小麥赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

劉超頔 侯占銘

摘要 [目的]敲除小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）FGSG_03700基因，確定其缺失突變體表型，從而分析該基因的生物學(xué)功能。[方法]應(yīng)用Split Marker基因敲除技術(shù)，構(gòu)建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒，通過PEG介導(dǎo)，進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。[結(jié)果]通過PCR正負(fù)篩查，得到3個確定的突變體，分別命名為ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通過表型驗(yàn)證及孢子對番茄侵染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除突變體的菌落形態(tài)及生長速度沒有明顯變化，致病力沒有減弱，但突變體的產(chǎn)孢量低于野生型PH-1。[結(jié)論]FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞 小麥赤霉菌；Split Marker；基因敲除；FGSG_03700

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0149-07

Research on Knock-out and Function of FGSG_03700 Gene in Fusarium graminearum

LIU Chao-di， HOU Zhan-ming（College of Life Science and Technology， Inner Mongolia Normal University， Hohhot，Inner Mongolia 010020）

Abstract [Objective] To knock out FGSG_03700 gene in Fusarium graminearum and determine the phenotype of the knock-out mutants so as to analyze the biological function of this gene. [Method]By employing Split Marker gene knockout strategy， gene knock-out cassette containing hygromycin phosphotransferase gene hph was built and transformed into protoplast of wild type PH-1 by PEG-mediated method. [Result] Three mutants were screened by PCR positively and negatively screening named as ΔFGSG_03700 1-2， ΔFGSG_03700 2-2 and ΔFGSG_03700 2-3， respectively. The analysis of phenotype and tomato infection test revealed that there had no evident changes in colony morphology， growth rate and pathogenicity between the mutants and wild type. However， the spore quantity of mutants was significantly lower than PH-1.[Conclusion] FGSG_03700 gene is possibly related to the growth of spore in F.graminearum.

Key words Fusarium graminearum；Split Marker；Gene knock-out；FGSG_03700

小麥赤霉病（Fusarium head blight，F(xiàn)HB）是在世界溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)麥田廣泛發(fā)生的一種毀滅性病害[1]，其致病優(yōu)勢種為小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）[2]。由小麥赤霉菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，即真菌毒素，會導(dǎo)致作物產(chǎn)量銳減，降低谷物質(zhì)量[3-5]。當(dāng)其中產(chǎn)生的2種主要真菌毒素——脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）在人畜體內(nèi)達(dá)到一定含量時，會嚴(yán)重危害人畜健康[6]。為了從遺傳角度在根本上防治該病害的發(fā)生，通過基因敲除技術(shù)鑒別某些基因的致病力已成為一種理想的方式。目前，很多相關(guān)致病基因已被成功敲除、克隆和鑒定。如1997年敲除并鑒定了與毒素生物合成有關(guān)的Tri5基因[7]；2002年Hou等[8]發(fā)現(xiàn)了與雌性繁殖、異核體形成有關(guān)并在侵染寄主等過程中有重要作用的MGV1基因；2006年Shim等[9]發(fā)現(xiàn)了與真菌分泌毒素和雌性繁殖有關(guān)的FSR1基因；2011年吳彬[10]敲除FgAC1基因，發(fā)現(xiàn)它調(diào)控菌絲生長速度與色素合成等。

有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）鏈?zhǔn)钦婧松镄盘杺鬟f網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一[11]，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對各種生理過程的調(diào)控都具有生物進(jìn)化的高度保守性，通常在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)都存在著多條并行的MAPKs信號通路。該信號通路基因編碼Ser、Thr和Tyr蛋白激酶，由MAP3K-MAP2K-MAPK組成，依次通過磷酸化將上游信號傳遞給下游應(yīng)答分子[12]。MAPKs通路中基因的敲除及功能的鑒定大多是以酵母中的MAPK信號通路為依據(jù)的。酵母菌中5條MAPK信號級聯(lián)通路分別調(diào)節(jié)酵母菌的接合生殖、菌絲生長、細(xì)胞壁整合、滲透脅迫和胞壁組裝，其中的每條通路都相互獨(dú)立，互不交聯(lián)[13]。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析得到敲除小麥赤霉菌中MAPK通路上的MGV1基因后的FGSG_03700基因?yàn)轱@著上調(diào)基因，通過基因敲除技術(shù)對FGSG_03700基因進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株。

小麥赤霉菌野生型PH-1菌株及質(zhì)粒pCB1003[含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph）]均來源于美國普渡大學(xué)，現(xiàn)由內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物設(shè)計。從小麥赤霉菌基因數(shù)據(jù)庫（Fusarium comparative database）中查找FGSG_03700的基因序列[>F.graminearum PH-1（FG3）supercont 3.2 of Gibberella zeae PH-1[DNA] 2939077-2944798 +]，并下載FGSG_03700基因及其上下游2 000 bp的堿基序列，根據(jù)下載的基因序列以及hph的堿基序列設(shè)計構(gòu)建基因敲除盒時所需的PCR引物和檢測所需的目的基因內(nèi)部引物，該試驗(yàn)引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.3試劑、酶及培養(yǎng)基。潮霉素（Hygromycin B，50 mg/mL）、Chitinase（幾丁質(zhì)酶）、Driselase（崩潰酶）、Lysing enzyme（溶菌酶）均購自Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix購于南京博爾迪公司；真菌基因組DNA提取試劑盒（BioFlux）；普通質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型，TIANGEN）；10×TBE電泳緩沖液、STC buffer、PTC buffer、1.2 mol/L KCl溶液、原生質(zhì)體（Protoplasting）緩沖液、CMC培養(yǎng)基、YEPD液體培養(yǎng)基、TB3液體培養(yǎng)基、TB3固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、TCC培養(yǎng)基等[10]。

1.2 方法

1.2.1 pCB1003質(zhì)粒DNA的提取。從LB固體培養(yǎng)基上挑取該質(zhì)粒單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h左右。之后將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，12 000 r/min離心1 min，保留沉淀。之后的提取步驟按照普通質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型，TIANGEN）中的提示進(jìn)行，得到pCB1003的質(zhì)粒DNA并對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 小麥赤霉菌野生型菌株P(guān)H-1基因組DNA的提取。將在TCC固體培養(yǎng)基上活化3 d后的野生型小麥赤霉菌PH-1的菌絲接種于YEPD液體培養(yǎng)基中（含Ampicillin），25 ℃、175 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。用無菌雙層miracloth過濾該培養(yǎng)基后保留菌絲，用滅菌的濾紙吸干多余的培養(yǎng)液，并將菌絲用錫紙包好，-80 ℃過夜保存后將其從冰箱中取出置于液氮中迅速研磨至粉末狀。之后的操作嚴(yán)格按照真菌基因組DNA提取試劑盒的提示進(jìn)行，得到PH-1基因組DNA并對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 FGSG_03700基因敲除盒的構(gòu)建——Split Marker法。以提取的PH-1基因組 DNA為模板，F(xiàn)GSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R為引物對FGSG_03700基因上下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以提取的pCB1003質(zhì)粒DNA為模板，HYG/F-HY/R和YG/F-HYG/R為引物對Hygromycin（hph）基因上下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Split Marker重疊PCR擴(kuò)增時分別以FGSG_03700基因上游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和hph基因上游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，F(xiàn)GSG_03700 1F-HY/R為引物；FGSG_03700基因下游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和hph基因下游PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，YG/F-FGSG_03700 4R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR過程注意選擇適宜的退火溫度及延伸時間，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 FGSG_03700基因敲除——原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化。將在TCC固體培養(yǎng)基上活化3 d的野生型小麥赤霉菌PH-1的菌絲接種于CMC液體培養(yǎng)基中，25 ℃、175 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。使用無菌雙層miracloth將含有孢子的液體過濾后并離心5 min，將沉淀的孢子用YEPD液體培養(yǎng)基重新懸起并全部轉(zhuǎn)移到該培養(yǎng)基中，25 ℃、175 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，此時需嚴(yán)格控制時間。12 h后用無菌雙層miracloth過濾，并用1.2 mol/L KCl沖洗4次后用滅菌藥勺將收集到的菌絲放入50 mL無菌離心管中，將現(xiàn)配制好的原生質(zhì)體Buffer過濾滅菌到裝有菌絲的離心管中，30 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)約2 h。顯微鏡下制片觀察原生質(zhì)體釋放情況，達(dá)到要求后用無菌雙層miracloth將原生質(zhì)體過濾至三角瓶中，取70 mL的1.2 mol/L KCl溶液沖洗濾布至瓶內(nèi)液體為100 mL，25 ℃、4 000 r/min，離心5 min。棄上清，加STC buffer懸浮沉淀并定容至50 mL，混合均勻，25 ℃、4 000 r/min，離心5 min。棄去上清液，加600 μL STC buffer輕輕將沉淀懸起，混合均勻后冰浴6 h。將FGSG_03700基因的重疊PCR產(chǎn)物上下游各取10、300 μL原生質(zhì)體混合于15 mL無菌離心管中，輕輕混勻后室溫靜置20 min。之后取1.25 mL 40% PTC buffer加入該離心管并混勻，室溫靜置20 min。最后向該離心管中加入5 mL TB3液體培養(yǎng)基（含有50 μg/mL Ampicillin），25 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)15 h。

1.2.5 ΔFGSG_03700轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定。將振蕩培養(yǎng)的原生質(zhì)體取出，25 ℃、4 000 r/min離心5 min，棄去上清液后向離心管中加入10 mL LMT agar TB3固體培養(yǎng)基（含有終濃度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），與原生質(zhì)體混合均勻后倒入滅菌的90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃過夜培養(yǎng)。之后再向其中加入10 mL LMT agar TB3固體培養(yǎng)基（含有終濃度250 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin），25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。3～4 d后長出單菌落轉(zhuǎn)化子，分別挑取轉(zhuǎn)化子接種到TCC固體培養(yǎng)基（含有150 μg/mL Hygromycin B和50 μg/mL Ampicillin）上繼續(xù)篩選。選取與在TCC固體培養(yǎng)基（含有50 μg/mL Ampicillin）上生長的小麥赤霉菌野生型PH-1單菌落表型有差異的轉(zhuǎn)化子提取其基因組DNA。之后以提取的轉(zhuǎn)化子基因組DNA及野生型PH-1基因組DNA作模板，HYG/F-HYG/R、FGSG_03700 1F-HY/R作引物進(jìn)行PCR正篩，F(xiàn)GSG_03700 N1F/N2R作引物進(jìn)行PCR負(fù)篩，并對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，只有正負(fù)篩選擴(kuò)增出的條帶均符合預(yù)期結(jié)果的轉(zhuǎn)化子才能被確定為正確的敲除突變體。

1.2.6 FGSG_03700敲除突變體表型觀察和致病力檢測。挑取野生型PH-1和敲除突變體FGSG_03700的相同大小的菌絲分別接種于60和90 mm裝有TCC培養(yǎng)基（含50 μg/mL Ampicillin）的培養(yǎng)皿中心，每個菌種各做3個重復(fù)，25 ℃，培養(yǎng)3～4 d，觀察60 mm培養(yǎng)皿中菌株生長過程中的形態(tài)變化；測量90 mm培養(yǎng)皿中菌株的生長速度，即菌落直徑。將野生型和敲除突變體菌株分別接種于CMC培養(yǎng)基中，每個菌株各做3個重復(fù)，25 ℃、175 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后制片，顯微鏡下觀察不同分生孢子之間的形態(tài)有無不同。之后用無菌雙層miracloth過濾，用血球計數(shù)板對含有孢子的濾液進(jìn)行計數(shù)。對洗凈的番茄用75%的乙醇消毒處理，再向其中分別注入10 μL 含有PH-1和ΔFGSG_03700孢子的濾液，深度約1.5 cm，標(biāo)記，25 ℃靜置培養(yǎng)4 d后，對比二者對蕃茄的侵染情況并拍照記錄，各做3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCB1003質(zhì)粒DNA 取5 μL所提質(zhì)粒DNA進(jìn)行0.7%脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，目的DNA片段長度在4 000～5 000 bp，結(jié)果符合預(yù)期片段大?。▓D1）。

2.2 野生型小麥赤霉菌PH-1基因組 DNA 取5 μL所提小麥赤霉菌基因組DNA進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，目的DNA片段長度符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。

2.3 FGSG_03700基因上下游PCR擴(kuò)增序列

以野生型小麥赤霉菌PH-1菌株的基因組DNA為模板，分別以FGSG_03700 1F/FGSG_03700 2R和FGSG_03700 3F/FGSG_03700 4R為引物對FGSG_03700基因的上、下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker。上游目的片段長度約為575 bp，下游目的片段長度約為649 bp，結(jié)果符合預(yù)期片段大?。▓D3）。

2.4 hph基因上下游PCR擴(kuò)增序列 以pCB1003質(zhì)粒DNA為模板，分別以HYG-F/HY-R和YG-F/HYG-R為引物對hph基因的上、下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker。上游目的片段長度約為764 bp，下游目的片段長度約為931 bp，結(jié)果符合預(yù)期片段大?。▓D4）。

2.5 Split marker重疊PCR擴(kuò)增序列 以FGSG_03700基因上游PCR產(chǎn)物和hph基因上游PCR產(chǎn)物為模板，以FGSG_03700 1F和HY/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期片段長度為1 339 bp；以FGSG_03700基因下游PCR產(chǎn)物和hph基因下游PCR產(chǎn)物為模板，以YG/F和FGSG_03700 4R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期片段長度為1 580 bp。之后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以1 kb plus DNA ladder為Marker，結(jié)果符合預(yù)期片段大?。▓D5）。

2.6 敲除FGSG_03700基因轉(zhuǎn)化子的PCR正負(fù)篩選 將HYG/F和HYG/R、FGSG_03700 1F和HY/R這2對引物用于PCR正向篩選，引物HYG/F和HYG/R擴(kuò)增產(chǎn)物長度應(yīng)為1 380 bp，引物FGSG_03700 1F和HY/R擴(kuò)增產(chǎn)物長度應(yīng)為1 339 bp，由于敲除突變體中FGSG_03700基因已被hph基因替代，因此在PCR過程中，只有以正確的敲除突變體為模板才能擴(kuò)增出目的片段，電泳結(jié)果有預(yù)期條帶，而以野生型PH-1為模板不能擴(kuò)增出任何片段，電泳結(jié)果沒有條帶。以FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R為引物進(jìn)行的PCR負(fù)向篩選，由于引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R設(shè)計于FGSG_03700基因內(nèi)部，擴(kuò)增產(chǎn)物長度應(yīng)為788 bp，故成功敲除FGSG_03700基因的突變體不再含有該基因，以其為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增不會出現(xiàn)引物FGSG_03700 N1F和FGSG_03700 N2R之間的片段，電泳結(jié)果沒有條帶，而野生型PH-1內(nèi)仍含有此基因片段，因此以PH-1為模板會擴(kuò)增出目的片段，電泳結(jié)果有預(yù)期條帶（圖6～8）。

2.7 FGSG_03700基因敲除轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定

2.7.1 菌落形態(tài)。對比在60 mm培養(yǎng)皿中的TCC培養(yǎng)基上生長4 d的野生型PH-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)二者之間的生長過程及形態(tài)無顯著差異（圖9）。

2.7.2 菌落生長速度。連續(xù)4 d每24 h 1次對培養(yǎng)于90 mm培養(yǎng)皿中的TCC培養(yǎng)基上的野生型PH-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的菌落直徑進(jìn)行測量與記錄，繪制生長曲線圖，發(fā)現(xiàn)敲除突變體ΔFGSG_03700的生長速度與野生型菌株P(guān)H-1基本沒有差別（圖10）。

2.7.3 產(chǎn)孢量的變化。分別吸取10 μL 在CMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子，用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果顯示敲除突變體ΔFGSG_03700的孢子數(shù)量明顯減少。野生型菌株P(guān)H-1的分生孢子量平均為2.5×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 1-2的分生孢子量平均是1.0×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 2-2的分生孢子量平均是1.1×106個/mL；敲除突變體ΔFGSG_03700 2-3的分生孢子量平均是1.0×106個/mL。由此看來，敲除突變體的孢子數(shù)比野生型明顯減少。

2.7.4 分生孢子形態(tài)觀察。用光學(xué)顯微鏡觀察在CMC培養(yǎng)基中生長4 d的野生型菌株P(guān)H-1和敲除突變體ΔFGSG_03700的孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)二者在形狀、橫膈膜數(shù)量、大小等方面基本沒有差別。分生孢子的形態(tài)均為鐮刀形，其橫膈膜數(shù)為3～7個。顯微鏡拍照對比結(jié)果如圖11所示。

2.7.5 分生孢子對蕃茄侵染試驗(yàn)。分別吸取10 μL在CMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d的PH-1和ΔFGSG_03700的分生孢子注入到新鮮的番茄中，培養(yǎng)4 d后觀察到野生型菌株P(guān)H-1與ΔFGSG_03700孢子注入的周圍區(qū)域都出現(xiàn)腐爛，且注入部位均長出白色菌絲，說明二者均可以侵染番茄，但從腐爛面積來看，二者侵染差異不顯著（圖12）。

3 討論與結(jié)論

通過PCR擴(kuò)增及Split Marker技術(shù)構(gòu)建好基因敲除盒，利用同源重組原理及PEG介導(dǎo)法進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，使得hph基因取代野生型PH-1中的FGSG_03700基因得到預(yù)期的敲除突變體。首先，通過抗藥性的初步篩選，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上可以存活并生長的均為轉(zhuǎn)化子。然后單獨(dú)將每一個轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有潮霉素的TCC培養(yǎng)基中，提取轉(zhuǎn)化子DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證以進(jìn)一步確定目的突變體，采用3組引物進(jìn)行正負(fù)篩查，同時符合3組引物篩查結(jié)果的被確認(rèn)為敲除突變體ΔFGSG_03700。由于小麥赤霉菌營養(yǎng)體是單倍體，故敲除突變體的表型不涉及顯隱性關(guān)系，可以直接表達(dá)。一般情況下，敲除突變體會有一些區(qū)別于野生型的由被敲除基因控制的表型改變。以野生型PH-1作為對照，ΔFGSG_03700敲除突變體的菌落形態(tài)無顯著差異；菌落的生長速度基本與野生型持平；從分生孢子對番茄侵染能力的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二者的侵染面積大致相同，所以FGSG_03700基因的缺失不影響小麥赤霉菌的致病力；敲除突變體的分生孢子形態(tài)沒有變化，但產(chǎn)孢量減少，由此推斷FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關(guān)。

該試驗(yàn)通過對敲除突變體的抗藥性篩選以及3組PCR正負(fù)篩查，最終得到3個FGSG_03700基因的敲除突變體，分別為ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。將敲除突變體和野生型菌株在表型、生長速度、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量和致病力方面進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)敲除突變體ΔFGSG_03700在生長過程中，菌絲的生長速度及形態(tài)與野生型沒有明顯區(qū)別，對以番茄為寄主的侵染能力也沒有下降，分生孢子形態(tài)沒有變化，但產(chǎn)孢量減少。由此推斷FGSG_03700基因可能與小麥赤霉菌分生孢子的生長能力有關(guān)，但該基因的功能尚未完全確定。

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