斑點叉尾鮰C型溶菌酶在畢赤酵母中的表達及其抑菌活性

馮亞東 陶妍 李雯 崔旭 王強厚

（上海海洋大學食品學院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

斑點叉尾鮰C型溶菌酶在畢赤酵母中的表達及其抑菌活性

馮亞東 陶妍 李雯 崔旭 王強厚

（上海海洋大學食品學院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

C型溶菌酶是存在于各種生物組織中的數(shù)種溶菌酶成員中的一員，是重要的細胞內(nèi)免疫蛋白，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和顯著的抑菌功能，被認為是良好的食品保鮮劑和飼料添加劑。為了開發(fā)魚類來源的C型溶菌酶，研究建立了基于畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)的斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）C型溶菌酶的制備方法。首先通過PCR獲得5'和3'端分別添加Xho I和Xba I酶切位點的編碼斑點叉尾鮰C型溶菌酶的cDNA（cflyC），其編碼由127個氨基酸殘基組成的多肽；將該cflyC與表達載體pPICZαA連接以構(gòu)建重組表達載體pPICZαA-cflyC；轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33后，通過不同濃度的博來霉素和對酵母基因組DNA的PCR鑒定，篩選得到高拷貝的酵母轉(zhuǎn)化子；經(jīng)0.5%甲醇誘導，在pH6.0、29℃、250 r/min下培養(yǎng)144 h，得到的表達產(chǎn)物經(jīng)固化金屬離子親和層析（IMAC）純化，得到重組蛋白；經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，表明重組蛋白的分子量為15.1 kD；進一步通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定，證明該重組蛋白為預期的重組cflyC。通過福林酚法測得重組cflyC的表達量為2.75 mg/L。瓊脂糖凝膠擴散法和酶活力測定證明，重組cflyC對枯草芽孢桿菌具有抑菌活性。本研究首次實現(xiàn)了斑點叉尾鮰C型溶菌酶在畢赤酵母中的重組DNA表達，為其大規(guī)模制備奠定了基礎。

斑點叉尾鮰；C型溶菌酶；畢赤酵母；重組DNA表達；抑菌活性

溶菌酶（lysozyme）是廣泛存在于動植物的各種組織、體液及分泌物中的一種非特異性免疫因子，于1922 年由Fleming發(fā)現(xiàn)［1］。它通過切斷細菌細胞壁的肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4 糖苷鍵而引起細胞裂解［2］。根據(jù)溶菌酶的結(jié)構(gòu)特征、作用方式和生物來源，可以將其分為六種類型：噬菌體T4 溶菌酶（phage type）、植物溶菌酶（plant type）、微生物溶菌酶（bacteria type），以及3種動物型溶菌酶：C 型（chicken type）、G 型（goose type）和I 型（invertebrate type）［3］。就動物來源的3種溶菌酶而言，C型與G型、I型相比，其具有典型的二硫鍵結(jié)構(gòu)和酶催化活性中心，以致它的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抑菌功能顯著，故目前已經(jīng)在食品保鮮、飼料添加劑等領域被廣泛應用。例如，李鑫等［4］報道了溶菌酶作為飼料添加劑可以提高家禽免疫力和預防疾病，還有報道認為它在乳制品保鮮等方面具有良好的應用效果［5］，但目前商業(yè)化的溶菌酶主要從雞蛋清中提取，價格昂貴，使用成本高；此外，還有報道來源于微生物的溶菌酶在口腔制品中的應用［6］。然而，迄今為止，水產(chǎn)生物來源溶菌酶的應用幾乎未見報道，就它們所棲息的環(huán)境而言，較陸生動物更易遭受病原微生物的污染，以致其必然具有更強的免疫系統(tǒng)才能在復雜的環(huán)境中抵御病原菌的侵染，而C型溶菌酶作為一種非特異性的抑菌蛋白，在水產(chǎn)生物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，也因此成為制備綠色飼料添加劑或水產(chǎn)品保鮮劑的良好候選者。

目前，已發(fā)現(xiàn)C型溶菌酶基因存在于斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［7］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［8］、點帶石斑魚和赤點石斑魚（Epinephelus coioides，Epinephelus akaara）［9，10］等硬骨魚中。此外，在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［11］、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）［12］、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）［13］和日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）［14］等 無脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)存在C型溶菌酶基因。關于水產(chǎn)生物C型溶菌酶原核表達方面的研究報道較多，例如，來自日本對蝦（Penaeus japonicus）［15］、仿刺參（Apostichopus japonicus）［16］、赤點石斑魚［10］和斑點叉尾鮰［17］的C型溶菌酶基因已經(jīng)在大腸桿菌中得到表達。但原核表達系統(tǒng)存在眾所周知的缺點，如對表達產(chǎn)物不能進行翻譯后加工修飾，以致表達的目的蛋白會形成不溶性的包涵體而缺乏活性［18］；而巴斯德畢赤酵母（Pichia pastori）作為真核表達宿主，有助于表達產(chǎn)物空間構(gòu)象的形成以獲得具有生物學活性的重組蛋白，并可進行目的蛋白的細胞外分泌表達以方便表達產(chǎn)物的后續(xù)處理，故是目前公認的外源蛋白表達的良好宿主［19］。然而，迄今為止，基于真核表達系統(tǒng)的水產(chǎn)生物C型溶菌酶的重組DNA表達則鮮有報道，卞曙光等［20］報道了凡納濱對蝦C型溶菌酶在畢赤酵母中的重組DNA表達，且表達產(chǎn)物顯示了對溶壁微球菌（Micrococcus lysodeik）具有良好的抑菌活性。

鑒于斑點叉尾鮰屬于抗病力強、對于生態(tài)環(huán)境的適應能力較強的魚類，我們在前期致力于魚類抗菌肽的原核表達研究中，已經(jīng)選擇其作為研究對象，通過逆轉(zhuǎn)錄合成了來源于斑點叉尾鮰肝臟的第一鏈cDNA［21］。本研究擬以此為基礎，首先通過RT-PCR對斑點叉尾鮰C型溶菌酶的基因進行cDNA克??；將其與真核表達載體pPICZαA連接后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中，采用甲醇誘導表達；通過固化金屬離子親和層析（IMAC）對表達產(chǎn)物進行純化后，經(jīng)MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析鑒定其結(jié)構(gòu)；進一步，通過瓊脂糖擴散法和酶活力測定考察表達產(chǎn)物的抑菌活性，旨在建立斑點叉尾鮰C型溶菌酶的真核表達系統(tǒng)，為實現(xiàn)對其大規(guī)模的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 畢赤酵母X-33和表達載體pPICZαA購自Invitrogen公司（美國）；克隆載體pMD-19T simple購自TaKaRa公司（日本）；用于抑菌活性測定的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）為本實驗室保藏；大腸桿菌DH5α購自天根生物科技有限公司（北京）。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（Xho I、Xba I、Sac I）和T4DNA連接酶、Taq DNA 聚合酶均購自TaKaRa公司；胰蛋白胨、酵母粉購自OXOID公司（英國）；YNB（無機氮原）購自BIOSHARP公司（美國）；DNA分子量標準、蛋白質(zhì)分子量標準、DNA割膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒等均購自天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標準購自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western Blot分析試劑購自康為世紀生物科技有限公司（北京）。

1.1.3 儀器 實驗所用儀器及型號如下：恒溫培養(yǎng)箱（XMT-A7000）、恒溫搖床（ZHWY-200H），高速冷凍離心機（CT14RD）、恒溫孵育器（eppendorf，Thermostat plus）、PCR儀（BIO-RAD，PTC-200）、聚丙烯酰氨凝膠電泳儀（BIO-RAD，PowerPac Basic）、電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD，Gene PulserXcell）、蛋白質(zhì)純化儀（BIO-RAD，Profinia Protein Purification System）、賽多利斯切向回流超濾器（VIVAFLOW 200）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增及克隆 利用實驗室原有的斑點叉尾鮰肝臟第一鏈cDNA，參考其C型溶菌酶的全長cDNA序列（NM_001200789），設計用于3次PCR的引物如表1所示，引物由上海生工生物工程有限公司合成。第一次PCR反應體系（10 μL）：10×Taq Plus Buffer 1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、F1和R1（10 μmol/L）各 0.2 μL、模板 0.3 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.1 μL、ddH2O 7.4 μL；反應條件：94℃預熱3 min、94℃變性40 s、55.6℃退火30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。以第1次PCR產(chǎn)物為模板，利用F2和R2進行第2次PCR，反應體系和條件同上，除了退火溫度改為58.9℃。以第2次PCR產(chǎn)物為模板，利用F2和R3進行第3次PCR，反應體系和條件同上，除了退火溫度改為58.8℃。將最后一次PCR獲得的目的片段“cflyC”與質(zhì)粒pMD-19T連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 重組表達載體pPICZαA-cflyC的構(gòu)建及鑒定 采用Xho I和Xba I對使用第3次PCR產(chǎn)物構(gòu)建的重組克隆質(zhì)?！皃MD-19T-cflyC”進行雙酶切，獲得目的片段“cflyC”后，在T4 DNA連接酶作用下，將其與被同樣酶處理過的表達載體pPICZαA連接（16℃，30 min），轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，通過雙酶切和DNA測序驗證重組表達載體pPICZαA-cflyC是否構(gòu)建成功。

1.2.3 pPICZαA-cflyC電轉(zhuǎn)入畢赤酵母及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選 重組表達載體“pPICZαA-cflyC”經(jīng)測序確證后，采用Sac I對其進行線性化處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收DNA，通過電擊法將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)畢赤酵母X-33中（電擊條件：1 500 V、 25 μF、200 Ω、5 ms），然后涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%瓊脂粉、2%葡萄糖）上，29℃培養(yǎng)3 d；挑取部分菌落分別接種在含更高濃度梯度博來霉素的YPD平板上，篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。同時，還將酵母細胞涂布于MM平板（YNB 13.4 g/L、甲醇5 mL/L、生物素0.4 mg /L、瓊脂15 g/L）上以篩選甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子。對篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，采用通用引物（5'AOX1：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）進行PCR鑒定。1.2.4 重組cflyC的誘導表達及Western blot分析 挑取一個陽性轉(zhuǎn)化子接種于5 mL YPD培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)24 h，取500 μL轉(zhuǎn)接至50 mL MGY培養(yǎng)基（34%YNB 5 mL、10%甘油 5 mL、0.02%生物素100 μL、1 mol/L磷酸鉀緩沖液 5 mL）培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)入50 mL MM培養(yǎng)基（34% YNB 5 mL、甲醇250 μL、0.02%生物素 100 μL、1 mol/L磷酸鉀緩沖液 5 mL），每隔24 h 補加甲醇至終濃度0.5%。培養(yǎng)條件：pH 6.0、29℃、250 r/min；表達時間：24、48、72、96、120、144 h。各個表達時間的培養(yǎng)液經(jīng)離心（11 000 r/min，15 min）取上清進行蛋白質(zhì)沉淀（丙酮∶上清=4∶1），沉淀用于Tricine-SDS-PAGE分析（5%濃縮膠、12%分離膠、0.1 mol/L Tricine）；經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析后的凝膠用于Western blot分析，100 V恒壓1 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，依次用抗his標簽鼠單克隆抗體和HRP標記山羊抗鼠IgG孵育，最后采用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。

表1 用于PCR擴增的引物

1.2.5 表達產(chǎn)物的純化及MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定 選擇表達時間為144 h的酵母轉(zhuǎn)化 子，對其進行1 000 mL的擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)離心（11 000 r/min，15 min）后，收集上清過0.22 μm濾膜，通過切向回流超濾器對其進行超濾濃縮；濃縮液上蛋白質(zhì)純化儀，根據(jù)儀器使用說明書進行蛋白質(zhì)純化，采用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳后切下目的條帶，由上海中科新生命生物科技有限公司進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定。

1.2.6 重組cflyC的抑菌活性測定 將處于穩(wěn)定生長期的枯草芽孢桿菌與營養(yǎng)瓊脂混合（1∶1 000，V/V）倒平板，凝固后打直徑為6 mm的孔，加入50 μL含重組cflyC的培養(yǎng)液上清，37℃培養(yǎng)12 h，觀察有無抑菌圈；同時，以50 μL含空質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清為陰性對照。另一方面，取50 μL純化的重組cflyC與150 μL穩(wěn)定生長期的枯草芽孢桿菌混合，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)2 h，每間隔1 min測定OD450的吸光值變化，以考察重組cflyC的酶活力［17］；以雞蛋清溶菌酶為陽性對照、PBS為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴增及測序

第一次PCR獲得650 bp的編碼斑點叉尾鮰C型溶菌酶的全長cDNA片段（圖1-A）。第2次PCR獲得411 bp的5'端依次含Xho I位點和信號肽酶切位點Kex2、3'端含6×His標簽的cDNA片段（圖1-B）；第3次PCR獲得的是420 bp的在其3'端又添加了Xba I位點和終止密碼子ATG的目的片段“cflyC”（圖1-C）。將其與克隆載體pMD19-T連接后，測序結(jié)果如圖2-A所示：在cflyC的5'端成功添加了Xho I和Kex2位點，在其3'端成功添加了6×His、ATG和Xba I位點。除去各種位點，cflyC編碼了由133個氨基酸殘基組成的重組目的蛋白（127個殘基的成熟肽+6個組氨酸）；8個保守的半胱氨酸殘基和2個活性位點的氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）位于成熟肽中。

2.2 基于雙酶切的重組表達載體pPICZαA-cflyC的鑒定

重組表達載體pPICZαA-cflyC的構(gòu)建如圖2-B所示。采用質(zhì)粒提取試劑盒從大腸桿菌DH5α中提取pPICZαA-cflyC后，經(jīng)Xho I和Xba I雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳后，在近目標分子量處顯示了1個明顯的目的條帶（圖3）。另一方面，以5' AOX1為引物對其進行DNA測序，結(jié)果顯示目的基因cflyC已連接至表達載體pPICZαA（DNA測序結(jié)果未顯示），未發(fā)生任何核苷酸變異。由此證明，重組表達載體pPICZαA-cflyC已被成功構(gòu)建。

2.3 重組酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定

將上述經(jīng)測序確認的pPICZαA-cflyC電轉(zhuǎn)入畢赤酵母后，首先在含低濃度博來霉素的培養(yǎng)基上篩選到數(shù)個長勢良好的菌落，然后將其分別接種于含500 μg/mL博來霉素的培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基上，篩選到4株在該兩種培養(yǎng)基上均長勢優(yōu)良的高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子。將它們接種于YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，提取其酵母基因組DNA為模板，采用載體上的通用引物5'AOX1和3'AOX1進行PCR鑒定，結(jié)果如圖4所示，4株酵母菌均在理論分子量916 bp處有明顯條帶；而含空質(zhì)粒pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子則未見此條帶。

圖 1 目的基因cflyC的PCR擴增

2.4 分時段的誘導表達結(jié)果及Western blot分析

用丙酮對誘導表達0、24、48、72、96、120和144 h的培養(yǎng)液上清進行沉淀后，經(jīng)Tricine-SDSPAGE分析，結(jié)果（圖5）顯示，隨著表達時間的延長，在理論分子量15.1 kD處的條帶逐漸加深，至144 h時，條帶顯示最深，故選擇該時間作為擴大培養(yǎng)時的表達時間。進一步將凝膠上的條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，與抗His標簽的鼠單克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（二抗）反應，進行Western blot鑒定，由于在轉(zhuǎn)膜過程中蛋白條帶可能會發(fā)生偏離，結(jié)果（圖6）顯示在16 kD附近有明顯雜交條帶，而2個空白對照均未見任何條帶，此結(jié)果初步證明重組cflyC在畢赤酵母X-33中得到成功表達。

圖 2 cflyC的核苷酸及推斷的氨基酸序列（A）以及重組表達載體pPICZαA-cflyC的構(gòu)建（B）

圖 3 pPICZαA-cflyC的雙酶切驗證

圖 4 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

圖 5 培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析

圖 6 培養(yǎng)液上清的Western blot分析

2.5 重組cflyC的純化及其基于MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定

將擴大制備1 L的培養(yǎng)液上清經(jīng)切向回流超濾濃縮10倍后，通過IMAC柱層析和脫鹽后的產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析（圖7-A）顯示，在近理論分子量15.1 kD處有單一條帶，證明獲得了純化的產(chǎn)物，福林酚法測得其濃度為550 μg/mL，推算至表達量為2.75 mg/L。將此條帶用作MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析（圖7-B），結(jié)果共捕獲到7個肽段，它們由8-20個氨基酸殘基組成，大約占了重組cflyC總長的70%；其中m/z 為131 5.689 6和226 8.007 3的兩個峰最明顯，分別表示12個殘基（QQGITAWVAWRR）和20個殘基（AINHNTDGSTDYGIFQMNNR）的肽段，兩者分別位于重組cflyC的第100-111位和第42-61位氨基酸殘基；其他肽段分別位于重組cflyC的第3-10、14-33、34-41、62-70、117-133位氨基酸殘基。MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜的分析結(jié)果證明了純化的表達產(chǎn)物是預期的重組cflyC。

圖 7 純化的表達產(chǎn)物（A）及其MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析（B）

2.6 重組cflyC的抑菌活性

基于瓊脂糖擴散法的測定結(jié)果（圖8-A）顯示，濃縮10倍后的含重組cflyC的培養(yǎng)液上清對枯草芽孢桿菌顯示了明顯的抑菌圈，而含空質(zhì)粒pPICZαA的培養(yǎng)液上清并未顯示抑菌圈。另一方面，通過溶菌酶活性測定方法考察了純化的重組cflyC對枯草芽孢桿菌的抑菌活性，結(jié)果（圖8-B）顯示，隨著重組cflyC與枯草芽孢桿菌作用時間的增加，混合液OD450吸光值的下降程度逐漸增大；作為陽性對照的雞蛋清溶菌酶顯示了更明顯的抑菌活性；但陰性對照則顯示OD450吸光值無明顯變化。

圖 8 基于瓊脂糖擴散法（A）和酶活力測定（B）的重組cflyC的抑菌活性

3 討論

本研究通過構(gòu)建畢赤酵母表達系統(tǒng)，在0.5%甲醇、pH6.0、29℃、250 r/min、144 h的表達條件下獲得了表達量為2.75 mg/L的重組斑點叉尾鮰C型溶菌酶，經(jīng)鑒定該重組蛋白具有對枯草芽孢桿菌的抑菌活性，但由于表達量較低，未能進一步考察對于其他不同種類細菌的抑菌活性。關于表達量低的問題可能與使用的編碼基因的密碼子有關，本研究使用的是通過RT-PCR獲得的編碼斑點叉尾鮰C型溶菌酶的天然cDNA，經(jīng)JAVA Codon Adaption Tool（http://www.jcat.de/Start.jsp）檢測存在9個對于畢赤酵母而言的低頻密碼子。Yang等［22］將黑曲霉lip2基因進行密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中表達，獲得的重組蛋白在酶活力和表達量方面都有明顯提高，分別提高了11.6和5.3倍。因此，后續(xù)研究擬根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性，對編碼斑點叉尾鮰C型溶菌酶的密碼子進行優(yōu)化，以期提高目的蛋白的表達量，為進一步考察重組cflyC的抑菌活性及研究其抑菌機理奠定基礎。

本研究構(gòu)建的重組表達載體pPICZαA-cflyC上的信號肽酶切位點是Lys-Arg殘基，而表達的重組cflyC的N末端正好也是Lys和Arg殘基（圖2-A），因此，極有可能獲得的目的蛋白是N末端缺少了Lys和Arg殘基的重組蛋白，其對重組cflyC的空間結(jié)構(gòu)和活性的影響如何還未知。雖然重組cflyC對枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌活性，但因為缺乏對其他細菌的抑菌活性測定結(jié)果，所以無法判斷是否對抑菌譜有影響。針對這一問題，后續(xù)研究擬考慮將目的蛋白N末端的Arg殘基（堿性）改為His殘基（堿性），這樣基本上不會改變重組cflyC的結(jié)構(gòu)和等電點等性質(zhì)。

另一方面，本研究在實驗室搖瓶制備階段，以YNB（無機氮源）作為培養(yǎng)基的氮源，而不是傳統(tǒng)的BMMY培養(yǎng)基使用的有機氮源（酵母膏和蛋白胨），不僅節(jié)省了成本，也大大方便了培養(yǎng)液的后續(xù)處理，并且為今后在發(fā)酵罐中擴大制備時對發(fā)酵條件的優(yōu)化和確定提供了極其重要的參考依據(jù)?？紤]到大規(guī)模生產(chǎn)時不可能將純化產(chǎn)物作為產(chǎn)品，故對含重組cflyC的培養(yǎng)液上清進行了抑菌活性測定，結(jié)果證明其具有抑制枯草芽孢桿菌的活性，這為將來進一步擴大制備時確定培養(yǎng)液的后續(xù)處理方法及產(chǎn)品的形式奠定了重要的基礎。

4 結(jié)論

本研究建立了基于畢赤酵母表達系統(tǒng)的斑點叉尾鮰C型溶菌酶的制備方法，確定最佳表達條件為：0.5%甲醇、pH 6.0、29℃、250 r/min、培養(yǎng)時間144 h；表達產(chǎn)物經(jīng)固化金屬離子親和層析（IMAC）獲得純化的重組蛋白，MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析進一步證明該重組蛋白為預期的重組cflyC，分子量為15.1 kD。經(jīng)測定，重組cflyC對枯草芽孢桿菌具有抑菌活性。

［1］ Fleming A. On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions［J］. Philosophical Transactions - Royal Society, Biological Sciences, 1922, 93（9）：306-317.

［2］ Jolles P, Jollts J. What’s new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday［J］. Molecular and Cellular Biochemistry, 1984, 63（2）：165-189.

［3］Prager E, Wilson A, Amheim N, et al. Widespread distribution of lysozyme in egg white of birds［J］. Journal of Biological Chemistry, 1974, 249（22）：7295-7297.

［4］李鑫, 譚志堅, 凌欣華, 等. 溶菌酶在飼料中的應用［J］. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 45（11）：104-107.

［5］崔紅. 天然微生物防腐劑溶菌酶在食品中的應用研究［J］. 中國食物與營養(yǎng), 2015, 21（12）：28-31.

［6］曹濤. 變?nèi)芫匕l(fā)酵生產(chǎn)及在口腔制品中的應用［J］. 山東輕工業(yè)學院, 2011.

［7］Wang RJ, Feng JB, Li C, et al. Four lysozymes（one c-type and three g-type）in catfish are drastically but differentially induced after bacterial infection［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35（1）：136-145.

［8］Dautigny A, Prager EM, Pham-Dinh D, et al. cDNA and amino acid sequences of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）lysozymes and their implications for the evolution of lysozyme and lactalbumin［J］. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32（2）：187-198.

［9］ Wei SN, Huang YH, Cai J, et al. Molecular cloning and characterization of c-type lysozyme gene in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33（2）：186-196.

［10］Mai W, Liu P, Chen H, et al. Cloning and immune characterization of the c-type lysozyme gene in red-spotted grouper, Epinephelus akaara［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 36（1）：305-314.

［11］張輝, 潘魯青, 岳峰. 三疣梭子蟹C-型溶菌酶基因的原核表達與活性檢測［J］. 中國海洋大學學報：自然科學版, 2013, 43（7）：23-27.

［12］卜興江, 杜欣軍, 周文杰, 等. 中國明對蝦溶菌酶基因克隆、重組表達與性質(zhì)分析［J］. 生物工程學報, 2008, 24（5）：723-732.

［13］Nilsen IW, Overb? K, Sandsdalen E, et al. Protein purification and gene isolation of chlamysin, a cold-active lysozyme-like with antibacterial activity［J］. FEBS Letters, 1999, 464（3）：153-158.

［14］Hikima S, Hikima J, Rojtinnakorn J, et al. Characterization and function of kuruma shrimp lysozyme possessing lytic activity against Vibrio species［J］. Gene, 2003, 316：187-195.

［15］楊杰, 叢麗娜, 夏濤, 等. 日本對蝦c型溶菌酶的高效重組表達及產(chǎn)物分析［J］. 生物技術通報, 2012（6）：99-105.

［16］Tian Y, Liang XW, Chang YQ, et al. Expression of c-type lysozyme gene in sea cucumber（Apostichopus japonicus）is highly regulated and time dependent after salt stress［J］. Comparative Biochemistry and Physiology B, 2015, 180：68-78.

［17］Pridgeon JW, Klesius PH, Dominowski PJ, et al. Chicken-type lysozyme in channel catfish：Expression analysis, lysozyme activity, and efficacy as immunostimulant against Aeromonas hydrophila infection［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35（3）：680-688.

［18］范翠英, 馮利興, 樊金玲, 等. 重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展［J］. 生物技術, 2012, 22（2）：76-80.

［19］Daly R, Hearn MT. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris：A useful experimental tool in protein engineering and production［J］. Journal of Molecular Recognition, 2005, 18（2）：119-138.

［20］卞曙光, 陳華新, 姜鵬, 等. 凡納濱對蝦溶菌酶基因在畢赤酵母中的分泌表達和活性檢測［J］. 水生生物學報, 2010, 34（6）：1091-1096.

［21］張虹, 陶妍. 斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝臟表達的抗菌肽-2（LEAP-2）在E. coli中的融合表達［J］. 上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版, 2010, 28（1）：74-79, 100.

［22］Yang JK, Liu LY. Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillus niger lip2 gene in Pichia pastoris［J］. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2010, 63（3）：164-169.

（責任編輯 李楠）

Expression of Channel Catfish C-type Lysozyme in Pichia pastoris and Its Bacteriostatic Activity

FENG Ya-dong TAO Yan LI Wen CUI Xu WANG Qiang-hou
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation，College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

C-type lysozyme is one of various lysozymes in different tissues of all organisms，and is a key immune protein in cells and possesses stable structure and excellent bacteriostatic activity. Thus，it is considered to be promising food preservative and feed additives. In order to develop fish C-type lysozyme，the present study established a preparation method of channel catfish（Ictalurus punctatus）C-type lysozyme，based on Pichia pastoris expression system. A cDNA fragment（cflyC）added with the Xho I and Xba I restriction sites at 5 ‘a(chǎn)nd3' ends respectively，encoding the C-type lysozyme of channel catfish，was obtained by PCR. This cDNA encoded a peptide consisting of 127 amino acids. The cflyC fragment was ligated to pPICZαA vector，and a recombinant expression vector pPICZαA-cflyC was constructed，and transformed into competent Pichia pastoris X-33. The yeast transformants containing multi-copy gene insertions were screened using zeocin in different concentrations and PCR identification. The target protein was induced for 144 h with 0.5% methanol at pH 6.0，29℃，and 250 r/ min，and the expression product was purified by immobilized metal affinity chromatography（IMAC）. Tricine-SDS-PAGE analysis showed that molecular mass of the purified recombinant protein was about 15.1 kD. MALDI-TOF-TOF analysis demonstrated that it was the expected recombinant cflyC. Folin-reagent method indicated that the expression yield of recombinant cflyC was 2.75 mg/L. Agar well diffusion and activity assays proved that the recombinant cflyC presented antibacterial activity against Bacillus subtilis. The present study firstly realized the recombinant DNA expression of the channel catfish C-type lysozyme in P. pastoris，which provides key basis for its large-scale preparation.

channel catfish；C-type lysozyme；Pichia pastoris；recombinant DNA expression；bacteriostatic activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0094

2017-02-15

上海市科委工程中心能力提升項目（16DZ2280300）

馮亞東，男，碩士研究生，研究方向：魚類抗菌肽的基因工程制備；E-mail：1159623860@qq.com

陶妍，女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)生物蛋白質(zhì)分子生物學；E-mail：ytao@shou.edu.cn