β—胡蘿卜素發(fā)酵促進因子篩選及均勻試驗設(shè)計優(yōu)化

楊曄 尹金鳳 李泓全

摘要[目的]提高三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力。[方法]對6種發(fā)酵促進劑的添加濃度及其交互作用進行系統(tǒng)的研究。通過單因素試驗考察確定了各發(fā)酵促進劑的最適添加濃度范圍，在此基礎(chǔ)上，運用均勻設(shè)計對組合配方優(yōu)化。[結(jié)果]當(dāng)發(fā)酵過程中添加0.4 mmol/L MgCl2、20.0 μmol/L H2O2、0.1% Span 20、1.8 %正癸烷、0.2 mmol/L甲酸鈉以及1.1 g/L檸檬酸三鈉時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達到2.27 g/L，較對照組提高了77.30%。[結(jié)論]經(jīng)過優(yōu)化后的發(fā)酵促進劑組合配方能夠顯著提高三孢布拉霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力。

關(guān)鍵詞β-胡蘿卜素；發(fā)酵促進劑；單因素試驗；均勻試驗設(shè)計

中圖分類號TS201.3文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0077-03

Abstract[Objective] In order to improve the fermentative production of βcarotene by Blakeslea trispora.[Method] The dosage concentration and interactions of 6 fermentation accelerants were studied.Firstly，using single factor experiments to study the effective concentration range of fermentation accelerants.Then on this basis，by using uniform experiment to optimize the fermentation culture.[Result] The optimal fermentation accelerant formula was composed of 0.4 mmol/L MgCl2，20.0 μmol/L H2O2，0.1% Span 20，1.8% ndecane，0.2 mmol/L sodium formate and 1.1 g/L trisodium citrate.The βcarotene production was up to 2.27 g/L，77.30% higher than that of control group.[Conclusion] The optimized fermentation accelerants could significantly improve the βcarotene production.

Key wordsβcarotene；Fermentation accelerant；Single factor experiment；Uniform experimental design

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素的一種，是高度不飽和的萜類化合物。該化合物具有優(yōu)良的抗氧化特性，較強的著色性能，并可以作為維生素A的前體，在食品和飼料添加劑、化妝品、營養(yǎng)保健品及醫(yī)藥等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前市場上β-胡蘿卜素主要來源于化學(xué)合成，但由于存在有害物質(zhì)殘留等問題，限制了其應(yīng)用。天然β-胡蘿卜素由于其良好的生理活性、更好的食藥安全性以及較高的生物利用度，因而具有極其廣闊的發(fā)展空間[2]。其中，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素，由于其生產(chǎn)過程經(jīng)濟性以及不易受外界環(huán)境約束等優(yōu)勢，因而成為大規(guī)模制備天然β-胡蘿卜素的主要手段[3-4]。

三孢布拉霉作為天然β-胡蘿卜素的主要生產(chǎn)菌株，其發(fā)酵生產(chǎn)工藝改進一直是目前研究的熱點[5]。β-胡蘿卜素為次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)能依賴于三孢布拉霉菌體的大量繁殖和體內(nèi)積累。筆者通過加入一些發(fā)酵促進劑來改善三孢布拉霉的發(fā)酵產(chǎn)能，通過調(diào)控生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而達到提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的目的。首先選取部分發(fā)酵促進劑進行單因素考察，在此基礎(chǔ)上，通過均勻設(shè)計對發(fā)酵促進因子的組合使用濃度進行了優(yōu)化，得到發(fā)酵促進劑的最佳配方組合。

1材料與方法

1.1材料三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正菌SRICI-H5-30和負菌SRICI -H6-1，上?；ぱ芯吭壕N室保存。β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，百靈威科技有限公司；叔丁基-4-羥基茴香醚（98%，B103750），上海晶純生化科技股份有限公司；其余化學(xué)試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基組分為玉米粉80.0 g/L，黃豆餅粉28.0 g/L。

發(fā)酵液培養(yǎng)基組分為玉米淀粉80.0 g/L，黃豆餅粉16.0 g/L，酵母膏2.0 g/L，異煙肼0.4 g/L，KH2PO4 0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.3 g/L，Triton 1.2 g/L，煤油2.4%，玉米油 6.6%。

補液培養(yǎng)基組分為蔗糖200.0 g/L，蛋白胨4.2 g/L，酵母膏2.0 g/L，MgCl2 1.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，KCl 1.0 g/L，叔丁基-4-羥基茴香醚0.3 g/L。誘導(dǎo)劑為溶解于煤油的β-紫羅蘭酮溶液（8.1%，V/V）。

1.3培養(yǎng)條件按照文獻[6]所述方法，將三孢布拉霉菌正、負菌孢子接種至種子培養(yǎng)基，并于27 ℃、230 r/min培養(yǎng)24 h。隨后以10%（V/V）接種量將種子液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于27 ℃、230 r/min培養(yǎng)120 h。當(dāng)發(fā)酵至51 h時，添加補液2.5 mL，并添加β-紫羅蘭酮誘導(dǎo)劑1.0 mL；發(fā)酵至96 h時，添加補液2.5 mL。

1.4β-胡蘿卜素提取及測定三孢布拉氏霉β-胡蘿卜素的提取和含量分析按照文獻[6]所述方法進行。

1.5發(fā)酵促進劑單因素考察該研究所考察的各類發(fā)酵促進因子，除表面活性劑類化合物Span 20按照一定濃度預(yù)先添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，其余發(fā)酵促進劑MgCl2、H2O2、正癸烷、甲酸鈉、檸檬酸三鈉按照所需濃度配制成溶液并以等體積溶媒為對照，于51 h添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察不同濃度的發(fā)酵促進劑對發(fā)酵產(chǎn)量的影響。具體發(fā)酵促進劑單因素試驗水平如下：Span 20，0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%；MgCl2，0、0.30、0.60、0.90、1.10 mmol/L；H2O2，0、30、90、150、300 μmol/L；正癸烷，0、0.6%、1.2%、1.8%、2.7%、3.6%；甲酸鈉0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 mmol/L；檸檬酸三鈉0、0.45、0.75、1.20、1.60、2.00 g/L。

1.6發(fā)酵促進劑均勻設(shè)計試驗根據(jù)單因素試驗所篩選的各發(fā)酵促進劑最優(yōu)添加濃度，按照6因素12水平U*12（1210）進行均勻試驗設(shè)計，考察6種發(fā)酵促進劑對三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的協(xié)同作用。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵促進劑的單因素篩選及其對β-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)能的影響該研究前期工作從表面活性劑、金屬離子、氧載體、烷烴類、有機酸和中間代謝產(chǎn)物6類35個化合物中篩選得到6個對三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素具有促進作用的發(fā)酵促進因子，分別為Span 20、MgCl2、H2O2、正癸烷、甲酸鈉、檸檬酸三鈉。對6種發(fā)酵促進劑進行單因素考察，確定最適添加濃度。

2.1.1Span 20對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。由圖1可知，添加Span 20對β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有一定的影響。少量添加Span 20對其產(chǎn)量有少量提升作用，而且Span 20的添加極大地減少了發(fā)酵液中的泡沫產(chǎn)生，有利于放大試驗發(fā)酵。當(dāng)添加量大于0.1%之后，β-胡蘿卜素的含量出現(xiàn)了顯著下降。這可能是由于發(fā)酵液中已經(jīng)含有1.2 g/L 的表面活性劑Triton，大量的表面活性劑對微生物菌體具有一定的毒性，從而影響的β-胡蘿卜素的生物合成[7]。

2.1.2MgCl2對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。發(fā)酵進行51 h時，向發(fā)酵液中分別添加不同濃度的MgCl2，β-胡蘿卜素含量有較大提高。由圖2可以看出，當(dāng)MgCl2的濃度達到0.6 mmol/L時，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達到最大為1.382 g/L，比對照組提高了18%。超過此濃度，對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的進一步提高并不明顯。

2.1.3H2O2對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。三孢布拉霉作為嚴格好氧菌株，在發(fā)酵過程中需要大量的氧氣，添加一定量的H2O2對β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有一定促進作用。從圖3可知，在H2O2濃度為30 μmol/L時β-胡蘿卜素的含量達到最大為1.34 g/L，超過此濃度后，β-胡蘿卜素含量出現(xiàn)下降。這可能是由于過量的H2O2對細胞產(chǎn)生過氧化作用，破壞了細胞膜，進而影響了細胞的代謝能力。

2.1.4正癸烷對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。從圖4中可以看出，隨著正癸烷濃度的增加，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也隨著提高，當(dāng)正癸烷濃度為1.8%時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達到1.908 g/L，比對照組提高了67.8%。這可能是由于正癸烷的添加使發(fā)酵液形成了一種雙液相發(fā)酵系統(tǒng)[8]，提高了發(fā)酵液的溶氧能力，改善了傳質(zhì)性能，大大地促進了三孢布拉霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力。

2.1.5甲酸鈉對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。從圖5中可以看出，隨著甲酸鈉濃度的增加，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。當(dāng)甲酸鈉濃度為0.8 mmol/L時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達到1.721 g/L，隨后逐漸趨緩，當(dāng)甲酸鈉濃度為1.6 mmol/L時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大，為1.732 g/L，與對照組相比β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了7.70%。繼續(xù)提高甲酸鈉的濃度，β-胡蘿卜素產(chǎn)量出現(xiàn)下降，說明高濃度的甲酸鈉不利于三孢布拉霉菌體合成β-胡蘿卜素。

2.1.6檸檬酸三鈉對發(fā)酵產(chǎn)能的影響。從圖6中可以看出，隨著檸檬酸三鈉濃度的增加，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，當(dāng)檸檬酸三鈉濃度為0.75 g//L時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達到最高為1.682 g/L，三羧酸循環(huán)中部分中間代謝產(chǎn)物可以為β-胡蘿卜素的合成提供碳骨架結(jié)構(gòu)，也可以促進三孢布拉霉菌的生長及產(chǎn)色素的過程。繼續(xù)提高檸檬酸三鈉的濃度，β-胡蘿卜素產(chǎn)量出現(xiàn)顯著下降，高濃度的檸檬酸三鈉不利于三孢布拉霉菌體合成β-胡蘿卜素。

由圖1～6分析可知，6種化合物對三孢布拉氏霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素都具有一定促進作用，其中正癸烷促進效果最佳。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基添加1.8%的正癸烷時，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高67.80%。烷烴作為氧載體可有效促進發(fā)酵液的溶氧水平，繼而有效提高三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的能力。

2.2均勻試驗設(shè)計優(yōu)化β-胡蘿卜素發(fā)酵促進因子根據(jù)上述6種發(fā)酵促進劑對β-胡蘿卜素發(fā)酵水平單因素考察試驗結(jié)果，按照6因素12水平U*12（1210）進行均勻試驗設(shè)計，其中各促進劑試驗水平詳見表2所示。

對表2直觀分析可以看出，對照組發(fā)酵產(chǎn)量1.28 g/L，4號和5號試驗組發(fā)酵結(jié)果低于對照組，9號試驗組的配方所得的產(chǎn)量最高，達到2.27 g/L比對照組提高約77.30%。9號發(fā)酵促進劑配方如下：0.1% Span 20、0.4 mmol/L MgCl2、20.0 μmol/L H2O2、1.8%正癸烷、0.2 mmol/L甲酸鈉、1.1 g/L檸檬酸三鈉。

3結(jié)論

通過合理的試驗設(shè)計，考察6種發(fā)酵促進因子對三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，首先對每種發(fā)酵促進劑進行單因素考察，其最優(yōu)結(jié)果為：0.1% Span 20、0.6 mmol/L MgCl2、30 μmol/L H2O2、1.8%正癸烷、1.6 mmol/L甲酸三鈉、0.75 g/L檸檬酸三鈉。其中正癸烷的添加使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了67.80%。隨后采用均勻試驗設(shè)計，對6種發(fā)酵促進劑的交互作用進行考察，當(dāng)MgCl2的添加量為0.4 mmol/L、H2O2為20.0 μmol/L、Span 20為0.1%、正癸烷為1.8 g/L、甲酸鈉為0.2 mmol/L、檸檬酸三鈉為1.1 g/L時，可使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量高達2.27 g/L，較對照組產(chǎn)量1.25 g/L提高了77.30%。添加優(yōu)化后的發(fā)酵促進劑組合配方能顯著地提高三孢布拉霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力。

參考文獻

[1] AKSU Z，EREN A T.Production of carotenoids by the isolated yeast of Rhodotorula glutinis[J].Biochemical engineering journal，2007，35（2）：107-113.

[2] MALDONADE I R，RODRIGUEZAMAYA D B，SCAMPARINI A R P.Carotenoids of yeasts isolated from the Brazilian ecosystem[J].Food chemistry，2008，107（1）：145-150.

[3] NELIS H J，DE LEENHEER A P.Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds[J].Journal of applied microbiology，2008，70（3）：181-191.

[4] FINKELSTEIN M，HUANG C C，BYNG G S，et al.Blakeslea trispora mated culture capable of increased betacarotene production：US5422247 A[P].1993-11-19.

[5] 尹金鳳，王志軒，吳欣森，等.三孢布拉氏霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究進展[J].食品科學(xué)，2014，35（13）：316-325.

[6] DONG H W，LI H Q，XU D G，et al.Highthroughput extraction of βcarotene from Blakeslea trispora based on a newly developed setup[J].Biotechnology and applied biochemistry，2014，61（4）：446-452.

[7] 劉海麗，余曉斌.表面活性劑和抗氧化劑對三孢布拉霉合成β-胡蘿卜素的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（2）：97-101.

[8] 王歲樓，吳曉宗，陳德經(jīng)，等.金屬離子和氧載體對紅酵母NR06胡蘿卜素發(fā)酵的影響[J].食品科技，2008，33（1）：5-8.