三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中l(wèi)c3b 基因的表達分析

黃天晴 王星然 王彥娜 孫慧智 韓英

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中l(wèi)c3b 基因的表達分析

黃天晴 王星然 王彥娜 孫慧智 韓英

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

旨在證明細胞自噬與三倍體雌性虹鱒性腺敗育的關系。利用RT-PCR 擴增虹鱒自噬基因lc3b（Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，lc3b）的編碼區(qū)序列，通過透射電鏡觀察三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中自噬小體的形態(tài)，結合不同發(fā)育階段性腺中l(wèi)c3b 基因和蛋白的表達，來證明細胞自噬的發(fā)生。結果表明，在200 dpf-270 dpf（Days post fertilization，dpf）這個發(fā)育階段，lc3b 基因以及自噬蛋白LC3B-II / LC3B-I的表達處于相對較高的水平，在這個時期內，都觀察到了自噬體結構的存在。這些結果證明了性腺細胞自噬為三倍體雌性虹鱒性腺敗育的主要原因之一。

三倍體；虹鱒；自噬；LC3B；性腺發(fā)育

虹鱒作為主要冷水性養(yǎng)殖魚類，其不育的雌性三倍體個體較二倍體具有更多的生長優(yōu)勢，且能夠避免生殖死亡而得到廣泛應用。然而，虹鱒雌性三倍體不育的調控機制至今還不十分明確，使其規(guī)?；N受到限制。近年來，圍繞三倍體虹鱒性腺發(fā)育的組織學，細胞學開展了系列研究。實驗表明，三倍體雌性虹鱒發(fā)育至受精后一段時間，卵泡敗育并且重新分化，出現(xiàn)類生精樣細胞，雌激素水平逐漸降低，雄激素水平逐漸升高，呈現(xiàn)了類雄性化的發(fā)育趨勢［1］。究竟是何種細胞過程導致了這種顛覆性的變化，還不得而知。

自噬是指一些需降解的蛋白質和細胞器等胞漿成分被包裹成自噬小體，并最終運送至溶酶體降解的過程，為細胞再利用產生能量［2］。細胞在受到外界壓力與刺激時，細胞自噬會起到保護作用，消化與代謝掉細胞廢物從而維持在正常狀態(tài)［3］。同時，自噬也是一把雙刃劍，往往和細胞凋亡同時出現(xiàn)［4］。細胞凋亡和自噬被認為是細胞死亡機制的連續(xù)部分，自噬為凋亡所必需，自噬與凋亡共同促進細胞死亡［5］。細胞自噬過程在進化過程中是高度保守的，用于降解并消除細胞中多余以及受損的結構，例如線粒體等［6］。細胞自噬中最明顯的形態(tài)結構是部分細胞質與細胞器被雙層膜結構的囊泡包裹起來，形成自噬小體，然后自噬小體與溶酶體結合，溶酶體中的水解酶成分可以將自噬小體內的物質降解［7］。細胞自噬的調控機制非常復雜，在酵母中已經有30 多種自噬相關基因atg（Autophagy-related genes，atg）被鑒定出來［8］。細胞自噬對哺乳動物的卵泡閉鎖起到重要的作用，在調節(jié)卵泡細胞重塑的過程中起到重要作用［9］。LC3B 蛋白為Atg8 在高等動物中的對應蛋白［10］。在細胞發(fā)生自噬時，水溶性的LC3B- Ⅰ轉變?yōu)橹苄缘腖C3B- Ⅱ，并結合到自噬小體膜上直到與溶酶體結合［11］。因此，LC3B 蛋白表達的水平高低在一定程度上可以反映細胞的自噬程度［12］。

在三倍體雌性虹鱒發(fā)育的過程中，性腺發(fā)生了重塑，為了驗證細胞自噬在三倍體雌性虹鱒性腺敗育過程中起到的作用，本研究擬通過透射電鏡觀察不同發(fā)育階段性腺中自噬小體的形態(tài)，并檢測不同發(fā)育階段自噬基因lc3b 的表達，來證明細胞自噬的發(fā)生。利用Western blot 實驗來檢測LC3B-II / LC3B-I的表達，闡述其主要的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與飼養(yǎng) 本實驗的三倍體雌性虹鱒卵均按照Espinosa［13］的方法得到。三倍體雌性虹鱒與二倍體雌性虹鱒飼養(yǎng)于黑龍江水產研究所（哈爾濱）。受精后的虹鱒魚卵放置于10℃的孵育槽培養(yǎng)，直到受精后24 h 移至0.3 m3水箱內，帶有水循環(huán)系統(tǒng)，水溫始終控制在（10+0.1）℃，光周期為12L∶12D。受精54 d 以后，魚苗被轉移到不同的水箱內，恒定溫度為12℃，每天定時投喂虹鱒商業(yè)飼料。

1.1.2 實驗試劑 反轉錄試劑盒，PMD-18T 載體，rTaq 酶，限制性內切酶均購于TaKaRa 公司，質粒小提試劑盒，熒光定量試劑盒，DNA marker 與蛋白marker 購自全是金公司，膠回收試劑盒購于Axygen公司，Western blot 相關試劑配置于東北農業(yè)大學水產動物遺傳育種實驗室，透射電鏡相關試劑配置于東北農業(yè)大學電鏡中心?；驕y序由北京華大公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取與cDNA 的合成 用Trizol 試劑提取不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中的總RNA，具體發(fā)育階段為180 dpf、200 dpf、220 dpf、 240 dpf、270 dpf、300 dpf 和360 dpf。按照反轉錄試劑盒（PrimeScriptRTReagent Kit，TaKaRa）說明書將各發(fā)育階段提取的總RNA 反轉為cDNA，存放于-20℃冰箱中。

1.2.2 虹鱒lc3b 基因編碼區(qū)的克隆 根據(jù)NCBI中提供的大西洋鮭lc3b 基因（GenBank 登錄號BT046065），利用Primer 5.0 軟件設計引物擴增虹鱒lc3b 基因的編碼區(qū)序列。引物序列為（5'-3'）：F-CTGTAGACTCCGCAGCAGATAGC，RGGAAGACAGGGGGATAGGTCTG。反轉錄PCR 反應體系為50 μL：cDNA 1 μL，引物 4 μL，rTaq 0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，dH2O 35.5 μL。PCR 反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中觀察結果，將目的條帶膠回收，連接PMD-18T 克隆載體進行測序。

1.2.3 實時定量PCR Real-time PCR 檢測以上各發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中l(wèi)c3b 基因的表達量。反應體系為20 μL：上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，SYBR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，Dye Ⅱ 0.4 μL，dH2O 7.4 μL。ABI7500 儀器設定反應程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。檢測lc3b 基因表達的引物為（5'-3'）：F-AAGGAGGACATTTGAGCAGAGAG，RAGCTGCTTCTCTCCCTTGTATCTC。以β-acin基因作為內參，引物序列為（5'-3'）：F-ATCCTGACGGAGCGCGGTTACAG，R-TGCCCATCTCCTGCTCAAAGTCCA。

1.2.4 透射電鏡 不同發(fā)育階段的虹鱒性腺樣本放置于固定液中（2.5% 戊二醛和2.5% 多聚甲醛），存放于4℃冰箱中過夜，然后用1% 的四氧化鋨溶液固定1 h。之后樣本用氧化丙烯脫水并固定于樹脂中，樣本進行超薄切片，并放置于120 kV 的H-7650 透射電鏡（Hitachi，Japan）下進行觀察。

1.2.5 Western blot 不同發(fā)育階段的虹鱒性腺組織蛋白被提取出來，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸20 min。通過SDS-PAGE 凝膠電泳將蛋白分離出來，并將蛋白轉移至PVDF 膜上，洗膜之后，用脫脂乳37℃條件下封閉2 h。利用LC3B 抗體（Cell Signaling Technology，#2775）作為一抗進行孵育過夜，之后利用rabbit anti-IgG conjugated to horseradish peroxidase（中杉金橋）作為二抗進行孵育，2 h 后洗膜，最后進行曝光得到特異條帶14 kD 和16 kD。

2 結果

2.1 虹鱒lc3b基因編碼區(qū)的序列分析

根據(jù)大西洋鮭lc3b 基因的編碼區(qū)序列設計引物，擴增得到虹鱒lc3b 基因編碼區(qū)的片段為378 bp（圖1），經序列測定后，與大西洋鮭的序列一致性達到93.07%。虹鱒lc3b 基因編碼126 個氨基酸，其基因序列被提交到GenBank 上，GenBank 登錄號為KX845472。

圖1 虹鱒lc3b基因編碼區(qū)PCR擴增結果

2.2 lc3b基因的同源性分析

在NCBI 上下載相關物種的lc3b 基因序列，包括人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos Taurus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、雞（Gallus gallus）、葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）、鯉魚（Cyprinus carpio）、斑馬魚（Danio rerio），以及大西洋鮭（Salmo salar）與虹鱒魚的lc3b 基因編碼區(qū)序列進行比較。通過MEGA 6.06 軟件構建Neighbor-Joining 進化樹（圖2）。從進化樹中可以看出，lc3b 基因在進化過程中比較保守，虹鱒的lc3b 基因與大西洋鮭落于同一分支中，屬于鮭科，大西洋鮭屬。

圖2 lc3b基因系統(tǒng)進化樹分析

2.3 LC3B蛋白的預測結構分析

利用Swiss-model 軟件將虹鱒LC3B 蛋白的氨基酸序列與其中搜索到人的Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B（PDB number：2zjd.2.A）蛋白模板進行比對（圖3），在這基礎上預測虹鱒LC3B 蛋白的三維結構（圖4）。二者蛋白的序列一致性達到了92.05%，結構相似性為56%。

圖3 虹鱒LC3B蛋白的三維結構預測圖

2.4 三倍體虹鱒各發(fā)育階段性腺組織亞顯微結構的觀察

為了驗證三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中卵泡細胞發(fā)生自噬的情況，通過透射電鏡對性腺進行了觀察，在發(fā)育到200 dpf 個體的性腺中可觀察到自噬小體的結構，是由雙層或多層膜構成的囊狀結構，其中包含著完整或者正在消化中的細胞器，包括核糖體，高爾基體等。一直持續(xù)到270 dpf，在200 dpf-270 dpf 這個發(fā)育階段中均可觀察到自噬小體的存在。在這個發(fā)育階段的二倍體雌性虹鱒性腺中，透射電鏡可觀察到完整的卵母細胞結構，細胞膜比較完整，有比較清晰的細胞核結構，并沒有類似自噬小體的結構出現(xiàn)（圖5）。通過比較，可以發(fā)現(xiàn)三倍體雌性虹鱒的性腺發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，卵泡細胞中有自噬體結構出現(xiàn)。

2.5 lc3b在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段性腺中

mRNA表達水平分析

針對三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中出現(xiàn)自噬小體的情況，檢測lc3b 基因在發(fā)育各階段的性腺中的表達。在160 dpf-200 dpf 這個發(fā)育階段，虹鱒雌性三倍體性腺中l(wèi)c3b mRNA 水平的表達量相對較低，但在220 dpf-270 dpf 這個階段，該基因的表達出現(xiàn)了顯著的升高，較發(fā)育初期的表達有顯著的差異（P<0.05）。在之后的發(fā)育階段，直到360 dpf，基因表達又恢復了到了發(fā)育初期水平（圖6）。這與透射電鏡觀察到自噬小體存在的階段基本一致。

2.6 LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ在三倍體虹鱒各發(fā)育階段

性腺中的表達

為了更深入的驗證三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中自噬現(xiàn)象，驗證LC3B 的蛋白表達水平。LC3B蛋白有兩種形式，LC3B- Ⅰ和LC3B- Ⅱ。細胞中沒有自噬發(fā)生時，該蛋白以LC3B- Ⅰ的形式存在與細胞質中，而細胞自噬發(fā)生時，該蛋白以LC3B- Ⅱ的形式存在與自噬小體膜上，因此LC3B- Ⅱ / LC3B-Ⅰ 的比例往往可以代表自噬水平的高低。通過檢測不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中蛋白的表達，表明LC3B- Ⅱ / LC3B- Ⅰ的表達比在200 dpf-270 dpf這個發(fā)育階段始終處于較高的水平（圖7），即這一階段細胞自噬也處于較高的水平。

圖4 虹鱒LC3B蛋白與Swiss-model模板蛋白氨基酸序列對比圖

圖5 透射電鏡觀察二、三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺的亞顯微結構

圖6 lc3b基因在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段性腺組織中的表達

圖7 LC3B蛋白在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段的表達

3 討論

在本研究中，細胞自噬與三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育異常被聯(lián)系了起來。首先，克隆了虹鱒自噬基因lc3b 的編碼區(qū)序列。通過透射電鏡觀察三倍體雌性不同發(fā)育階段性腺的亞顯微結構，確定了自噬小體的存在。檢測不同發(fā)育階段自噬基因lc3b 的表達，基因的表達結果與自噬小體出現(xiàn)的時期基本吻合。對于檢測三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中自噬蛋白的表達，實驗結果表明，在200 dpf-270 dpf 階段，性腺細胞自噬水平比較強烈。以前的研究表明，在這一階段之后，性腺組織發(fā)生纖維化，導致發(fā)育異常。因此，性腺細胞自噬是導致三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育異常的主要原因之一。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細胞生長發(fā)育和生理病理過程，目前已在高等哺乳動物和植物細胞的研究中取得較大的進展，特別是在酵母細胞自噬的研究中更是不斷深入［14］。但是目前對魚類細胞自噬的研究才剛剛開始，對其在控制魚類細胞分化、生長發(fā)育和防治病原感染等方面的研究還不多。多倍體魚類由于其具有較多的生長優(yōu)勢與經濟價值，因此對其生長發(fā)育的機制研究有一定的遺傳學意義。在哺乳動物的卵泡發(fā)育和閉鎖過程中，細胞自噬起到重要的作用。在硬骨魚類的研究，排卵之后的卵巢組織發(fā)生了重塑，是卵泡細胞的自噬與凋亡一起協(xié)同作用的結果［15，16］。在我們之前的研究中［1，17］，發(fā)現(xiàn)三倍體雌性虹鱒的性腺發(fā)生敗育，雌性化特征減弱，性腺發(fā)生了重塑，因此這里我們將卵泡細胞的自噬與其性腺敗育聯(lián)系在一起進行研究。

通過透射電鏡對三倍體雌性虹鱒性腺的亞顯微結構觀察，我們發(fā)現(xiàn)了自噬小體結構。具有多層膜包圍，內部具有完整的或者正在消化中的細胞器，這與魚類閉鎖的以及排卵后的卵巢中觀察到的自噬體結構相似［18］。自噬調節(jié)信號通路復雜，在酵母菌中的研究較為透徹，自噬活動又是十分保守的細胞活動，在不同物種中的調節(jié)機制較為相似［19］。我們克隆了虹鱒的自噬基因lc3b 的編碼區(qū)片段為378 bp，并通過進化樹分析虹鱒lc3b 基因序列與大西洋鮭的序列高度保守，并落在同一分支內。對于虹鱒LC3B 蛋白三維結構的預測，與已知的人Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B（PDB number：2zjd）的蛋白結構具有很高的相似性。通過對三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中l(wèi)c3b 基因表達進行分析，表明該基因在200 dpf-270 dpf 階段始終處于較高的表達水平。

然而在細胞自噬的研究中，LC3B 的蛋白水平高低是證明細胞自噬水平高低的有效手段。LC3B蛋白有兩種形式，LC3B- Ⅰ和LC3B- Ⅱ。細胞中沒有自噬發(fā)生時，該蛋白以LC3B- Ⅰ的形式存在與細胞質中，而細胞自噬發(fā)生時，該蛋白以LC3B- Ⅱ的形式存在與自噬小體膜上，因此LC3B- Ⅱ / LC3B-Ⅰ的比例往往可以代表自噬水平的高低［20］。通過Western blot 實驗我們證明了在200 dpf-270 dpf 發(fā)育階段，三倍體雌性虹鱒性腺中LC3B- Ⅱ / LC3B- Ⅰ的表達水平很高，證明性腺細胞在這過程中發(fā)生了強烈的自噬，性腺發(fā)育異常，導致性腺敗育。

因此我們推測卵泡細胞的自噬，是導致三倍體雌性虹鱒性腺重新分化的主要原因，是導致三倍體雌性虹鱒不育的重要機制。

4 結論

本研究克隆了虹鱒lc3b 基因的編碼區(qū)序列。通過透射電鏡觀察與分析lc3b 基因及LC3B 蛋白在三倍體雌性虹鱒性腺不同發(fā)育階段的表達水平，證明了性腺細胞自噬為三倍體雌性虹鱒性腺敗育是主要原因之一。

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（責任編輯 狄艷紅）

Expression Analysis of lc3b Gene in Gonadal Development of Triploid Female Rainbow Trout

HUANG Tian-qing WANG Xing-ran WANG Yan-na SUN Hui-zhi HAN Ying
（Department of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

This work aims to show a new light on the relationship between autophagy and gonadal regression of triploid female rainbow trout. Autophagy gene lc3b of rainbow trout was cloned by RT-PCR，and its expressions in gonads of triploid female rainbow trout were analyzed at different developmental period in mRNA and protein level. Gonadal ultrastructures were observed under transmission electron microscopy. Results showed clear evidence that lc3b gene was highly expressed in gonads of triploid female rainbow trout during the period of 200dpf to 270 dpf，in which autophagosome structures were identified. In this stage，the conversion of LC3B-I to LC3B-II was greater. These results demonstrated autophagy played pivotal roles in gonadal regression of triploid female rainbow trout.

triploid；rainbow trout；autophagy；LC3B；gonadal development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1166

2016-12-24

國家自然科學基金項目（31470131）

黃天晴，女，博士研究生，研究方向：水產動物育種與繁殖；E-mail：tianqing88@126.com

韓英，女，博士，研究方向：水產動物育種與繁殖；E-mail：hanying_606@163.com