基于SSR和ISSR標(biāo)記對(duì)江蘇大竹蟶野生群體和人工增殖群體的聯(lián)合分析

曹 奕，陳愛華，吳楊平，張 雨，姚國興

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省海洋經(jīng)濟(jì)貝類研究開發(fā)中心，南通 226007）

基于SSR和ISSR標(biāo)記對(duì)江蘇大竹蟶野生群體和人工增殖群體的聯(lián)合分析

曹 奕，陳愛華，吳楊平，張 雨，姚國興

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省海洋經(jīng)濟(jì)貝類研究開發(fā)中心，南通 226007）

為探索人工增殖活動(dòng)對(duì)本地大竹蟶（Solen grandis）種質(zhì)資源帶來的影響，采用SSR及ISSR分子標(biāo)記手段對(duì)江蘇大竹蟶野生群體與人工增殖群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了聯(lián)合分析。篩選的14對(duì)SSR引物擴(kuò)增獲得多態(tài)性位點(diǎn)150個(gè)（PPB＝93.16%），Nei′s基因多樣性指數(shù)和平均Shannon信息指數(shù)分別為0.134 2和0.253 5；篩選的10條ISSR引物獲得多態(tài)性位點(diǎn)85個(gè)（PPB＝91.93%），Nei′s基因多樣性指數(shù)和平均Shannon信息指數(shù)分別為0.131 0和0.230 2。兩種方法分析得到野生群體的遺傳多樣性參數(shù)均顯著高于人工增殖群體，但兩群體間并未產(chǎn)生明顯的遺傳分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，江蘇沿海大竹蟶群體的遺傳多樣性水平較高，人工增殖群體的遺傳多樣性雖有所下降，但并未導(dǎo)致該地區(qū)大竹蟶種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)的顯著改變。因此人工增養(yǎng)殖活動(dòng)仍然能夠作為補(bǔ)充大竹蟶資源的主要手段，但應(yīng)探索采用高效生態(tài)的增養(yǎng)殖模式，對(duì)大竹蟶的種質(zhì)資源進(jìn)行合理的開發(fā)與利用。

大竹蟶；SSR；ISSR；增殖群體；遺傳多樣性

大竹蟶（Solen grandis）隸屬瓣鰓綱，簾蛤目，竹蟶科，竹蟶屬，在我國各海域均有分布。其個(gè)大殼薄，肉味鮮美，是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類［1］。但由于自然資源量較少，而且主要通過采捕方式獲得，所以產(chǎn)量較低。開展大竹蟶人工增殖，既可以對(duì)野生資源進(jìn)行保護(hù)，也可以提高產(chǎn)量，帶動(dòng)貝類產(chǎn)業(yè)發(fā)展［2］。江蘇省文蛤良種場自2007年來持續(xù)進(jìn)行人工增殖活動(dòng)，主要地點(diǎn)為江蘇如東蔣家沙海域，使得大竹蟶資源量得到了部分恢復(fù)［3］。但增殖活動(dòng)是否會(huì)改變江蘇海域大竹蟶的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，從而對(duì)生長、抗病、抗逆等生長性狀造成影響，是一個(gè)需要關(guān)注的問題。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）和簡單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence reapeats，ISSR）標(biāo)記技術(shù)都是目前廣泛應(yīng)用于輔助遺傳育種的分子標(biāo)記技術(shù)［4-6］，均具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)［7-8］。本研究采用這兩種分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)江蘇大竹蟶野生群體與增殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，揭示增殖群體的遺傳分化狀況，以期評(píng)估出大竹蟶進(jìn)行良種選育工作的可行性，也為保護(hù)原有種質(zhì)資源提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年8月，野外采樣獲得江蘇如東蔣家沙增殖群體（JJ）、呂四野生群體（LS）大竹蟶（表1）。從兩個(gè)群體中各選取25 ind平均長度約10 cm、質(zhì)量約35 g的三齡健康個(gè)體，取其斧足用于實(shí)驗(yàn)。

表1 大竹蟶樣品采集地點(diǎn)、時(shí)間、數(shù)量Tab.1 Sampling coordinate，time，and number for different S.grandis populations

1.2 DNA提取

采用酚-氯仿法進(jìn)行提取。紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA質(zhì)量，并進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證，提取所得的DNA-20℃保存。

1.3 引物序列

篩選得到大竹蟶SSR引物14對(duì)、ISSR引物10條［9-10］，由上海生工生物工程公司合成，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表2。

1.4 SSR-PCR及ISSR-PCR反應(yīng)體系及程序

SSR-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括1x PCR Buffer，Mg2+濃度1.5 mM，0.2 mmol·L-1dNTPs，1.0μmol·L-1引物，Taq酶1.0 U，模板約100 ng。程序?yàn)椋菏紫冗M(jìn)行94℃變性5 min；然后94℃變性40 s，Tm復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730進(jìn)行毛細(xì)管電泳，確定個(gè)體的等位基因大小。

ISSR-PCR反應(yīng)體系含50 ng·μL-1模板DNA 1.0μL，10×PCR buffer（含Mg2+）2.5μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0μL，10μmol·L-1引物1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2μL，加ddH2O至25 μL；反應(yīng)條件如下：反應(yīng)前94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，38～55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)后72℃延伸7min。產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳電泳，染色后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。對(duì)所得電泳圖進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

獲得各微衛(wèi)星位點(diǎn)上等位基因的條帶大小后，將所得結(jié)果進(jìn)行歸類；ISSR電泳圖譜通過Quantity One軟件進(jìn)行分析。采用Popgene 32軟件進(jìn)行SSR和ISSR檢測(cè)所得結(jié)果遺傳參數(shù)分析［11-12］，并根據(jù)各群體遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算各群體間的遺傳分化系數(shù)、遺傳距離?；谶z傳距離，用Mega 5.0軟件構(gòu)建所有50個(gè)樣品的UPGMA聚類樹。

表2 篩選獲得引物序列Tab.2 Nucleotide sequences of selected primer

2 結(jié)果與分析

2.1 野生群體與增殖群體的遺傳多樣性

14對(duì)SSR引物在野生群體和增殖群體中分別檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)143、138個(gè)，總?cè)后w等位基因數(shù)為6～18個(gè)，共檢測(cè)到161個(gè)等位基因。各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量PIC介于0.611～0.712之間，均表現(xiàn)出高度的多態(tài)性（表3）。表明野生群體和增殖群體均具有相對(duì)豐富的遺傳多樣性。

10條ISSR引物從野生群體及增殖群體中分別擴(kuò)增得到多態(tài)性位點(diǎn)83、76個(gè)，共檢測(cè)得到93個(gè)等位基因。H值和I值分別為0.1311和0.2410（表4），兩種分子方法分析得到蔣家沙增殖群體的遺傳多樣性參數(shù)均低于呂四野生群體，但差異不顯著。

2.2 野生群體與增殖群體的遺傳變異

LS群體的大竹蟶樣品平均等位基因數(shù)、等位基因豐富度、觀察雜合度、期望雜合度均略高于JJ群體，分別為10.2、10.13、0.809、0.815。LS群體近交系數(shù)0.007＞0，而JJ增殖群體的近交系數(shù)則為0.008，兩者間無顯著差異（表5）。

2.3 遺傳分化狀況

分化系數(shù)可表示遺傳分化狀況。分化系數(shù)在0～0.05之間，群體間分化很弱；0.05～0.15之間表示中等分化；0.15～0.25之間表示分化大；大于0.25表示分化極大［13］。

14個(gè)位點(diǎn)在大竹蟶群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)Fst為0.029～0.046，表明大竹蟶增殖群體與野生群體在這些位點(diǎn)上并無明顯的遺傳分化。各群體位點(diǎn)組合均符合Hardy-Weinberg平衡。

而通過10條ISSR引物分析得到JJ群體與LS群體的遺傳分化系數(shù)Gst＜0.05（表6），驗(yàn)證了SSR分析得到的結(jié)果。

表3 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在大竹蟶野生群體及增殖群體中擴(kuò)增得到等位基因數(shù)、遺傳分化指數(shù)、多態(tài)信息含量Tab.3 Allelenumber，GlobalFst，PICfrom14microsatelliteloci withinwildandstockpopulationofSolengrandis

表4 ISSR分析得到的大竹蟶野生群體與增殖群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 GeneticdiversityparametersofthewildandstockS.grandispopulationsbyISSR

表5 野生與增殖大竹蟶群體在14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異情況Tab.5 Geneticvariationat14microsatellitelociforthewildandstockSolengrandispopulations

表6 大竹蟶野生群體與增殖群體間遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Tab.6 Genetic distance and genetic diversity coefficient of the 6 S.grandis populations

2.4 聚類分析

基于SSR得到的UPGMA聚類分析結(jié)果顯示（圖1），JJ4、JJ5、JJ9、JJ20號(hào)個(gè)體與大部分LS群體個(gè)體聚為一支，LS13、LS14、LS19、LS21號(hào)個(gè)體與大部分JJ個(gè)體聚為一支。而ISSR的結(jié)果則顯示（圖2），JJ3、JJ14、JJ17號(hào)個(gè)體與大部分LS群體個(gè)體聚為一支，LS4、LS9、LS20號(hào)個(gè)體聚在一起后，與大部分JJ個(gè)體聚為一支。

本研究的聚類結(jié)果顯示，SSR與ISSR分析所得結(jié)果基本一致，而野生群體與增殖群體中存在個(gè)體與對(duì)方群體中的個(gè)體聚為一支，證明了相互之間存在著一定的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 大竹蟶群體的遺傳多樣性

多態(tài)信息含量PIC＞0.5屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)位點(diǎn)，PIC＜0.25為低度多態(tài)位點(diǎn)［14］。而本研究所得的微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC值均在0.5以上，說明野生群體和增殖群體均具有較高的遺傳多樣性水平。而兩種方法分析得到JJ群體Nei′s基因多樣性、Shannon′s信息指數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率均低于LS群體，但差異并不顯著。該結(jié)果說明：增殖群體仍然保持著較高的遺傳多樣性水平，多樣性較野生群體下降程度較緩，其下降原因主要可能是人工育苗進(jìn)行增殖時(shí)，親本數(shù)量和品質(zhì)帶來的影響。該情況可以通過育苗過程中增加親本數(shù)量等措施加以改善。

3.2 大竹蟶群體的遺傳分化狀況

Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果表明，供試大竹蟶各群體位點(diǎn)組合均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，等位基因分布頻率相對(duì)穩(wěn)定，觀測(cè)雜合度和期望雜合度之間沒有顯著差異，說明大竹蟶野生群體及增殖群體尚未受到選擇、突變等外界自然環(huán)境因素影響。

圖1 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的大竹蟶野生群體及增殖群體個(gè)體的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of individuals from the w ild and stock populations of S.grandis by SSR

圖2 基于ISSR分子標(biāo)記的大竹蟶野生群體及增殖群體個(gè)體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGM A dendrogram of individuals from the w ild and stock population of S.grandis by ISSR

JJ群體與LS群體的Fst及Gst均小于0.05，表明增殖群體與野生群體并沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。而二者的近交系數(shù)分別為0.007、0.008，并未出現(xiàn)顯著差異。說明數(shù)年來的增殖活動(dòng)沒有使增殖群體相對(duì)野生群體產(chǎn)生明顯的遺傳變異，大竹蟶進(jìn)行良種選育工作是可行的。

3.3 遺傳多樣性分析對(duì)大竹蟶增殖活動(dòng)帶來的啟示

江蘇南通地區(qū)野生群體與增殖群體大竹蟶的遺傳多樣性和遺傳分化狀況分析結(jié)果表明，該地大竹蟶增殖群體在保持著高遺傳多樣性水平的同時(shí)，遺傳多樣性略有下降，但未產(chǎn)生明顯的遺傳變異。因此繼續(xù)開展大竹蟶人工育苗，進(jìn)行增殖活動(dòng)是十分必要且可行的，同時(shí)也可以探索大竹蟶的養(yǎng)殖技術(shù)與模式，為大竹蟶資源的恢復(fù)利用擴(kuò)展渠道。但必須持續(xù)對(duì)增殖群體進(jìn)行相關(guān)的監(jiān)測(cè)工作，同時(shí)嚴(yán)格把關(guān)人工育苗的各個(gè)環(huán)節(jié)，防止出現(xiàn)種質(zhì)退化情況。

［1］ 戴聰杰.大竹蟶軟體部分營養(yǎng)成分分析及其評(píng)價(jià)［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，7（4）：304-308.DAIC J.Evaluation on nutrition components of the soft part in Solen gradis［J］.Journal of Jimei University（Natural Science），2002，7（4）：304-308.

［2］ 閆喜武，趙生旭，張 澎，等.培育密度及餌料種類對(duì)大竹蟶幼蟲生長、存活及變態(tài)的影響［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（5）：386-390.YAN XW，ZHAO SX，ZHANG P，et al.Effects of stocking density and alga species on larval growth，survival and metamorphosis in bamboo clam Solen grandis［J］.Journal of Dalian Ocean University，2010，25（5）：386-390.

［3］ 陳愛華，姚國興，張志偉，等.溫度、鹽度和底質(zhì)對(duì)大竹蟶稚貝生長及存活的影響［J］.熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，29（5）：94-97.CHEN A H，YAO G X，ZHANG Z W，et al.Effects of temperature，salinity and sediment on the growth and survival of Solen grandis Dunker juveniles［J］.Journal of Tropical Oceanography，2010，29（5）：94-97.

［4］ 李 超，侯吉倫，王桂興，等.基于牙鲆RNA-seq數(shù)據(jù)中SSR標(biāo)記的信息分析［J］.海洋漁業(yè)，2015，37（2）：122-127.LIC，HOU J L，WANG G X，et al.Bioinformatic analysis of SSR markers in transcriptomic sequenceing Paralichthys olivaceus［J］.Marine Fisheries，2015，37（2）：122-127.

［5］ 牛東紅，李家樂，馮冰冰，等.縊蟶6個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009，15（3）：332-336.NIU D H，LIJL，F(xiàn)ENG B B，et al.ISSR analysis on genetic structure of six Sinonovacula constricta populations［J］.Chinese Journal of Applied andEnvironmental Biology，2009，15（3）：332-336.

［6］ 張 滔.大竹蟶群體遺傳多樣性研究［D］.山東：魯東大學(xué).2012.ZHANG T.Study on the genetic diversity of Solen gradis populations［D］.Shangdong：Ludong University，2012.

［7］ HOU L，LV H L，ZOU X Y，et al.Genetic characterizations of Mactra veneriformis（Bivalve）along the Chinese coast using ISSR-PCR markers［J］.Aquaculture，2006，261（3）：865-871.

［8］ 喬洪金，劉相全，孫國華，等.大竹蟶（Solen grandis）cDNA文庫中微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選［J］.海洋與湖沼，2012，43（6）：1128-1133.QIAO H J，LIU X Q，SUN G H，et al.Isolation and characterization of microsatellite markers from cDNA library of Solen grandis［J］.Oceanologia Et Limnologia Sinica，2012，43（6）：1128-1133.

［9］ YUAN Y，LIQ，KONG L F，et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in the grand jackknife clam Solen grandis（Bivalvia：Veneroida）［J］.Genes and Genomics，2010，32（3）：191-197.

［10］ YUAN Y，LIQ，KONG L F，et al.The complete mitochondrial genome of the grand jackknife clam，Solen grandis（Bivalvia：Solenidae）：A novel gene order and unusual non-coding region［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（2）：1287-1292.

［11］ NEI M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals［J］.Genetics，1978，89（3）：583-590.

［12］ SLATKIN M，BARTON N H.A comparison of three indirectmethods for estimating average levels of gene flow［J］.Evolution，1989，43（7）：1349-1368.

［13］ WRIGHT S.Evolution and the genetics of population variability within and among natural populations［M］.Chicago：University of Chicago Press，1978：4.

［14］ BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

Joint analysis of w ild and proliferative Solen grandis populations from Jiangsu based on SSR and ISSR analysis

CAO Yi，CHEN Ai-hua，WU Yang-ping，ZHANG Yu，YAO Guo-xing
（Jiangsu Marine Economic Shellfish Research and Development Center，Jiangsu Marine Fisheries Research Institute，Nantong 226007，China）

To explore the impact of artificial proliferative activities to the local Solen grandis germplasm resources，a joint analysis including genetic diversity and genetic structure of wild and artificial proliferative Solen grandis populations from Jiangsu based on SSR and ISSR markers were carried out.150 polymorphic lociwere amplified from 14 pairs of SSR primers（PPB＝93.16%）.Nei′s genetic diversity index（He）and average Shannon information index（I）were 0.134 2 and 0.253 5，respectively.85 polymorphic loci were amplified from 10 ISSR primers（PPB＝91.93%），and Nei′s genetic diversity index and average Shannon information index were 0.131 0 and 0.230 2，respectively.Genetic diversity parameters of the wild populations obtained by the two methods were significantly higher than those of the artificial proliferative population（P＜0.05），but genetic differentiation was not significant between two populations（P＞0.05）.The results showed that a high genetic diversity of Solen grandis populations from the coastal area of Jiangsu，though the genetic diversity of the artificial proliferative population decreasing，were not leading to a significant change of the genetic structure of Solen grandis germplasm resources in this region.Therefore，vigorous artificial breeding activities could still serve as the primary measure for supplementing Solen grandis resources.But ecological aquaculture modes should be developed for conducting rational development and utilization for Solen grandis germplasm resources.

Solen grandis；SSR；ISSR；proliferative population；genetic diversity

S 917

A

1004-2490（2017）03-0249-07

2016-02-16

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目〔CX（14）2083號(hào)〕；南通市農(nóng)村科技創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（HL2014018號(hào)）；江蘇省屬公益類科研院所能力提升項(xiàng)目（BM2015017-2號(hào)）

曹 奕，研究實(shí)習(xí)員，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：caoyi19881123＠126.com

陳愛華，研究員。E-mail：chenah540540＠aliyun.com