四個(gè)羅氏沼蝦抗病選擇系抗病力比較分析

李玉鋒戴習(xí)林袁新程周迅胡彥杰丁福江

（1. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)） 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海海洋大學(xué)） 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（上海海洋大學(xué)）；2. 上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司，上海 201516）

四個(gè)羅氏沼蝦抗病選擇系抗病力比較分析

李玉鋒1戴習(xí)林1袁新程1周迅1胡彥杰1丁福江2

（1. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)） 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海海洋大學(xué)） 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（上海海洋大學(xué)）；2. 上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司，上海 201516）

采用熒光定量PCR方法，對(duì)4個(gè)羅氏沼蝦抗病選擇系的4個(gè)抗病力基因（熱休克蛋白70（HSP70）Se-GPx、CAT、SOD）表達(dá)量分析。通過(guò)感染溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），對(duì)比4個(gè)選擇系之間HSP70、Se-GPx、CAT及SOD表達(dá)量的差異，結(jié)合4個(gè)選擇系成活率，來(lái)對(duì)比4個(gè)抗病選擇系抗病力強(qiáng)弱。結(jié)果表明，A、B兩個(gè)抗病選擇系的肝胰腺HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于C、D兩個(gè)抗病選擇系（P<0.05）。感染96 h內(nèi)Se-GPx、CAT、SOD表達(dá)量變化顯著，在4個(gè)選擇系不同時(shí)間表達(dá)量也不相同，但是總體變化趨勢(shì)是A、B選擇系高于C、D選擇系。結(jié)合4個(gè)選擇系感染溶藻弧菌一周的成活率分別為65.0%、65.8%、51.7%及53.3%，可得出結(jié)論A、B兩個(gè)抗病選擇系抗病力高于C、D兩個(gè)選擇系。

羅氏沼蝦；HSP70；非特異性免疫；溶藻弧菌

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）原產(chǎn)于東南亞一帶，是我國(guó)目前主要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有重要地位。但近幾年來(lái)由于環(huán)境、養(yǎng)殖模式等多方面因素的影響，羅氏沼蝦出現(xiàn)嚴(yán)重的種質(zhì)衰退現(xiàn)象；另一方面，羅氏沼蝦病害日益嚴(yán)重，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的災(zāi)難［1］。要解決這個(gè)問(wèn)題必須研究羅氏沼蝦抗病機(jī)制以及培育抗病新品種。

熱休克蛋白 70（Heat stress proteins 70，HSP-70），是機(jī)體在受到應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)迅速合成的一種蛋白質(zhì)，它具有高度保守性，能增加機(jī)體的自身保護(hù)反應(yīng)，可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損害的耐受程度，維持細(xì)胞的正常代謝，提高細(xì)胞的生存率［2，3］，因此熱休克蛋白70是衡量羅氏沼蝦抗病力的一個(gè)重要因素。甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物有很大不同，無(wú)特異性免疫，主要是非特異性免疫，這種免疫重要是依靠一些酶來(lái)完成的，所以研究免疫過(guò)程中的免疫相關(guān)酶以提高羅氏沼蝦自身的免疫能力是很有必要的［4］。有研究指出谷胱甘肽過(guò)氧化物酶在生物體的抗氧化方面，以及體內(nèi)遭受到病原體感以后產(chǎn)生的免疫活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，從而保護(hù)生物機(jī)體免受體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧分子的損害［5，6］。根據(jù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性中心是否含硒可以分為含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Se-GPx）和不含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（non-Se-GPx）兩種類型［7，8］，目前甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的GPx均為Se-GPx［9，10］。過(guò)氧化氫酶（CAT）可以清除生物體產(chǎn)生的H2O2，在生物體內(nèi)發(fā)揮著抗氧化的作用［11，12］。超氧岐化酶（SOD）也是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化酶，它對(duì)生物體內(nèi)自由基的清除起著重要作用，有清除O2的作用［13］。同時(shí)超氧岐化酶也是甲殼類動(dòng)物體液免疫的一部分，是衡量甲殼類動(dòng)物非特異性免疫性狀的重要指標(biāo)。溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是引起壺菌病發(fā)生的一種重要的致病菌，目前有關(guān)溶藻弧菌致病性的研究報(bào)道有很多，本實(shí)驗(yàn)室在羅氏沼蝦育苗池中水體中分離得到溶藻弧菌。

基于以上理論支撐，本實(shí)驗(yàn)選育四代的4個(gè)抗病選擇系（A、B、C、D）的羅氏沼蝦，在人工感染溶藻弧菌后，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)4個(gè)選擇系肝胰腺中4個(gè)抗病力基因（HSP70、Se-GPx、CAT、SOD）表達(dá)量的差異，并結(jié)合4個(gè)選擇系死亡率比較其抗病力，初步探討溶藻弧菌對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺中4個(gè)抗病力基因表達(dá)量的影響，以及以上幾個(gè)基因和羅氏沼蝦抗病力之間的關(guān)系，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室4個(gè)羅氏沼蝦選擇系的抗病力進(jìn)行比較分析，選擇出抗病力較強(qiáng)的選擇系，為本實(shí)驗(yàn)室下一代的抗病選育工作提供理論支持，同時(shí)希望能為羅氏沼蝦病害防治工作和免疫機(jī)理的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用羅氏沼蝦為本實(shí)驗(yàn)室人工選擇配對(duì)和育苗，自然交尾建立的4個(gè)羅氏沼蝦抗病專門化選擇系子四代選擇系（A、B、C、D），選擇體長(zhǎng)（7.25±0.74）cm，體重（13.46±4.31）cm的蝦作為實(shí)驗(yàn)用蝦。每個(gè)選擇系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均放在水泥池中暫養(yǎng)一周，水溫25-28℃，每天投喂兩次，每隔一天換一次水（換水量約為1/3），持續(xù)充氣。

1.1.2 主要儀器及試劑 熒光定量PCR儀、凝膠成像儀（德國(guó)Biostep）、梯度PCR（Eppendorf）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、RNAiso plus（TaKaRa）、反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa）、DNAmarker（天根生物）、氯仿、無(wú)水乙醇、PCR引物由生工生物上海部合成。

1.2 方法

1.2.1 感染實(shí)驗(yàn) 溶藻弧菌的培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)菌種來(lái)自上海海洋大學(xué)病原庫(kù)，保種的菌種先經(jīng)過(guò)異養(yǎng)菌培養(yǎng)基（PGY）培養(yǎng)12 h后，接種到弧菌選擇培養(yǎng)基（TCBS）進(jìn)行特異性培養(yǎng)，最終制備成1×106CFU/mL（用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)）的溶藻弧菌菌懸液于4℃保存。

感染：4個(gè)選擇系中每個(gè)選擇系隨機(jī)挑選180只羅氏沼蝦，設(shè)置3個(gè)平行，在羅氏沼蝦第二腹節(jié)基部注射0.2 mL濃度為1×106CFU/mL的溶藻弧菌菌懸液。

1.2.2 總RNA的抽提 4個(gè)選擇系分別在感染溶藻弧菌0、6、12、24、48和96 h后取肝胰腺，然后在液氮中充分研磨加入1 mL RNAiso plus，靜止5 min后加入0.2 mL氯仿在4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清液0.4 mL至新的離心管中，再加入0.5 mL異丙醇靜止10 mim后于4℃離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液加1 mL 75%乙醇在4℃離心機(jī)中7 500 r/min離心5 min，倒掉液體得到總RNA，最后用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.3 cDNA的合成 將完整無(wú)降解并且測(cè)得OD260nm/OD280nm值1.8-2.0的RNA用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書上的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA放-20℃冰箱保存。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)分析基因的表達(dá) 劉波等［2］根據(jù)GenBank發(fā)布的羅氏沼蝦HSP70序列（AY466445.1），設(shè)計(jì)HSP70的引物。在GenBank中查得羅氏沼蝦過(guò)氧化氫酶（HQ668089.1）、超氧歧化酶（DQ121374.1）、含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（FJ670566.1）及18S（GQ131934.1）序列，設(shè)計(jì)引物序列見(jiàn)表1，引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR試驗(yàn)中用到的引物及序列

熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL體系）：7.5 μL SYBR Premix Ex Taq，0.3 μL引物F，0.3 μL引物R，0.6 μL cDNA模板，6.3 μL ddH2O。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，55℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

羅氏沼蝦各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用Livak和Schmittgen建立的2-ΔΔCt計(jì)算法計(jì)算。然后用目的基因與內(nèi)參基因18S得比值來(lái)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 四個(gè)選擇系成活率比較

2.1.1 養(yǎng)殖比較分析 經(jīng)歷了100 d的養(yǎng)殖，4個(gè)羅氏沼蝦選擇系的養(yǎng)殖成活率表現(xiàn)出一定的差異，4組羅氏沼蝦選擇系養(yǎng)殖成活率比較如圖1所示，A、B兩個(gè)選擇系成活率顯著高于C、D兩個(gè)選擇系P<0.05，選擇系B成活率最高，達(dá)到83.39%。其余3個(gè)選擇系A(chǔ)、C、D成活率分別為82.78%、71.11%和70%。

2.1.2 感染存活比較分析 人工注射感染溶藻弧菌后，4個(gè)選育選擇系A(chǔ)、B、C、D之間的抗病感染能力表現(xiàn)出一定的差異（表2）。注射感染12 h時(shí)，A選擇系成活率極顯著高于B選擇系（P<0.01），且顯著高于D選擇系（P<0.05），B選擇系成活率顯著高于C選擇系（P<0.05）。注射感染24 h時(shí)，A、B選擇系成活率極顯著高于C選擇系（P<0.01），并且A、B抗病選擇系成活率顯著高于D選擇系（P<0.05），B、D選擇系成活率顯著高于C選擇系（P<0.05）。注射感染48 h以及2周后，A、B選擇系成活率極顯著高于C、D兩個(gè)選擇系（P<0.01）。綜上所述，4個(gè)抗病選擇系在感染溶 藻弧菌后成活率存在一定差異，A、B選擇系抗病力明顯強(qiáng)于C、D選擇系，這對(duì)以后育種工作具有重要的指導(dǎo)意義。

2.2 感染溶藻弧菌后羅氏沼蝦肝胰腺中HSP70 mRNA表達(dá)量變化

4個(gè)抗病選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺HSP70 mRNA的相對(duì)含量如圖2所示，總體變化趨勢(shì)是：0-24 h HSP70基因表達(dá)量劇烈增加，之后相對(duì)表達(dá)量降低，48 h與96 h之間表達(dá)量無(wú)差異。12、24 h時(shí)HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間段（P<0.01）。4個(gè)抗病選擇系之間肝胰腺HSP70 mRNA的相對(duì)含量為：感染6 h時(shí)B選擇系相對(duì)表達(dá)量高于C、D選擇系相對(duì)表達(dá)量（P<0.05），12、24 h時(shí)A、B兩個(gè)抗病選擇系的肝胰腺HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于C、D兩個(gè)抗病選擇系（P<0.05），48h時(shí)A選擇系的肝胰腺HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于C、D兩個(gè)抗病選擇系（P<0.05），其他時(shí)間段各個(gè)選擇系之間肝胰腺HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

圖1 四組羅氏沼蝦選擇系養(yǎng)殖成活率比較

2.3 感染溶藻弧菌羅氏沼蝦肝胰腺中非特異性免疫因子Se-GPx、CAT、SOD基因相對(duì)含量

4個(gè)抗病選擇系在感染溶藻弧菌后肝胰腺中Se-GPx mRNA各個(gè)時(shí)間段的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示，總體變化趨勢(shì)是：感染到0-24 h，4個(gè)選擇系Se-GPx mRNA表達(dá)量逐漸升高，到24 h達(dá)到峰值。24-96 h，4個(gè)選擇系Se-GPx mRNA表達(dá)量逐漸降低。4個(gè)選擇系之間肝胰腺中Se-GPx mRNA各個(gè)時(shí)間段相對(duì)表達(dá)量：0 h時(shí)，B抗病選擇系的肝胰腺Se-GPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于A、C、D三個(gè)抗病選擇系（P<0.05），A抗病選擇系的肝胰腺Se-GPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于D 抗病選擇系（P<0.05）；6 h時(shí)，B抗病選擇系的肝胰腺SeGPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于C、D兩個(gè)抗病選擇系（P<0.01），A抗病選擇系的肝胰腺Se-GPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于C、D三個(gè)抗病選擇系（P<0.05）；24 h和48 h時(shí)，A、B兩個(gè)抗病選擇系的肝胰腺Se-GPx mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于C、D兩個(gè)抗病選擇系（P<0.05）。

表2 4個(gè)羅氏沼蝦選擇系抗溶藻弧菌能力比較

圖 2 四個(gè)羅氏沼蝦選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 四個(gè)羅氏沼蝦選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺中Se-GPx mRNA相對(duì)表達(dá)量

4個(gè)抗病選擇系在感染溶藻弧菌后肝胰腺中CAT mRNA各個(gè)時(shí)間段的相對(duì)表達(dá)量如圖4所示，總體變化趨勢(shì)是：感染到0-12 h，4個(gè)選擇系CAT mRNA表達(dá)量逐漸升高，到12 h達(dá)到峰值。12-96 h，4個(gè)選擇系CAT mRNA表達(dá)量逐漸降低。4個(gè)選擇系之間肝胰腺中CAT mRNA各個(gè)時(shí)間段相對(duì)表達(dá)量：6 h時(shí)，A、B兩個(gè)抗病選擇系的肝胰腺CAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于C、D 抗病選擇系（P<0.05）；12 h時(shí)，A抗病選擇系的肝胰腺CAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于D 抗病選擇系（P<0.05）；96 h時(shí)，A、B抗病選擇系的肝胰腺CAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于D 抗病選擇系（P<0.05）其他時(shí)間段4個(gè)抗病選擇系間CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量差異。

4個(gè)抗病選擇系在感染溶藻弧菌后肝胰腺中SOD mRNA各個(gè)時(shí)間段的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示，總體變化趨勢(shì)是：感染至0-24 h，4個(gè)選擇系SOD mRNA表達(dá)量逐漸升高，到24 h達(dá)到峰值。24-96 h，4個(gè)選擇系SOD mRNA表達(dá)量逐漸降低。4個(gè)選擇系之間肝胰腺中SOD mRNA各個(gè)時(shí)間段相對(duì)表達(dá)量：0 h時(shí)，B抗病選擇系的肝胰腺SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于A、D 抗病選擇系（P<0.05）且極顯著高于A抗病選擇系（P<0.01）；24、48 h時(shí)，B抗病選擇系肝胰腺SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于C、D 抗病選擇系（P<0.05），其他時(shí)間段內(nèi)4個(gè)抗病選擇系間SOD相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

圖4 四個(gè)羅氏沼蝦選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺中CAT mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖 5 四個(gè)羅氏沼蝦選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺中SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

3.1 溶藻弧菌感染96 h內(nèi)4個(gè)選擇系羅氏沼蝦肝胰腺HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異

水生動(dòng)物一般終生生活在水環(huán)境中，所以它們與環(huán)境之間的關(guān)系是最為緊密的，兩者之間的關(guān)系大部分是通過(guò)HSP70實(shí)現(xiàn)的。生物體在熱和其他因素刺激（重金屬離子、缺氧、病毒及細(xì)菌感染等）時(shí)，會(huì)發(fā)生熱休克反應(yīng)用來(lái)抑制蛋白的合成，而熱休克蛋白能通過(guò)修復(fù)、重新折疊變性蛋白及解離聚集的蛋白，達(dá)到對(duì)肌體和細(xì)胞的保護(hù)作用。其中HSP70是最為重要的一類［14-16］。有研究報(bào)道HSP70的較高表達(dá)能保護(hù)人單核細(xì)胞免受過(guò)氧化氫引起的毒害、人的A-431細(xì)胞免受氰化鈉的傷害［17］。水產(chǎn)動(dòng)物也有相關(guān)報(bào)道指出HSP70表達(dá)水平的高低對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的抗逆性和環(huán)境的適應(yīng)能力都具有直接關(guān)系。NAKANO等對(duì)兩種潮間杜父魚（Oligocottusmaculosus和O. suyderi）的研究表明，當(dāng)魚體內(nèi)的HSP70儲(chǔ)存較多時(shí)，機(jī)體會(huì)具有更大的耐受能力，機(jī)體能夠適應(yīng)更大的溫差變化［18］。Cruz-Rodriguez等用多環(huán)芳香烴等化學(xué)藥品和污染水體的沉積物來(lái)刺激美洲牡蠣發(fā)現(xiàn)，牡蠣體內(nèi)HSP70表達(dá)量明顯增加，表明HSP70參與了機(jī)體對(duì)不良環(huán)境的抵御作用，從而參與了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦在感染溶藻弧菌后，肝胰腺中HSP70 mRNA表達(dá)量在0、6、12和24 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，48-96 h表達(dá)量降低，這也表明羅氏沼蝦在感染溶藻弧菌后，自身的保護(hù)反應(yīng)觸發(fā)，體內(nèi)迅速促使合成HSP70。結(jié)合4個(gè)羅氏沼蝦感染存活率比較可以得出結(jié)論：HSP70 mRNA表達(dá)量較高的選擇系具有較高的成活率，因此HSP70 mRNA的高表達(dá)量與生物體的抗逆性能力呈正相關(guān)。

3.2 溶藻弧菌感染96 h內(nèi)4個(gè)選擇系羅氏沼蝦肝胰腺中非特異性免疫免疫Se-GPx、CAT、SOD基因相對(duì)含量的差異

當(dāng)生物體受到細(xì)菌、病毒等侵染時(shí)，甲殼動(dòng)物會(huì)發(fā)生呼吸爆發(fā)的現(xiàn)象，這種呼吸爆發(fā)以及其他免疫活動(dòng)中產(chǎn)生的活性氧分子會(huì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生積累，對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損害［19-21］。鑒于這種損害，甲殼動(dòng)物的體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生了很多的具有抗氧化作用的酶，一旦有過(guò)氧化物在體內(nèi)生成，便會(huì)立刻發(fā)揮作用，利用本身的氧化還原作用將過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)害或毒害較低的物質(zhì)［22］。有研究指出對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），用RT-PCR對(duì)Se-GPx基因mRNA在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量分析后，發(fā)現(xiàn)隨著呼吸爆發(fā)現(xiàn)象的發(fā)生，Se-GPx基因的相對(duì)表達(dá)量在0-6 h時(shí)顯著升高，這也說(shuō)明Se-GPx與凡納濱對(duì)蝦免疫過(guò)程有著緊密相關(guān)，因此在甲殼動(dòng)物中Se-GPx基因的表達(dá)水平可以作為其適應(yīng)外界變化和抵御外界病原體入侵的重要指標(biāo)［23，24］。CAT是抗氧化酶的其中一個(gè)，它在清除過(guò)氧化物和超氧自由基、減少或阻止羥基自由基的形成等方面發(fā)揮著重要作用。SOD也是體內(nèi)清除氧自由基主要的酶，它能有效地清除并終止O2引發(fā)的一系列反應(yīng)，對(duì)生物體的抗氧化和氧化平衡起關(guān)鍵作用［25-28］。有很多研究者也發(fā)現(xiàn)，給南美白對(duì)蝦投喂免疫增強(qiáng)劑之后，蝦體內(nèi)SOD的抗氧化活性會(huì)有上升，蝦的抗病能力也會(huì)增強(qiáng)、在感染細(xì)菌和病毒后的存活率有升高。Cheng等［29］克隆了羅氏沼蝦cMnSOD的基因，并且對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行注射細(xì)菌（Lactococcus garvieae），研究了該基因在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)情況。孫燕等［30］研究在飼料中添加益生菌，凡納濱對(duì)蝦的成活率和肝胰腺中SOD基因的相對(duì)表達(dá)量都有所上升。張慶利［31］對(duì)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞中的CAT基因的轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)與CAT活性的變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明蝦感染W(wǎng)SSV后，通過(guò)大幅度提高CAT基因的轉(zhuǎn)錄，合成大量的CAT，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡，在殺滅抵御感染的免疫反應(yīng)過(guò)程中起作用。在感染細(xì)菌或病毒后，通過(guò)熒光定量檢測(cè)，基因較高的表達(dá)量和生物的高成活率存在正相關(guān)的關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4個(gè)羅氏沼蝦抗病選擇系感染溶藻弧菌，通過(guò)熒光定量技術(shù)對(duì)4個(gè)選擇系羅氏沼蝦的非特異性基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，4個(gè)抗病選擇系在感染溶藻弧菌后肝胰腺中的Se-GPx、CAT、SOD表達(dá)量都有所增加，這也說(shuō)明這3種酶參與了羅氏沼蝦的體液免疫。這表明Se-GPx、CAT、SOD對(duì)溶藻弧菌的侵入反應(yīng)比較敏感，在免疫過(guò)程中發(fā)揮著積極作用，可能為羅氏沼蝦的抗病能力以及病害防治工作提供理論依據(jù)。比較4個(gè)羅氏沼蝦選擇系在感染96 h內(nèi)Se-GPx、CAT、SOD相對(duì)表達(dá)量水平，可得出結(jié)論：在4個(gè)選擇系不同時(shí)間Se-GPx、CAT、SOD表達(dá)量也不相同，但是總體變化趨勢(shì)是A、B選擇系高于C、D選擇系。

4 結(jié)論

通過(guò)分析羅氏沼蝦4個(gè)抗病選擇系感染溶藻弧菌后肝胰腺中4個(gè)抗病力基因相對(duì)表達(dá)量的不同，再結(jié)合4個(gè)選擇系感染溶藻弧菌后成活率B>A>D>C，可以得出結(jié)論：甲殼動(dòng)物體內(nèi)HSP70、Se-GPx、CAT、SOD均參與了清除弧菌、保護(hù)生物體的免疫反應(yīng)，且?guī)讉€(gè)基因表達(dá)量水平和機(jī)體的抗病力有直接的關(guān)系，表達(dá)量相對(duì)較高的生物體具有較強(qiáng)的抗病能力。本實(shí)驗(yàn)室選育的4個(gè)抗病選擇系的抗病力強(qiáng)弱也有不同，B選擇系高于其他3個(gè)選擇系，A選擇系抗病力高于C、D選擇系，C和D選擇系抗病力差異不大。

［1］Goyard E, Patrois J, Peignon JM, et al. Selection for better growth of Penaeus styliostrisin Tahiti and New Caledonia［J］. Aquaculture, 2002, 204（3-4）：461-468.

［2］劉波, 明俊超, 謝駿. 人黃蔥醒提取物對(duì)羅氏沼蝦高溫下抗氧化能力與熱應(yīng)激蛋自70基因表達(dá)的影響［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, 34（6）：973-980.

［3］Yahav S, Shamay A, Horev G, et al. Effect of acquisition of improved thermotolerance on the induction of heat shock proteins in broiler chickens［J］. Poult Sci, 1997, 76：1428-1434.

［4］管曉娟. 甲殼動(dòng)物體液免疫相關(guān)酶及免疫因子的研究概況［J］.生命科學(xué)儀器, 2009（6）：3-6.

［5］Li FH, Xiang JH. Signaling pathways regulating innate immune responses in shrimp［J］. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34（4）：973-980.

［6］姜晶晶, 張殿昌, 麻建軍. 合浦珠母貝含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因特征與表達(dá)分析［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2010, 39（6）：614-621.

［7］ 李義. 甲殼動(dòng)物免疫學(xué)的研究進(jìn)展［J］. 水利漁業(yè), 2003, 23（1）：4-6.

［8］ Liu J, Zhang K, Ren X, et al. Bioimprinted protein exhibits glutathione peroxidase activity［J］. Anal Chim Acta, 2004, 504：185-189.

［9］Wang XW, Wang JX. Pattern recognition receptors acting in innate immune system of shrimp against pathogeninfections［J］. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34（4）：981-989.

［10］ Wu CL, Mai KS, Zhang WB, et al. Molecular cloning characterization and mRNA expression of selenium-dependent glutathione peroxidase from abalone Haliotis discus hauuai lnoin response to dietary selenium zinc and iron［J］. Comparative Biochemistry and Physiology C, 2010, 152：121-132.

［11］ Campacordova AI, Hermandezsaavedra NY, Dephilippis R, et al. Generation of superoxide anion and SOD activity in haemocytes and muscle of American white shrimp（Litopenaeus uannamei）as a response to beta-glucan and sulphated polysaccharide［J］. Fish Shellfish Immunology, 2002, 12：353-366.

［12］Flegel TW, Sritunyalucksana K. Shrimp molecular responses to viral pathogens［J］. Marine Biotechnology, 2011, 13：587-607.

［13］黃旭雄, 周洪琪, 宋理平. 急性感染對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦非特異免疫水平的影響［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31（3）：325-331.

［14］Dong YW, Dong SL, Ji TT. Effect of different thermal regimes on growth and physiological perfdrmance of the sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka［J］. Aquaculture, 2008, 275：329-334.

［15］林亞秋, 鄭玉才, 吉紅. 草魚HSP70基因cDNA部分序列克隆及其組織表達(dá)差異［J］. 淡水漁業(yè), 2009, 39（4）：67-71.

［16］ Cara JB, Alura N, Moyano FJ. el al. Fooddeprivatton induces Hsp-70 and Hsp90 protein expression in fry gilthead sea bream and rainbow trout［J］. Comp Biochem Physiol B, 2005, 142：426-431.

［17］Polla BS, Kantengwa S, Franccis D, et al. Mitochondria are effects of heat shock against oxidative injury［J］. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93（13）：6458- 6463.

［18］蘇永騰, 劉波, 周群蘭, 等. 大黃蒽醌提取物對(duì)羅氏沼蝦抗鰻弧菌感染的研究［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008, 32（3）：455-463.

［19］Nakano K, Iwama G. The 70-kDa heat shock protein response in two intertidal sculpins, Oligocottus maculosus and O. snyderi：relationship of hsp70 and thermal tolerance［J］. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A：Molecular&Integrative Physiology, 2002, 133（1）：79-94.

［20］Wang WN, Zhou J, Wang P, et al. Oxidative stress DNA damage and antioxidant enzyme gene expression in the Pacific white shrimp Litopeaaeus vannamei when exposed to acute pH stress［J］. Comparative Biochemistry and Physiology C, 2009, 150：428-435.

［21］Tassanakajon A, Somboonwiwat K, Supungul P, et al. Discovery of immune molecules and their crucial functions in shrimp immunity［J］. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34（4）：954-967.

［22］Choi CY. Molecular characterization and mRNA expression of glutathione peroxidase and glutathione S-transferase during osmotic stress in olive flounder（Paralichthy solivaceus）［J］. Comparative Biochemistry andPhsiology, 2008, 149：330-337.

［23］Hoffmann JA. The immune response of Drosophila［J］. Science, 2003, 426（6）：33-38.

［24］Cheng W, Liu CH, Kuo CM, et al. Dietary administration of sodium alginate enhances the immune ability of white shrimp Litopeaaeus vannamei and its resistance against Vibrioal giaolyticus［J］. Fish Shellfish Immunol, 2005, 18：1-12.

［25］王雪參. 日本沼蝦含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析［D］. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué), 2012.

［26］曹劍香, 簡(jiǎn)紀(jì)常, 吳灶和. 溶藻弧菌疫苗對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的影響［J］. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 24（6）：12-17.

［27］劉洋, 凌去非, 于連洋, 等. 氨氮脅追對(duì)泥鰍不同組織T-SOD和GSH-PX活性的影響［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39（2）：1069-1072.

［28］王啟軍, 張宏福, 王永軍. 熱激蛋白在動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制［J］. 飼料工業(yè), 2006, 27（11）：14-17.

［29］Cheng W, TungYS, Liu CH, Chen JC. Molecularcloning and characterization of cvtosolic manganese superoxide dismutase（cytMn-SOD）from the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii［J］. Fish Shellfish Immunol, 2006, 20（4）：438-449.

［30］孫艷, 劉飛, 麥康森, 等. 飼料中添加益生元對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫基因表達(dá)量和抗病力的影響［J］. 海洋與湖沼, 2013, 43（4）：845-851.

［31］張慶利. 中國(guó)明對(duì)蝦免疫系統(tǒng)中抗氧化相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析［D］. 青島：中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 2007.

（責(zé)任編輯 李楠）

Comparing and Analyzing the Disease Resistances of Four Diseaseresistant Selected Lines of Macrobrachium rosenbergii

LI Yu-feng1DAI Xi-lin1YUAN Xin-cheng1ZHOU Xun1HU Yan-jie1DING Fu-jiang2
（1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）；Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources（Shanghai Ocean University），Ministry of Agriculture；Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding；2. Shanghai Shencao Special Fisheries Development Corps，Shanghai 201516）

Expressions of 4 disease-resistant genes（heat shock protein70（HSP70），Se-GPx，CAT，and SOD）from 4 selected lines（A，B，C，and D）of Macrobrachium rosenbergii were analyzed with real-time PCR. Infected with Vibrio alginolyticus，the disease-resistant abilities of the 4 selected lines were compared based on the survival rates of 4 selected lines and the expression differences ofHSP70，Se-GPx，CAT，and SOD among the 4 selected lines. The results showed that relative expression of HSP70 mRNA of A and B was obviously higher than that of C and D in the hepatopancreas（P<0.05）. The expressions of Se-GPx，CAT，and SOD changed significantly within 96 h，and were different among the 4 selected lines at different time；however，the general trend was that expressions in A and B were higher than those in C and D. The rate of A，B，C，and D was 65.0%，65.8%，51.7%，and 53.3% after infecting with V.alginolyticus for a week，it is inferred that disease-resistant ability of A and B is higher than that of C and D.

Macrobrachium rosenbergii；HSP70；non-specific immune；Vibrio alginolyticus

10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0096

2017-02-17

上海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（蝦類）[滬農(nóng)科產(chǎn)字（2015）第5號(hào)]

李玉鋒，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源于種苗工程；E-mail：959914518@qq.com

戴習(xí)林，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖與海洋生物學(xué)；E-mail：xldai@shou.edu.cn