(yǎng)周期中，其生長速度較快，能夠產(chǎn)生較多分枝，主根與分枝均呈現(xiàn)較高透明程度，并且顏色為乳白色，愈傷化程度較低，與其他22個(gè)人參發(fā)狀根無性系相比優(yōu)勢顯著，因此，確定R9人參發(fā)狀根無性系為最優(yōu)材料，并將其轉(zhuǎn)移到1/2MS液體培養(yǎng)基中在22 ℃，150 r·min^-1，暗培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

3.2 MeJA對人參發(fā)狀根生長量與皂苷含量的影響

在篩選最佳添加濃度、添加時(shí)間和作用時(shí)間時(shí)MeJA對人參發(fā)狀根的生長量、皂苷含量的影響顯著，最佳條件下處理組的生長量和皂苷含量高于對照組。本實(shí)驗(yàn)通過篩選獲得MeJA最佳添加濃度為6×10^-4μmol·L^-1、最佳添加時(shí)間為22 d，最佳作用時(shí)間為5 d，見圖2。

3.3 MeJA對人參發(fā)狀根中PPD，PPO，CAT 3種酶活力的影響

在MeJA的最佳添加條件下，分別檢測了POD，CAT，PPO的酶活性，見圖3。結(jié)果顯示：POD酶活力在第6小時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)小峰值。隨著MeJA作用時(shí)間的增加，POD酶活力也升高，當(dāng)POD酶活力在第20小時(shí)達(dá)到了最大值，測試組POD酶活力比對照組高1.40倍。隨著作用時(shí)間繼續(xù)增加，POD酶活力不斷降低，當(dāng)36 h后時(shí)POD酶活力與對照組的基本接近。PPO酶活力隨著MeJA作用時(shí)間增加逐漸升高，當(dāng)?shù)降?8小時(shí) PPO的活力達(dá)到了最大值，隨著酶活力開始下降，24 h后PPO酶活力與對照組的逐漸接近。CAT酶活力在第6小時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)小峰值，隨著MeJA作用時(shí)間的不斷增加，測試組CAT酶活力也不斷升高，CAT酶活力在第14小時(shí)達(dá)到了最大值，測試組CAT酶活力比對照組高1.43倍。隨著作用時(shí)間不斷增加，CAT酶活力開始逐漸降低，24 h后CAT酶活力與對照組的基本接近。因此，POD，PPO，CAT這3種作為保護(hù)植物面對外界刺激啟動應(yīng)激反應(yīng)的酶類，同時(shí)還可以清除應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的活性氧。隨著MeJA在調(diào)控人參發(fā)狀根的作用時(shí)間的不斷增加，POD，CAT，PPO這3種保護(hù)酶類的活性也隨之升高，清除MeJA刺激人參發(fā)狀根應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生活性氧能力也不斷提升，最終可以起到保護(hù)發(fā)狀根細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，從而增加人參發(fā)狀根對外界的抗性。

3.4 MeJA調(diào)控人參發(fā)狀根中皂苷生物合成相關(guān)基因表達(dá)研究

本實(shí)驗(yàn)研究了MeJA對人參發(fā)狀根中人參皂苷生物合成的SQS，SQE，OSC，DS，β-AS，CAS基因表達(dá)的影響，見圖4。0 h作用的作為未經(jīng)處理的對照組，經(jīng)過MeJA處理后的人參發(fā)狀根與對照組相比，SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)變化均有顯著提高。結(jié)果表明：在添加MeJA調(diào)控后第12小時(shí)，SQS基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，高于對照組8.2倍；在添加MeJA調(diào)控后第24小時(shí)，SQE基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，高于對照組11.04倍；在添加MeJA調(diào)控后第4小時(shí)，OSC基因的表達(dá)量呈現(xiàn)小幅度的上升，隨后又呈現(xiàn)下降，在調(diào)控后第8小時(shí)，OSC基因表達(dá)量再次呈現(xiàn)上升，直到第16小時(shí)OSC基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，高于對照組11.38倍，隨著作用時(shí)間繼續(xù)增加，其表達(dá)量逐步下降，但始終高于對照組。在添加MeJA調(diào)控后第20小時(shí)，DS和β-AS基因的表達(dá)量分別達(dá)到最大值，且分別高于對照組13.91，12.59倍。然而在添加MeJA調(diào)控后的人參發(fā)狀根與未經(jīng)處理的對照組發(fā)狀根相比CAS基因的表達(dá)量變化不顯著。

4 討論

外源性添加茉莉酸類物質(zhì)（茉莉酸或茉莉酸甲酯等）不僅對植物的生長起作用，也能顯著的影響植物的次級代謝活動。當(dāng)外源添加時(shí)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，迫使植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物應(yīng)對各種脅迫病害[10-16]。因此，目前使用茉莉酸甲酯等小分子化合物作為誘導(dǎo)子成為了研究的熱門方法，刺激植物合成大量具有商業(yè)價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。

本實(shí)驗(yàn)通過對吉林人參發(fā)狀根外源添加MeJA作為誘導(dǎo)子，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：在添加MeJA調(diào)控人參發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)下，不僅可以促進(jìn)懸浮培養(yǎng)條件下的人參發(fā)狀根的生長，更可以定向影響人參發(fā)狀根中皂苷生物合成。在MeJA添加刺激作用下，人參皂苷生物合成途徑中SQS，SQE，OSC，DS，β-AS，CAS等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)是一種動態(tài)的變化，通過MeJA刺激作用SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)能發(fā)生快速響應(yīng)，在添加作用6 h后，這5種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)迅速升高。黃超等[21]利用釩酸鹽小分子化合物作為誘導(dǎo)子，添加到人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中，研究發(fā)現(xiàn)：處理組中SQS，SQE，DS基因的表達(dá)量分別高于對照組7.6，10.3，17.8倍，同時(shí)處理組中CAS基因的表達(dá)量與對照組相比變化不顯著。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得出的處理組中SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)量分別高于對照組的結(jié)論基本相一致。因此，在添加MeJA處理后，人參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)與總皂苷含量變化的趨勢相一致。

在人參皂苷生物合成代謝過程中，SQS基因被認(rèn)定是一個(gè)起十分關(guān)鍵作用的限速酶基因，是人參皂苷合成的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，控制皂苷中碳元素的流向。通過添加MeJA刺激時(shí)，SQE基因的表達(dá)比SQS基因的表達(dá)具有更高的持續(xù)性和更強(qiáng)的表達(dá)作用，推測當(dāng)受到MeJA刺激時(shí)，SQE基因在人參皂苷合成途徑中的關(guān)鍵作用比SQS基因更為重要。DS和β-AS基因表達(dá)量的最高峰值出現(xiàn)于MeJA刺激后的20 h左右，比SQS，SQE，OSC基因表達(dá)最大峰值稍晚，見圖5。此外，CAS基因是萜類化合物中甾醇類中的相關(guān)基因，從而出現(xiàn)表達(dá)量變化平穩(wěn)，變化不顯著。因此，這些基因表達(dá)規(guī)律的結(jié)果體現(xiàn)了人參皂苷生物合成代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)存在著空間時(shí)序性的相關(guān)理論。

外源添加MeJA作為誘導(dǎo)子，可以引發(fā)植物的防御反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加MeJA 調(diào)控作用6 h后PPD與CAT的酶活力在開始升高，當(dāng)添加20 h和14 h后分別達(dá)到酶活力的最大峰值，隨著添加MeJA調(diào)控時(shí)間繼續(xù)增長，到達(dá)36～72 h時(shí)測試組中PPD與CAT的酶活力逐漸恢復(fù)到與對照組一致的水平；在添加MeJA 調(diào)控作后從開始到第22小時(shí)測試組中PPO的酶活力始終高于對照組，達(dá)到24 h時(shí)測試組中PPO的酶活力逐漸恢復(fù)到與對照組一致的水平。

同時(shí)，在人參發(fā)狀根關(guān)鍵酶基因的表達(dá)方面也有著變化，在添加MeJA調(diào)控作用的第6～8小時(shí)中，人參皂苷生物合成代謝途徑中的SQS，DS，β-AS關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量開始升高，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到12～14 h這3個(gè)基因的表達(dá)量處于最大峰值，隨后開始逐漸下降；在添加MeJA調(diào)控作用的第2～24小時(shí)中，OSC關(guān)鍵酶基因表達(dá)量始終高于對照組，分別在第4和第16小時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)峰值，在添加24 h后開始逐漸降低；在添加MeJA調(diào)控作用的第12～24小時(shí)中，SQE關(guān)鍵酶基因表達(dá)量始終于高于對照組，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到第24小時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)最大峰值，隨后開始下降。因此，在添加MeJA調(diào)控人參發(fā)狀根后，PPD，CAT和PPO的酶活力變化趨勢與人參皂苷生物合成代謝途徑中關(guān)鍵酶SQS，SQE，OSC，DS，β-AS基因的表達(dá)量變化趨勢是相一致的。

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