微小RNA-101對胰腺癌PANC1細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及其作用機制

王宏 馬磊

1山西省汾陽醫(yī)院普外科,汾陽 032200;2山西省汾陽醫(yī)院病理科,汾陽 032200

近年研究發(fā)現(xiàn),多種微小RNA(microRNA,miRNA)在胰腺癌中存在異常表達,與胰腺癌的生物學(xué)特性密切相關(guān)[1]。其中miR-101不僅參與調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的增殖、凋亡、耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移[2],還與胰腺癌患者的預(yù)后有關(guān)[3]。胰腺癌患者腫瘤組織IL-6、JAK2和STAT3等基因的表達異常升高[4-5],而關(guān)于miR-101對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的調(diào)控是否與IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)尚無報道。本研究旨在探討miR-101在胰腺癌細胞中的表達情況及其對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的作用,并進一步觀察IL-6/JAK2/STAT3信號通路在這一過程中的變化,以期為胰腺癌的靶向治療提供新的思路。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)與分組

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1購自美國ATCC細胞庫,常規(guī)培養(yǎng)、傳代。將穩(wěn)定培養(yǎng)的PANC1細胞分為對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組,其中對照組不做任何處理,mimic-NC組轉(zhuǎn)染miRNA模擬體的陰性對照物,miR-101 mimic組轉(zhuǎn)染miR-101模擬體,inhibitor-NC組轉(zhuǎn)染miRNA 抑制劑陰性對照物,miR-101 inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-101抑制劑。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞以進行后續(xù)研究。轉(zhuǎn)染物均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

二、方法

1．miR-101表達水平的檢測:采用qRT-PCR法檢測PANC1細胞miR-101相對表達水平。收集各組PANC1細胞,利用Trizol試劑盒提取細胞總RNA,采用 RNA 逆轉(zhuǎn)錄與擴增試劑盒(日本TaKaRa公司)轉(zhuǎn)錄cDNA,再用 Green “TB Premix Ex Taq” (TliRnaseH Plus,日本TaKaRa公司)行實時熒光定量PCR反應(yīng),操作步驟參考說明書。內(nèi)參選用U6。miR101正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTACAGTACTGTGATAA-3′,反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6正向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTGCACAA-3′,反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5 min;95°C變性15 s,60°C退火20 s,72°C延伸40 s,共40個循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值,應(yīng)用2-ΔΔCT公式計算miR-101的相對表達水平。

2．細胞增殖的檢測:采用MTT法檢測各組PANC1細胞增殖率。收集各組PANC1細胞,用DMEM培養(yǎng)基重懸,以1×105/孔的細胞密度接種于96孔板中,24 h后在細胞中加入MTT溶液,37℃孵育4 h,棄培養(yǎng)基,加入DMSO,混勻后室溫避光孵育。上酶聯(lián)檢測儀測定各孔細胞490 nm處的吸光度值(A490值),計算細胞增殖率。增殖率=(檢測時的A490值-0 h時的A490值)×100%。

3．細胞凋亡的檢測:采用流式細胞儀檢測各組PANC1細胞凋亡。將PANC1細胞收集至流式管中,3 000 r/min離心10 min,加入結(jié)合緩沖液制成細胞懸液后,加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素結(jié)合液,混勻后加入碘化丙啶避光冰浴15 min進行染色,上流式細胞儀檢測細胞的凋亡。凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

4．細胞侵襲能力的檢測:采用Transwell試劑盒檢測各組PANC1細胞侵襲能力。將DMEM培養(yǎng)基稀釋的基質(zhì)膠加入到Transwell上室中,下室中僅加入DMEM培養(yǎng)基,于37℃處理24 h。取各組PANC1細胞制成細胞懸液后,加入到處理好的Transwell小室中,培養(yǎng)48 h后,加入多聚甲醛固定細胞20 min,再行0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min后,置顯微鏡高倍視野(×200)下拍攝細胞照片,并利用Image J軟件計算穿膜細胞數(shù)。

5．IL-6、JAK2、p-JACK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達水平檢測:提取各組細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃ 5 s變性;55℃ 30 s退火;72℃ 30 s,40個循環(huán);72℃ 10 min。以β-actin作為內(nèi)參。采用相對定量法,以2-△△ct表示各組基因mRNA表達的倍比關(guān)系。

6．IL-6、JAK2、p-JACK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平檢測:收集各組細胞,加入細胞裂解液,提取細胞總蛋白質(zhì)。BCA法測定蛋白濃度。取50 μg樣品常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達量,以β-actin為內(nèi)參。所有抗體均購于Abcam公司。所有一抗工作濃度均為1∶1 000,二抗工作濃度為1∶5 000。最后行顯色反應(yīng),掃描膠片后用Image J軟件分析蛋白灰度值。

7．miR-101靶向基因預(yù)測及檢驗:starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-101可能與IL-6具有靶向結(jié)合的作用,故構(gòu)建包含IL-6靶向結(jié)合位點序列的IL-6-UTR野生型(IL-6 wt)和靶向結(jié)合位點序列突變的突變型(IL-6 mut)重組質(zhì)粒。取對數(shù)生長期且未經(jīng)轉(zhuǎn)染的PANC1細胞以密度1×105/孔接種到24孔板中,將生長到80%的細胞分為mimic-NC+IL-6 wt組、miR-101 mimic+IL-6 wt組、mimic-NC+ IL-6 mut組和miR-101 mimic+ IL-6 mut組。mimic-NC+IL-6 wt組轉(zhuǎn)染miRNA模擬體陰性對照物與IL-6 wt重組質(zhì)粒;miR-101 mimic+IL-6 wt組轉(zhuǎn)染miRNA 模擬體與IL-6 wt重組質(zhì)粒;mimic-NC+IL-6 mut組轉(zhuǎn)染miRNA 模擬體陰性對照物與IL-6 mut重組質(zhì)粒;miR-101 mimic+ IL-6 mut組轉(zhuǎn)染miRNA 模擬體與IL-6 mut重組質(zhì)粒。細胞培養(yǎng)48 h后,依照試劑盒說明書檢測熒光素酶的活性,以預(yù)測miR-101與IL-6的靶向關(guān)系。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組PANC1細胞miR-101表達水平比較

對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組miR101表達水平分別為1.98±0.12、2.01±0.18、6.73±0.23、2.16±0.22、1.34±0.13,miR-101 mimic組miR101表達水平顯著高于對照組和mimic-NC組(t值分別為140.824、126.231),而miR-101 inhibitor組顯著低于對照組、inhibitor-NC組和miR-101 mimic組(t值分別為28.694、24.782、157.317),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)。對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組間miR-101表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.388,P=0.218)。說明miR101-mimic和miR101-inhibitor轉(zhuǎn)染成功。

二、各組PANC1細胞增殖率比較

對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組和miR-101 inhibitor組PANC1細胞增殖率分別為(32.75±2.43)%、(33.17±2.77)%、(15.68±1.17)%、(31.57±2.65)%和(45.75±3.16)%,miR-101mimic組PANC1細胞的增殖率顯著低于對照組和mimic-NC組(t值分別為51.590、47.591),而miR-101 inhibitor組高于對照組、inhibitor-NC組和miR-101 mimic組(t值分別為25.453、26.941、68.054),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組間PANC1細胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.247,P=0.521)。說明miR-101可抑制癌細胞增殖。

三、各組PANC1細胞凋亡率比較

對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組和miR-101 inhibitor組PANC1細胞凋亡率分別為(3.82±0.57)%、(3.54±0.55)%、(28.61±0.78)%、(3.57±0.63)%和(1.03±0.62)%,miR-101 mimic組PANC1細胞的凋亡率顯著高于對照組和mimic-NC組(t值分別為199.833、204.252),而miR-101 inhibitor組顯著低于對照組、inhibitor-NC組、miR-101 mimic組(t值分別為26.069、22.722、221.131),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001,圖1)。對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組間PANC1細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.014,P=0.338)。說明miR-101促進癌細胞的凋亡。

圖1 對照組(1A)、mimic-NC組(1B)、miR-101 mimic組(1C)、inhibitor-NC組(1D)及miR-101 inhibitor組(1E)凋亡的PANC1細胞

四、各組PANC1細胞侵襲能力比較

對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組和miR-101 inhibitor組的穿膜細胞數(shù)分別為(125.82±3.55)、(132.17±4.28)、(58.83±3.24)、(128.77±5.06)、(248.42±5.64)個/高倍視野,miR-101 mimic組的穿膜細胞數(shù)顯著低于對照組和mimic-NC組(t值分別為110.616、109.394),而miR-101 inhibitor組顯著高于對照組、inhibitor-NC組、miR-101mimic組(t值分別為142.406、118.872、224.887),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001,圖2)。說明miR-101抑制癌細胞的侵襲能力。

圖2 對照組(2A)、mimic-NC組(2B)、miR-101 mimic組(2C)、inhibitor NC組(2D)及miR-101 inhibitor組(2E)PANC1侵襲細胞數(shù)(結(jié)晶紫染色 ×200)

五、各組PANC1細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA及蛋白表達水平比較

miR-101 mimic組PANC1細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達水平顯著低于對照組、mimic-NC組,而miR-101 inhibitor組顯著高于對照組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組間IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的mRNA相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組PANC1細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達水平比較

miR-101 mimic組PANC1細胞的IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表達水平顯著低于對照組和mimic-NC組,而miR-101 inhibitor組PANC1細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平顯著高于對照組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2,圖3)。對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組組間IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組PANC1細胞IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平比較

圖3 對照組(1)、mimic-NC組(2)、miR-101 mimic組(3)、inhibitor-NC組(4)及miR-101 inhibitor組(5)PANC1細胞相關(guān)分子蛋白的表達(蛋白質(zhì)免疫印跡法)

六、miR-101靶向基因檢測

mimic-NC+IL-6 wt組、miR-101 mimic+IL-6 wt組、mimic-NC+IL-6 mut組和miR-101 mimic+IL-6 mut組的熒光素酶活性分別為1.05±0.08、0.44±0.06、1.05±0.06和1.04±0.05,miR-101 mimic+IL-6 wt組的熒光素酶活性顯著低于mimic-NC+IL-6 wt組(P<0.05);miR-NC+IL-6 wt組、mimic-NC+ IL-6 mut組和miR-101 mimic+IL-6 mut組間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明miR-101可靶向作用于IL-6。

討 論

自從1993年miRNA lin-4在線蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)至今,在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定超過數(shù)千種miRNA。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的小分子RNA,可通過與mRNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其翻譯或降解來影響基因表達。研究發(fā)現(xiàn),盡管在人類基因組中,miRNA所占比例僅有1%～3%,但約30%的基因表達會受基因組內(nèi)miRNA的調(diào)控[6]。這些基因參與多種生理過程,包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,機體細胞的失控性增殖、凋亡減少、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成等。miRNA在腫瘤中的作用是復(fù)雜的,既有促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用,也有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。其中,miR-101可發(fā)揮抑癌基因的作用,調(diào)控細胞的多個生理過程。在骨肉瘤組織中,miR-101可以通過靶向ZEB2抑制骨肉瘤的增殖和侵襲[2];在有轉(zhuǎn)移的膽囊癌組織中,miR-101表達水平顯著下降,且與腫瘤的大小、TMN分級、轉(zhuǎn)移程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。在胰腺癌細胞株和組織中,miR-101的表達也顯著降低,且胰腺癌組織中miR-101的表達量明顯低于癌旁組織[7]。本研究結(jié)果表明,PANC1細胞miR-101表達的增加可以抑制細胞的增殖、促進細胞凋亡、降低細胞侵襲能力;而抑制miR-101表達則使PANC1細胞增殖和侵襲能力增強、凋亡率降低。提示miR-101可以抑制胰腺癌細胞的增殖,促進其凋亡,同時減弱其侵襲能力。

在臨床研究中發(fā)現(xiàn),胰腺癌患者腫瘤組織中IL-6、JAK2和STAT3等基因的表達異常升高,IL-6是一種介導(dǎo)炎癥的白細胞介素,其可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的免疫和炎癥反應(yīng),影響機體的生理和病理狀態(tài)。研究表明IL-6可以促進胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和化學(xué)因子,影響胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展[8]。IL-6的高表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)行為相關(guān),在多個研究中被證實是判斷惡性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一[9]。IL-6與其受體結(jié)合后,通過下游的JAK-STAT信號通路激活轉(zhuǎn)錄。其中STAT3信號通路被認為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的主要途徑,在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境炎癥相關(guān)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-6可調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3通路促進B細胞向漿細胞分化,進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生,促進腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為的發(fā)生[10]。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-101的表達可降低PANC1細胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達,而下調(diào)miR-101的表達則導(dǎo)致IL-6、JAK2、STAT3 mRNA和蛋白質(zhì)表達升高。這些結(jié)果提示,miR-101能夠抑制PANC1細胞中的IL-6/JAK2/STAT3信號通路。

綜上所述,miR-101在調(diào)控胰腺癌細胞增殖、凋亡和侵襲方面具有潛在的作用,并可能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。關(guān)于miR-101在胰腺癌中的作用機制以及其是否會成為新的治療靶點仍需要更多的體內(nèi)研究進一步深入。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明王宏:研究設(shè)計、研究操作、論文撰寫、論文修改; 馬磊:研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析、工作支持、經(jīng)費支持