2008～2013年—2013年上海市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染的監(jiān)測和毒力基因分析小結(jié)

田明勝+彭少杰+陳波+厲曙光

摘要： 目的了解上海市市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染水平和特征。方法2008～2013年，采用GB/T 4789.7-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》方法，對上海市批發(fā)市場、集貿(mào)市場、賣場超市、餐飲環(huán)節(jié)和網(wǎng)購環(huán)節(jié)等污染物監(jiān)測點采集的市售海產(chǎn)品進行副溶血性弧菌污染的定量檢測，對副溶血性弧菌食品分離株采用PCR方法對其進行毒力基因耐熱直接溶血素（tdh）、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（trh）的檢測。結(jié)果 共監(jiān)測市售海產(chǎn)品2643件，共在192件樣品中檢出副溶血性弧菌，總體檢出率7.3%；2.6%（5/192）的菌株tdh或trh陽性，tdh和trh的攜帶率分別為2.1%（4/192）和0.5%（1/192）。不同監(jiān)測月份、不同食品類別和不同采樣地點的海產(chǎn)品，其副溶血性弧菌污染水平總體上存在差異（ P<0.05）。其中6～10月份海產(chǎn)品副溶血性弧菌檢出率和樣品平均濃度顯著高于其他月份（P<0.05）；海產(chǎn)魚類的副溶血性弧菌檢出率（8.4%）和幾何平均濃度（0.209 MPN/g） 顯著高于其他種類海產(chǎn)品（P<0.05）；批發(fā)市場、集貿(mào)市場和賣場超市采集海產(chǎn)品副溶血性弧菌濃度顯著高于其他場所（ P<0.05）。結(jié)論上海市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌在夏秋季節(jié)污染較高，部分食品分離株攜帶有tdh或trh基因，應(yīng)繼續(xù)開展海產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染的風(fēng)險監(jiān)測和探索其環(huán)境影響因素，并針對副溶血性弧菌污染的高風(fēng)險節(jié)點開展風(fēng)險評估和管理。

關(guān)鍵詞： 海產(chǎn)品； 副溶血性弧菌； 監(jiān)測； 毒力基因

Analysis of contamination and virulence genes of Vibrio parahaemolyticusin seafoodsduring 2008～2013 in Shanghai markets

MingshengTiana，b，ShaojiePengb，Bo Chena，ShuguangLia*，

（a Department of Nutrition and Food Hygiene， School of Public Health， Fudan University， 130Dong An Road， Shanghai， China.b General Enforcement Team of Shanghai Food and Drug Administration， 615Liu Zhou Road， Shanghai， China.）

Abstract： ObjectiveTo investigate and characterize the contamination ofVibrio parahaemolyticus in seafoods inShanghai markets.MethodsBased on the method of GB /T 4789. 7-2008 Microbiological Examination of Food

Hygiene：Examination of V.parahaemolyticus，the contamination of V. parahaemolyticus in seafoods from

different predeterminedmonitoring sites in Shanghai was quantitatively determined and the occurrence of virulence genesthermostable direct hemolysin （tdh） and TDH-related hemolysin （trh）， in 192 seafoodssepalatedVibrio parahaemolyticusstrains was detectedby PCR.ResultsA total of 2643 seafoodsamples from wholesale markets，retail markets，supermarkets，catering industries and online shoppingswere collected from January to December in the years of 2008 to 2013.V.parahaemolyticuswas found in 192 samples （ 7.3% ） .Among 192 separated strains， 2.6% （5/192） carry tdh or trh. 2.1%（4/192）were positive for tdh， and 0.5% （1/192） were positive for trh；The geometricmean densities of V. parahaemolyticuswere different significantly in varied seafoodsspecies，sampling monthes，as well aslocations（ P<0. 05） .Especially，geometricmean densitiesof V.parahaemolyticusin June to October were significantly higher than those in othermonths （ P<0. 05） .the detection rate （ 8.4% ） andgeometricmean densities（0.209 MPN/g ） of V.parahaemolyticusin fishes was significantly higher than other seafoods（ P<0. 05 ）. The geometricmean densitiesof V.parahaemolyticus in seafoodsfrom wholesale markets，retail markets，supermarketswere higher than those from other sampling

resources （ P<0. 05）.ConclusionThe contamination ofV.parahaemolyticus inseafoods during summer and fall was relatively high from Shanghai markets .some separated Vibrio parahaemolyticusstrains take virulence genestdh and trh. Thus the contamination of V.parahaemolyticus in seafoodsneeds to be intensively monitored and environmental impact factor should be searched for implementing risk assessment and management on high risk points for Vibrio parahaemolyticuscontamination.

Key words： Seafoods； Vibrio parahaemolyticus；Contaminant Monitoring； Virulence Genes

副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus，以下簡稱VP） 是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于近海岸的海水、海底沉積物和海產(chǎn)品中，主要引起急性胃腸炎和原發(fā)性敗血癥。國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)1992～2001年的數(shù)據(jù)顯示，VP食物中毒居微生物食源性疾病之首，占31.1%，中毒食品主要是海產(chǎn)品[1]；2003～2007 年食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)報告的細菌性食源性疾病暴發(fā)資料中，由VP導(dǎo)致的中毒事件數(shù)報告數(shù)為308起，涉及發(fā)病人數(shù)8234人，分別占同期細菌性食源性疾病報告起數(shù)和人數(shù)的29.1%和25.5%[2]；上海2000～2007 年期間報告的集體性食物中毒事件中由VP引起的起數(shù)和患者人數(shù)分別占同期起數(shù)和人數(shù)的57.4% 和56.0%[3]。

為了解上海市售海產(chǎn)品中VP的污染水平和毒力基因特征，2008-2013年對上海市售海產(chǎn)品的VP污染情況進行了連續(xù)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

根據(jù)本市食品中食源性致病菌污染監(jiān)測計劃，在水產(chǎn)批發(fā)市場、集貿(mào)市場、賣場超市、餐飲環(huán)節(jié)和網(wǎng)購環(huán)節(jié)等固定監(jiān)測點，按照無菌采樣原則采集各類生鮮海產(chǎn)品2643件，樣品包括海產(chǎn)魚類、海產(chǎn)貝類、海產(chǎn)蝦類、海產(chǎn)蟹類和海產(chǎn)頭足類。采樣后樣品于2～8℃冷藏條件下保存運輸送實驗室，采樣后3h內(nèi)進行實驗室檢驗；網(wǎng)購樣品于冷鏈條件下運輸至實驗室，在樣品開箱驗視包裝完整后即刻進行實驗室檢驗。

1.2 檢測方法

采用GB/T 4789.7-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》方法進行VP的定量檢測，2008年5月～2010年10月間，3個稀釋度的檢樣量分別為0.1g、0.01g和0.001g，最低檢出限<3.0 MPN/g；2011年1月～2013年12月間，3個稀釋度的檢樣量分別為1.0g、0.1g和0.01g，最低檢出限<0.3 MPN/g。檢測VP陽性菌株在-80℃冷凍保存，在年末集中對本年檢測分離的VP菌株進行耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，tdh）和tdh相關(guān)溶血素（TDH-related hemolysin，trh）毒力基因的檢測，其中tdh1[4]的引物序列（5～3）為上游：GGTACTAAATGGCTGACATC，下游：CCACTACCACTCTCATATGC；tdh2[5]的引物序列（5～3）為上游：GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC，下游：GGAATAGAACCTTCATCTTCACC；trh1[4]的引物序列（5～3）為上游：GGCTCAAAATGGTTAAGCG，下游：CATTTCCGCTCTCATATGC；trh2[5]的引物序列（5～3）為上游：TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT，下游：CATAACAAACATATGCCCATTTCC。

1.3 統(tǒng)計方法

用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)導(dǎo)入，統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0。參考文獻[6]中m=-（2.303/V）*log（S/n）計算公式，按年月分層后計算未檢出樣品中VP污染的最可能值，其中S為陰性樣品件數(shù)，n為測試樣品件數(shù)，V為取樣量。VP濃度經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后符合正態(tài)分布，樣品VP平均濃度用幾何均數(shù)表示，不同組間VP平均濃度方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時采用非參檢驗的秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同監(jiān)測年份海產(chǎn)品中VP的污染情況

不同監(jiān)測年份海產(chǎn)品產(chǎn)品VP濃度總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。6年間VP平均濃度最高的為2009年（3.090 MPN/g），其次為2010年（2.188 MPN/g）和2008年（1.778 MPN/g），2011～2013年間VP平均濃度顯著降低，并且其檢出率也顯著低于2008-2010年。除2011年VP陽性菌株中未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒基因外，其余5年均在其中1株分離株中發(fā)現(xiàn)tdh或trh基因，見表1。

2.2 不同監(jiān)測月份海產(chǎn)品中VP的污染情況

不同監(jiān)測月份海產(chǎn)品VP濃度總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。VP檢出率和VP平均濃度前3位依次為8月份（16.6%，1.023MPN/g）、7月份（14.6%，0.55 MPN/g） 和9月份（8.3%，0.417 MPN/g）。11月～4月海產(chǎn)品VP污染則是偶有檢出，其污染水平顯著低于5月～10月。tdh或trh基因則主要集中在7月、8月和9月檢測發(fā)現(xiàn)的VP陽性分離株中，見表2。

2.3各類海產(chǎn)品中VP的污染情況

不同種類海產(chǎn)品VP濃度總體上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各類海產(chǎn)品濃度最高為海產(chǎn)魚類（0.209 MPN/g），最低為海產(chǎn)蟹類（0.023 MPN/g），海產(chǎn)蝦類、海產(chǎn)貝類和海產(chǎn)頭足類VP污染平均濃度總體上無差異。tdh或trh基因則主要集中在海產(chǎn)魚類、海產(chǎn)蝦類和海產(chǎn)蟹類的VP陽性分離株中，見表3。

2.4不同采樣地點海產(chǎn)品中VP的污染情況

不同采樣地點海產(chǎn)品VP濃度總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，批發(fā)市場、集貿(mào)市場和賣場超市海產(chǎn)品VP檢出率和濃度均顯著高于其他采樣地點相應(yīng)指標(biāo)（P<0.05），餐飲環(huán)節(jié)海產(chǎn)品中VP檢出率和濃度均顯著低于前述三個環(huán)節(jié)，而網(wǎng)絡(luò)環(huán)節(jié)的22件海產(chǎn)品中未見有VP檢出，tdh或trh基因則主要集中在批發(fā)市場、集貿(mào)市場和餐飲環(huán)節(jié)，其中餐飲環(huán)節(jié)有3株VP陽性菌株均檢出tdh基因，見表4。

3 討論

VP污染已成為我國東南沿海省份一個嚴重的食品安全問題。海產(chǎn)品是VP食源性污染的主要媒介。美國1973～1998 年所有VP食源性暴發(fā)的媒介均為海產(chǎn)品或與海產(chǎn)品交叉污染的食品[7]。日本全國調(diào)查發(fā)現(xiàn)，VP腸炎主要由海產(chǎn)魚、貝類及其加工產(chǎn)品引起[8]。作為一種食源性致病菌，人群VP食物中毒的發(fā)生和食品中VP污染量有關(guān)。

近年來，國內(nèi)已陸續(xù)開展海產(chǎn)品中VP的定量監(jiān)測。劉秀梅等[9]于2003年9～12月對福建、廣東、江蘇和浙江4省市場上的海產(chǎn)品VP污染進行主動監(jiān)測，VP總體檢出率為38.6%，其中甲殼類、貝類和魚類檢出試樣VP濃度分別為171.4、76.9 和50.8MPN/100g。陳艷等[10]于2003年4～8月對福州和廈門市場上的牡蠣進行了VP污染的定量研究，試樣VP的檢出率為58.4%，平均濃度為60MPN/100 g；彭少杰等[11]于2008～2010年夏秋季節(jié)對來自上海市場的海水產(chǎn)品VP污染進行了監(jiān)測和報道，檢出率為13.2%，檢出幾何均值為2.4 MPN/g。和本研究相比，上述研究相應(yīng)海產(chǎn)品總體檢出率雖然顯著高于本研究（7.3%），但VP污染濃度卻基本類似或處于同一數(shù)量級上，檢出率差異可能和樣品產(chǎn)地、抽樣月份、檢驗方法、濃度結(jié)果的計量單位等不同有關(guān)，但本研究是在一個更大的時間跨度（連續(xù)6年并且在后面3年具體到每月）內(nèi)抽樣檢驗的，對于分析海產(chǎn)品中VP污染的季節(jié)變異性更有實踐意義。

本研究顯示，上海地區(qū)不同監(jiān)測點、不同品種和不同月份海產(chǎn)品的VP檢出率和VP 濃度均存在差異。其中，批發(fā)市場、集貿(mào)市場和賣場超市采集海產(chǎn)品VP濃度顯著高于其他場所（P<0. 05），這可能與海產(chǎn)品捕撈后儲存運輸和銷售期間是否能始終保持冷藏冷凍狀態(tài)等因素有關(guān)[12]；海產(chǎn)魚類的VP檢出率（8.4%）和樣品平均濃度（0.209 MPN/g） 顯著高于其他種類的海產(chǎn)品（ P<0. 05），與海產(chǎn)魚是上海地區(qū)主導(dǎo)消費海產(chǎn)品，一年四季均有不同種類銷售，而蟹貝類則有明顯季節(jié)性供應(yīng)有關(guān)；6～10月份海產(chǎn)品VP檢出率和樣品平均濃度顯著高于其他月份（ P<0.05），這既與本市6～10月份常為VP集體性食物中毒高發(fā)月份[3]相吻合，也與Depaola等[13]的研究揭示的在海產(chǎn)品產(chǎn)地海域水溫超過20℃時VP污染濃度較高結(jié)果相一致，提示零售市場上海產(chǎn)品中VP的污染水平既與捕撈海域海水溫度的季節(jié)性變化有關(guān)[14]，又和捕撈后儲存運輸和銷售期間環(huán)境溫度是否能抑制細菌生長間有較為密切的關(guān)系[15]。

上海市售海產(chǎn)品中VP污染較為嚴重，部分食品分離株攜帶有tdh或trh基因，若銷售和消費環(huán)節(jié)貯藏溫度不當(dāng)和時間過長則易導(dǎo)致海產(chǎn)品中VP大量繁殖，而居民常有在夏秋季節(jié)生食或半生食熗蝦、醉蝦等海產(chǎn)品的習(xí)慣，這可對公眾健康構(gòu)成威脅。監(jiān)管部門應(yīng)在夏秋季節(jié)加強海產(chǎn)品零售和儲存期間海產(chǎn)品冷藏冷凍溫度的監(jiān)管，避免儲存溫度過高可能導(dǎo)致的VP大量增殖；而餐飲企業(yè)則需要在夏秋季節(jié)加工海產(chǎn)品時防止交叉污染，以及烹飪時的燒熟煮透；風(fēng)險監(jiān)測部門應(yīng)繼續(xù)對市售海產(chǎn)品開展連續(xù)性的定量監(jiān)測，探索其環(huán)境影響因素，并針對副溶血性弧菌污染的高風(fēng)險節(jié)點開展風(fēng)險評估、交流和管理。

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