蕎麥酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化及其發(fā)酵前后活性成分變化

徐 斌

王 丹1，2

張 嵐1，2

樸春紅3

宋春梅1，2

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013；2. 吉林省中醫(yī)藥管理局二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

蕎麥酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化及其發(fā)酵前后活性成分變化

徐 斌1，2

王 丹1，2

張 嵐1，2

樸春紅3

宋春梅1，2

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013；2. 吉林省中醫(yī)藥管理局二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

研究酵母發(fā)酵蕎麥的最佳工藝參數(shù)，為開(kāi)發(fā)蕎麥保健發(fā)酵食品提供參考依據(jù)。以蕎麥為原料，采用安琪酵母發(fā)酵，以總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)加水量、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵工藝。其最佳發(fā)酵條件為：加水量75%，發(fā)酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發(fā)酵時(shí)間6 h，總黃酮含量由發(fā)酵前的4.895 mg/g升高到5.314 mg/g；槲皮素含量從發(fā)酵前的1.468 mg/g下降為1.099 mg/g。

蕎麥；發(fā)酵；總黃酮；槲皮素

蕎麥(buckwheat)俗稱甜麥，系蓼科蕎麥屬植物，與其他禾谷類糧食作物相比，蕎麥不僅含有豐富的脂肪、維生素、膳食纖維、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有其他糧食作物所沒(méi)有的黃酮類、多酚類化合物等，具有藥食兩用價(jià)值[1-2]。其中黃酮類化合物是蕎麥最為重要的生物活性物質(zhì)之一，賦予蕎麥多種生理功能，例如降血糖、降尿糖、降血脂、防便秘等功效[3]。黃酮類化合物(flavonoids)亦稱生物類黃酮，主要成分有蘆丁、槲皮素、山柰酚等。發(fā)酵食品是指利用對(duì)人體有益的微生物加工制作而成的一類食品[4]，將食品發(fā)酵不但可以提高原產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還可以有效改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增加其穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)發(fā)酵可使蕎麥中的復(fù)雜成分在微生物的作用下分解成具有生物活性物質(zhì)的簡(jiǎn)單成分，這樣可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)蕎麥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，另外蕎麥發(fā)酵類食品的研發(fā)也大大促進(jìn)了蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。國(guó)內(nèi)外大多研究集中在蕎麥黃酮類化合物的提取，但對(duì)蕎麥發(fā)酵制品中黃酮類化合物的研究報(bào)道多為營(yíng)養(yǎng)成分定性分析[6]，張英等[7]發(fā)現(xiàn)蕎麥花葉經(jīng)過(guò)發(fā)酵后黃酮含量下降，且可能產(chǎn)生了新物質(zhì)。李靜娟等[8]研究蕎麥面包制作過(guò)程對(duì)蕎麥黃酮的影響，得出發(fā)酵可一定程度地提高蕎麥總黃酮的含量，而焙烤過(guò)程顯著地降低蕎麥總黃酮的含量。近幾年食物發(fā)酵對(duì)植物活性成分的影響引起了人們的關(guān)注，關(guān)于利用酵母發(fā)酵蕎麥，研究黃酮含量的變化鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬利用酵母發(fā)酵蕎麥，以總黃酮為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵條件，并研究黃酮和槲皮素在發(fā)酵過(guò)程中的含量變化，旨在為開(kāi)發(fā)以蕎麥為主要原料、以發(fā)酵為主要生產(chǎn)工藝的食品以及相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥：甜蕎麥，吉林省遼源市；

酵母：安琪酵母股份有限公司；

蘆丁和槲皮素：標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，上海原葉生物有限公司；

亞硝酸鈉、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、丙酮：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：EV311型，美國(guó)萊伯泰科公司；

酶標(biāo)儀：SyNERGYH1/H1M型，美國(guó)伯騰儀器有限公司；

中草藥粉粉碎機(jī)：ZN-500型，長(zhǎng)沙岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；

離心機(jī)：TGL20M-Ⅱ型，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：FA1104N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1800型，上海欣茂儀器有限公司；

超聲振蕩提取器：KQ-100DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

霉菌培養(yǎng)箱：MJP-150型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電熱恒溫干燥箱：202-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥發(fā)酵流程及操作要點(diǎn)

酵母活化

↓

蕎麥→粉碎過(guò)篩→干燥→加入酵母液→混勻制團(tuán)→發(fā)酵

(1) 將蕎麥去除雜質(zhì)，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎并過(guò)40目篩，于干燥箱中在60 ℃烘干至恒重，備用。

(2) 酵母使用前，應(yīng)加入一定量30 ℃左右蒸餾水進(jìn)行活化。之后加入蕎麥粉，混合均勻并揉成均勻的蕎麥面團(tuán)。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[8]和[9]，分別對(duì)加水量、發(fā)酵溫度、接菌量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，3次重復(fù)，考察各個(gè)因素對(duì)酵母發(fā)酵蕎麥后其中黃酮含量的影響。

(1) 加水量：接菌量為0.5%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8 h，將加水量(占蕎麥質(zhì)量百分比)分別設(shè)定為70%，75%，80%，85%，90%進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳加水量。

(2) 發(fā)酵溫度：加水量為80%，接菌量為0.5%，發(fā)酵時(shí)間為8 h，將發(fā)酵溫度分別設(shè)定為24，26，28，30，32 ℃進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

(3) 接菌量：加水量為80%，發(fā)酵時(shí)間為8 h，發(fā)酵溫度為30 ℃，將接菌量分別設(shè)定為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳接菌量。

(4) 發(fā)酵時(shí)間：接菌量為0.5%，發(fā)酵溫度為30 ℃，加水量為80%，將發(fā)酵時(shí)間分別分別設(shè)定為2，4，6，8，10，12 h進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵蕎麥中黃酮含量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以加水量﹑發(fā)酵溫度﹑接菌量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)條件為考察因素，進(jìn)行三水平四因素正交試驗(yàn)，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定

(1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.011 7 g，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容，得到234 g/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，1.00，1.50 mL于試管中，補(bǔ)加95%乙醇至1.5 mL，搖勻，然后加入0.25 mL 4% NaNO2溶液，靜置6 min，再加入0.25 mL 10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，最后加入1.5 mL 4% NaOH溶液，混勻。分別取200 mL于96孔板上，用酶標(biāo)儀在可見(jiàn)光波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值并記錄。以蘆丁濃度(g/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=0.006 5X-0.007，R2=0.999 2。

(2) 樣品中總黃酮提取及含量測(cè)定：取0.5 g蕎麥樣品于15 mL離心管中，加入15 mL酸性丙酮溶液(丙酮∶蒸餾水∶乙酸=70∶29.5∶0.5，體積比)，密封，并放置在恒溫震蕩培養(yǎng)箱上，在20 ℃、200 r/min的條件下震蕩4 h(對(duì)蕎麥中黃酮成分進(jìn)行提取)，震蕩結(jié)束后，將蕎麥提取液在黑暗條件下靜置12 h(對(duì)蕎麥中成分繼續(xù)進(jìn)行提取)，之后在10 000 r/min條件下離心10 min，得到上清液。準(zhǔn)確移取0.5 mL待測(cè)液按1.3.4(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量。3次重復(fù)試驗(yàn)。按式(1)計(jì)算蕎麥總黃酮含量[10-11]。

(1)

式中：

X——蕎麥中總黃酮的含量，mg/g；

A1——樣品管吸光度；

A0——空白管吸光度；

V總——樣品管體積，mL；

V1——吸取供試液體積，mL；

V2——樣品供試液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 槲皮素含量測(cè)定

(1) 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品4.92 mg，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容至50 mL，所得濃度為 9.84 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。準(zhǔn)確吸取上述槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于10 mL比色管中，加入60%乙醇溶解，定容至刻度。采用紫外分光光度法在370 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，以槲皮素(g/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=0.034 92X+0.001 4，R2=0.993 2。

(2) 樣品中槲皮素提取及含量測(cè)定：稱取蕎麥樣品1 g于錐形瓶中，加80%乙醇25 mL溶解，超聲振蕩提取(50 ℃，30 min，100 W)，并在真空泵中抽濾，加少量體積分?jǐn)?shù)80%乙醇清洗濾渣后過(guò)濾，重復(fù)2次，合并濾液，得到濾液后倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用60%乙醇定容至100 mL。準(zhǔn)確移取待測(cè)液0.5 mL于10 mL比色管中，按1.3.5(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法依次加入各種試劑，以試劑空白做參比，按式(2)計(jì)算蕎麥槲皮素含量[12]。

(2)

式中：

X——樣品中槲皮素的含量，mg/g；

C——樣品管槲皮素濃度濃度，g/mL；

V總——樣品管體積，mL；

V1——吸取供試液體積，mL；

V2——樣品供試液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 加水量的選擇 由圖1可知，發(fā)酵蕎麥中總黃酮的含量隨著加水量的增加先增加后降低，當(dāng)加水量小于80%時(shí)，蕎麥總黃酮含量隨著加水量的增加而增加；當(dāng)加水量大于80%時(shí)，蕎麥總黃酮含量隨著加水量的增加呈先下降后增加趨勢(shì)；當(dāng)含水量達(dá)到90%時(shí)，蕎麥總黃酮含量達(dá)到最大。這表明隨著加水量的增加，蕎麥在發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量增加，但當(dāng)加水量達(dá)到一定量時(shí)，可能影響了酵母繁殖，影響了蕎麥發(fā)酵,使黃酮含量降低。在試驗(yàn)過(guò)程中當(dāng)加水量大于80%時(shí)，蕎麥面成團(tuán)性較差，因此加水量取80%左右為宜。

2.1.2 發(fā)酵溫度的選擇 由圖2可知，蕎麥總黃酮的含量隨著發(fā)酵溫度的上升先增加后降低，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大。溫度過(guò)低或過(guò)高，都會(huì)影響酵母活力，因此發(fā)酵溫度取30 ℃左右為宜。

圖1 加水量對(duì)總黃酮含量的影響Figure 1 Effect of water addition to content of total flavonoids

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮含量的影響Figure 2 Effect offermentation temperature to content of total flavonoids

2.1.3 接菌量的選擇 由圖3可知，蕎麥總黃酮的含量隨著接菌量的增加呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在該趨勢(shì)中，當(dāng)接菌量為0.6%時(shí)，蕎麥總黃酮含量達(dá)到最大。當(dāng)接菌量達(dá)到一定比例時(shí)，酵母菌利用蕎麥程度較高，使蕎麥中黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化程度增加，但是當(dāng)接菌量較高時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)可能會(huì)受到抑制，而且對(duì)蕎麥的利用也會(huì)降低，另外考慮生產(chǎn)成本，確定接菌量取0.6%左右為宜。

圖3 接菌量對(duì)總黃酮含量的影響Figure 3 Effect of inoculation quantity to content of total flavonoids

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的選擇 由圖4可知，蕎麥總黃酮的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在該趨勢(shì)中，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 h時(shí)，蕎麥總黃酮含量達(dá)到最大。發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，酵母利用蕎麥可能會(huì)產(chǎn)生其他酵母代謝產(chǎn)物，黃酮類物質(zhì)也可能隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)化成其他活性成分。因此發(fā)酵時(shí)間取4 h左右為宜。

2.2 正交試驗(yàn)

三水平四因素正交試驗(yàn)因素水平取值見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Figure 4 Effect offermentation time to content of total flavonoids表1 因素水平表Table 1 Factor level of experiment

水平A加水量/%B發(fā)酵溫度/℃C接菌量/%D時(shí)間/h175280.52280300.64385320.76

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal test

由表2可知，酵母發(fā)酵的最佳組合是A1B3C3D3，由于理論計(jì)算的最佳組合是A1B3C1D3，需要做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在該條件下蕎麥總黃酮的含量為3.560 mg/g，確定A1B3C1D3為最優(yōu)組合。蕎麥發(fā)酵的最佳工藝條件為：加水量75%，發(fā)酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發(fā)酵時(shí)間6 h。總黃酮的含量為3.560 mg/g。通過(guò)極差R可以看出，各因素對(duì)蕎麥總黃酮含量變化的影響作用順序?yàn)椋航泳?發(fā)酵時(shí)間>加水量>發(fā)酵溫度。

2.3 發(fā)酵前后總黃酮、槲皮素含量的變化

黃酮類化合物是蕎麥中最重要的生物活性物質(zhì)。由圖5可知，發(fā)酵后蕎麥面團(tuán)中總黃酮含量呈增加趨勢(shì)。李蒙蒙等[5]研究不同酵母(果酒酵母、葡萄酒酵母、異常漢遜酵母)發(fā)酵對(duì)蕎麥營(yíng)養(yǎng)成分影響，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵蕎麥發(fā)現(xiàn)3株菌能顯著提高蕎麥中總多酚和總黃酮含量，且顯著降低還原糖含量。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[13]表明，蕎麥飼喂高脂膳食大鼠，可使其血清SOD、GSH-PX的活性增強(qiáng)及MDA的含量顯著減少；可使其肝臟中SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA的含量顯著減少，表明蕎麥具有調(diào)節(jié)高脂膳食大鼠抗氧化的能力。李蒙蒙等[5]的研究報(bào)道提出酵母能夠顯著提升蕎麥的抗氧化特性，且發(fā)酵蕎麥提取物的抗氧化活性與總黃酮成分含量呈相關(guān)性。因此，發(fā)酵蕎麥相對(duì)未發(fā)酵蕎麥具有更好的營(yíng)養(yǎng)保健功能。由圖5還可以看出，發(fā)酵后槲皮素含量略有降低。李家華等[14]曾報(bào)道普洱茶發(fā)酵過(guò)程中槲皮素的含量一直呈下降趨勢(shì)，并推測(cè)可能是在發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生的糖苷酶水解生成槲皮素類之外的某些游離態(tài)黃酮醇苷元所致。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物[15]，經(jīng)過(guò)酵母發(fā)酵后，槲皮素也可能轉(zhuǎn)化成其他類黃酮類物質(zhì)。

圖5 蕎麥發(fā)酵前后其活性成分變化Figure 5 Change of active ingredients in buckwheat before and after fermentation

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了酵母發(fā)酵蕎麥的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)比發(fā)酵前后活性物質(zhì)變化。結(jié)明表明，其最佳發(fā)酵條件為：加水量75%，發(fā)酵溫度32 ℃，接菌量0.5%，發(fā)酵時(shí)間6 h；發(fā)酵后槲皮素含量略有降低，總黃酮含量升高。蕎麥經(jīng)過(guò)發(fā)酵后其中脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)等復(fù)雜成分在微生物作用下可產(chǎn)生醇類、核酸類、有機(jī)酸類、氨基酸類等具有生物活性物質(zhì)，有利于人類對(duì)蕎麥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并改善蕎麥制品的品質(zhì)。本研究結(jié)果對(duì)研制蕎麥發(fā)酵食品[16]、促進(jìn)蕎麥的有效利用及促進(jìn)人體健康具有借鑒意義。

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Optimization on buckwheat fermentation process by Yeast and changes of active ingredient before and after fermentation

XUBin1,2

WANGDan1,2

ZHANGLan1,2

PIAOChun-hong3

SONGChun-mei1,2

(1.DepartmentofPublicandHealth,JilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China; 2.LeverTwoLaboratoryofAdministrationofTraditionalChineseMedicineofJilinProvince,Jilin,Jilin132013,China;3.InstituteofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

To research the best optimum parameters of yeast fermentation, provides reference for the development of buckwheat health fermented food. Buckwheat was selected as raw material, which was fermented by AnQi yeast, and the total content of flavonoids was chosed as the evaluation indexes. Through the single factor test and orthogonal test, including water addition, fermentation temperature, inoculation quantity and fermentation time, the optimal fermentation technology was gotten. The optimal fermentation conditions were: water addition 75%, fermentation temperature 32 ℃, inoculation quantity 0.5%, and fermentation time 6 h. Under the conditions, the total flavonoids content was from 4.895 mg/g to 5.314 mg/g, while, the quercetin content decreased from 1.468 mg/g to 1.099 mg/g.

Buckwheat; fermentation; total flavonoids; quercetin

吉林省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：20160519013JH)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究(編號(hào)：吉教科合字[2016]第240號(hào))；吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：20150520133JH)；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)：吉教科合字[2016]第239號(hào))

徐斌(1972—)，男，吉林醫(yī)藥學(xué)院副教授，碩士。 E-mail:xb-jl@163.com

2017—04—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.039