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    缺鐵孕鼠子代肝臟EPO及EPOR的mRNA表達(dá)及意義

    2018-11-12 06:58:54邱智楓桑璐李佳斯王維劉穩(wěn)馬雅靜
    關(guān)鍵詞:缺鐵缺鐵性貧血

    邱智楓 ,桑璐 ,李佳斯 ,王維 ,劉穩(wěn) ,馬雅靜 *

    (1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2北京懷柔醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 101400;3漣水縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 淮安223400;4石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆 石河子 832000)

    缺鐵被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)最流行的微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥之一,是全世界最常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題。鐵缺乏癥是指機(jī)體對(duì)鐵的需求與供給失衡,導(dǎo)致體內(nèi)儲(chǔ)存鐵耗盡,而紅細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏,最終發(fā)生缺鐵性貧血。全球估計(jì)有3200萬(wàn)孕婦和2.73億5歲以下兒童處于貧血狀態(tài),造成嚴(yán)重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究表明,圍產(chǎn)期死亡率和不良出生結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加與婦女在懷孕期間患缺鐵性貧血有關(guān),25%的子代出生后發(fā)育遲緩可歸因于胎兒生長(zhǎng)受限,而母親孕期貧血是導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限和早產(chǎn)的主要因素[2]。在懷孕期間,胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層必須將母體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒循環(huán)中以滿(mǎn)足胎兒生長(zhǎng)和發(fā)育的鐵要求。孕期缺鐵,胎兒未能從母體中獲取足夠的鐵,使得嬰兒出生后發(fā)生營(yíng)養(yǎng)性缺鐵性貧血及低出生體重、生長(zhǎng)發(fā)育受限。

    促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種分子量為34kDa,在胎兒時(shí)期由肝臟合成,成年后由腎皮質(zhì)小管周?chē)衫w維細(xì)胞合成分泌的糖蛋白[3],是具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物紅系祖細(xì)胞存活、增值、分化的主要激素。在缺鐵導(dǎo)致機(jī)體低氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子可上調(diào)、活化EPO,EPO通過(guò)骨髓紅系祖細(xì)胞上的表面受體 EPOR(erythropoietin receptor,EPOR)介導(dǎo)活性,促進(jìn)紅細(xì)胞生成,從而發(fā)揮其造血功能,有效緩解貧血。哺乳動(dòng)物體內(nèi)80%的鐵參與EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的過(guò)程。

    國(guó)內(nèi)外較少研究EPO及EPOR在缺鐵大鼠子代組織中的表達(dá)情況,因此,本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)缺鐵性孕鼠新生子代肝臟中EPO及EPOR的基因表達(dá),觀察缺鐵性貧血對(duì)大鼠子代鼠肝臟中EPO及受體EPOR的mRNA表達(dá)水平的影響,并探討其變化意義。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

    從新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2013-0001]購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)Wistar雌性大鼠36只及雄性大鼠18只,體重為60±5 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將36只雌性大鼠分為2組,實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠18只,對(duì)照組雌性大鼠18只。造模干預(yù)成功后取其后代仔鼠肝臟組織,置于凍存管中,保存于-80℃冰箱待測(cè)。

    1.2 儀器設(shè)備與試劑

    全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(廣東邁瑞,型號(hào)BC6800)及配套的試劑;鐵染色試劑盒(上海太陽(yáng));動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(北京天根);核糖核酸提取液Trizol(美國(guó) Life);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TaKaRa,RR037A);QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國(guó)QIAGEN);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(中國(guó)泰普,型號(hào)TIB-8000)。

    1.3 方法

    1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

    將36只雌性Wistar大鼠與18只雄性Wistar大鼠置于室溫控制在18-25℃,相對(duì)濕度為40%~60%的動(dòng)物室中飼養(yǎng),并保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜、干凈、通風(fēng)干燥。雌雄分開(kāi)飼養(yǎng),在每個(gè)不銹鋼鼠籠中放置3只大鼠。自由采食普通飼料和去離子水。

    適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將36只雌性大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,18只/組。實(shí)驗(yàn)組飼喂不添加鐵元素配制的飼料,對(duì)照組飼喂添加鐵元素的飼料,喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)缺鐵性貧血。具體配制方法參考呼延武[4]等配方。

    4周后將雌雄大鼠以2∶1合籠,通過(guò)觀察陰栓,確認(rèn)受孕后雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)。母鼠繼續(xù)飼養(yǎng)對(duì)應(yīng)的飼料至分娩。

    1.3.2 大鼠造模期間血常規(guī)測(cè)定

    內(nèi)眥靜脈采血1~2 mL,全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)全血中的血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、紅細(xì)胞比容(hematocrit,HCT)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume,MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width,RDW)等血液學(xué)參數(shù)。

    1.3.3 新生仔鼠形態(tài)觀察

    比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組孕鼠所生每窩仔鼠的個(gè)數(shù)和外觀,包括體型、毛發(fā)、色澤、行動(dòng)力等。

    1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)子代組織EPO、EPOR含量

    取新生仔鼠肝臟組織,按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū),用1 mLTrizol提取液提取50-100 mg組織中RNA。根據(jù)日本TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

    檢測(cè)基因EPO的引物序列參數(shù):上游5‘-CCAGAGCAGGAGAGACTGAGAGA-3’,下游 5‘-CGTCCTTGACTACATAGCGAGTTC-3’,產(chǎn)物大小 101 bp;

    EPOR基因的引物序列參數(shù):上游5‘-CACCTACCTGGTATTGGATGAATG-3’,下游 5‘-ATCCATAGTCGCAGGGTCTACAC-3’,產(chǎn)物大小 97bp;

    內(nèi)參基因GAPDH的引物序列參數(shù):上游5‘-CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3’,下游 5‘-GCCAAATCCGTTCACACCG-3’,產(chǎn)物大小 101 bp。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性 2 min,95℃變性 5 s,60℃退火延伸 10 s,40個(gè)循環(huán)。

    根據(jù)相對(duì)定量分析公式2-△△Ct計(jì)算樣本對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)方法

    用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,若兩組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),否則使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    (1)血液參數(shù)比較:

    造模前,實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠和對(duì)照組雌性大鼠的血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)(HB、HCT、MCV、MCH、RDW)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表 1)。

    表1 造模前兩組雌性大鼠血液學(xué)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of hematological parameters of female rats before modeling

    實(shí)驗(yàn)組經(jīng)造模后,實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠出現(xiàn)缺鐵引起的缺鐵性貧血,與對(duì)照組相比,其血常規(guī)中的HB、HCT、MCV、MCH等指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降,并明顯低于對(duì)照組(P< 0.001),RDW則升高(P<0.001)(表 2)。

    表2 造模后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血液學(xué)參數(shù)比較Tab.2 Comparison of hematological parameters between experimental group and control group after modeling

    (2)新生仔鼠形態(tài)觀察(圖1)

    圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組仔鼠外觀比較Fig.1 Comparison of the appearance of newborn rats between the experimental group and control group

    實(shí)驗(yàn)組孕鼠所生仔鼠窩仔數(shù)少,且仔鼠的體型較小,四肢和軀干皮膚蒼白,動(dòng)作遲緩,新生仔鼠出現(xiàn)缺鐵性貧血癥狀。與實(shí)驗(yàn)組相比,而對(duì)照組大鼠的仔鼠活胎數(shù)和存活數(shù)量較多,存活的仔鼠體型也較大,皮膚和四肢較紅潤(rùn)(表3、圖1)。

    表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每窩仔鼠數(shù)量比較Tab.3 Comparison of the number of littermates in the experimental group and control group

    (3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EPO、EPOR

    如圖2和表4示,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組新生仔鼠肝臟EPO mRNA表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而兩組仔鼠肝臟組織EPOR mRNA表達(dá)沒(méi)有差異(P>0.05)。

    表4 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟中EPO、EPOR表達(dá)水平Tab.4 Detection of the level of EPO and EPOR expressions in neonatal pups liver by real-time quantitative PCR

    圖2 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟中EPO、EPOR表達(dá)Fig.2 Detection of the EPO and EPOR expressions in neonatal pups liver by real-time quantitative PCR

    3 討論

    鐵是人體必須的營(yíng)養(yǎng)素,鐵和卟啉合成血紅素,參與血紅蛋白的合成,還在正常細(xì)胞功能的各方面中都發(fā)揮著重要作用,包括參與線(xiàn)粒體的電子傳遞,調(diào)節(jié)很多細(xì)胞周期調(diào)控分子。鐵的耗竭會(huì)導(dǎo)致DNA合成障礙,細(xì)胞周期從G1期進(jìn)人S期阻滯,細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。

    妊娠期貧血是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題,特別是在亞洲,調(diào)查顯示,全球孕婦貧血患病率為41.8%,超過(guò)5600萬(wàn)婦女受到妊娠期貧血的影響,貧血母親所生的嬰兒即使在出生時(shí)并不貧血,他們出現(xiàn)日后貧血的風(fēng)險(xiǎn)依然較高,中、重度貧血的母親甚至?xí)斐商簩m內(nèi)發(fā)育受限、宮內(nèi)窘迫和早產(chǎn),這可能是由于胎盤(pán)供氧、供血不足導(dǎo)致的[6]。

    胎兒鐵的儲(chǔ)備量依賴(lài)于母體鐵儲(chǔ)備,而且嬰兒期和幼兒期對(duì)鐵的需求量是最大的,但是嬰幼兒時(shí)期的飲食往往缺乏鐵質(zhì),導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)生缺鐵性貧血。本研究成功制備缺鐵性貧血模型,并檢測(cè)EPO及EPOR在缺鐵子代肝臟組織中表達(dá)變化,以探討其在缺鐵新生子代造血方面中的意義。

    (1)低鐵對(duì)血液學(xué)參數(shù)及大鼠生殖機(jī)能的影響。

    體內(nèi)的鐵供應(yīng)不足、吸收過(guò)少或消耗過(guò)多時(shí),可引起鐵缺乏,而鐵缺乏到了一定的程度,機(jī)體無(wú)法正常生產(chǎn)紅細(xì)胞從而出現(xiàn)貧血時(shí),即導(dǎo)致缺鐵性貧血,缺鐵性貧血屬于小細(xì)胞低色素性貧血,會(huì)表現(xiàn)出紅細(xì)胞分布寬度增高,而血紅蛋白、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度均減低的表現(xiàn)[7]。

    大鼠血紅蛋白參數(shù)為 148(120~175)g/L,我們通過(guò)低鐵飼料干預(yù),制造大鼠鐵缺乏模型,實(shí)驗(yàn)組Hb低于大鼠Hb參考值范圍下限,且明顯低于對(duì)照組(P< 0.001)。HCT、MCV、MCH 等指標(biāo)出現(xiàn)不同程度的下降,而RDW升高,大鼠缺鐵性貧血模型制備成功。孕婦缺鐵性貧血可導(dǎo)致早產(chǎn)兒增加、胎兒低出生體重,小兒會(huì)生長(zhǎng)發(fā)育障礙,智力發(fā)育障礙[8]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組孕鼠所生仔鼠數(shù)量少,且仔鼠體型小,四肢和軀干皮膚蒼白,動(dòng)作遲緩,出現(xiàn)缺鐵性貧血癥狀,與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

    (2)EPO在缺鐵仔鼠肝臟中的表達(dá)及其作用。EPO是在機(jī)體缺鐵導(dǎo)致缺氧時(shí),胎兒時(shí)期由肝臟產(chǎn)生,成人時(shí)期由腎臟產(chǎn)生的,在血漿中循環(huán)并與紅系祖細(xì)胞上大量表達(dá)的EPO受體結(jié)合,從而促進(jìn)紅細(xì)胞前體的存活、增殖和終末分化,導(dǎo)致紅細(xì)胞增加,血液的攜氧能力增強(qiáng),增加組織氧張力,從而完成反饋調(diào)節(jié),抑制EPO的進(jìn)一步表達(dá)。

    蔣斕[9]研究中,低鐵仔鼠肝臟EPO表達(dá)呈增加趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而本研究中缺鐵仔鼠肝臟EPO水平顯著升高(P<0.01),可能與母鼠缺鐵程度有關(guān),本研究低鐵干預(yù)時(shí)間較早,由于母鼠貧血程度較嚴(yán)重,血液中攜氧能力下降,子宮肌層缺血、缺氧,氧氣供應(yīng)中斷或貧血低氧條件下,未能滿(mǎn)足胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的要求,造成宮內(nèi)缺氧。

    缺氧時(shí)EPO不能通過(guò)胎盤(pán),胎兒體內(nèi)EPO主要由肝臟合成,因?yàn)榧铀傺t蛋白合成需要增加鐵量,胎兒鐵優(yōu)先從胎兒組織庫(kù)轉(zhuǎn)移到紅細(xì)胞產(chǎn)生中,以增加紅細(xì)胞的數(shù)量,從而增加攜氧能力[10],這可能是本研究中新生仔鼠肝臟EPO表達(dá)升高的原因。

    曾報(bào)道EPO在造血系統(tǒng)以外的功能,包括脂肪堆積和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的代謝調(diào)節(jié)。Dey等[11]曾報(bào)道,高劑量的EPO在增加紅細(xì)胞壓積的同時(shí),還減輕小鼠體重、脂肪堆積,減少食物攝入量并增加能量消耗,而在非造血組織中敲除EPOR后,小鼠變得肥胖并且能量消耗下降。他們還認(rèn)為EPO可以通過(guò)控制基底細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)垂體前葉的ACTH分泌,增加下丘腦POMC,減少食物攝入量和脂肪量積累,從而減輕體重,這表明EPO在下丘腦-垂體軸上的作用可以維持全身代謝穩(wěn)態(tài)。

    另外,慢性缺氧會(huì)導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)下降,國(guó)外研究了小鼠高海拔和低海拔狀態(tài)下,主要營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、EPOR和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在合胞體微絨毛和基底膜部分的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)孕婦血液合胞體微絨毛中EPO濃度和EPOR密度都增加了,但是在高海拔導(dǎo)致的慢性缺氧孕婦中,合胞體微絨毛中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的密度降低了,因此,慢性缺氧可能通過(guò)減少氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到胎兒來(lái)減少胎兒生長(zhǎng)[12]。

    本研究中,實(shí)驗(yàn)組仔鼠的個(gè)體較小,體重較輕,可能與升高的EPO調(diào)節(jié)下丘腦垂體軸以及代謝有關(guān)。

    (3)EPOR在低鐵仔鼠肝臟的表達(dá)。

    EPOR作為同型二聚體存在于紅細(xì)胞祖細(xì)胞表面,在與EPO結(jié)合時(shí),受體發(fā)生構(gòu)象變化,使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域緊密貼合,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的啟動(dòng),進(jìn)行交叉磷酸化,從而發(fā)揮造血作用[13]。EPO受體在紅系祖細(xì)胞之外廣泛表達(dá),在腦、心臟和腎臟中發(fā)揮非造血作用。

    本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)新生仔鼠肝臟EPOR mRNA的表達(dá)情況,證實(shí)了EPOR也表達(dá)于新生仔鼠肝臟中,這是國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道的。

    張志敏[14]等發(fā)現(xiàn),制造宮內(nèi)窘迫母鼠模型,其新生大鼠在生后腦組織EPO和EPOR在2h內(nèi)迅速增加,而且EPOR可持續(xù)高表達(dá)數(shù)天。而本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠缺鐵后其新生仔鼠肝臟EPOR表達(dá)未見(jiàn)增加,這是由于缺血缺氧后,各部位組織中EPOR的表達(dá)水平可能存在一定程度的差異,隨著妊娠期進(jìn)展,胎兒肝臟EPOR基因表達(dá)水平逐步降低[15]。

    機(jī)體內(nèi)哪些細(xì)胞表達(dá)EPOR,以及EPOR是否隨著發(fā)育而變化,尚需進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)語(yǔ)

    (1)母親孕期缺鐵性貧血容易導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限,缺血缺氧,并且胎兒在出生后出現(xiàn)缺鐵癥狀,表現(xiàn)為皮膚蒼白,體重較輕,行動(dòng)遲緩。

    (2)缺鐵子代新生兒體重減輕可能與胎兒肝臟升高的EPO調(diào)控下丘腦激素釋放,減少脂肪堆積和增加能量消耗有關(guān)。

    (3)EPO的代償性升高可釋放到血液從而發(fā)揮其造血功能,有效緩解貧血。

    (4)本研究證實(shí)了新生仔鼠肝臟內(nèi)存在EPOR,而在缺鐵導(dǎo)致缺氧的新生兒個(gè)體中,EPO的作用主要與EPO的數(shù)量的增加有關(guān),而受體EPOR并未發(fā)生顯著改變。

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