• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    電化學(xué)法測量黑曲霉孢子萌發(fā)過程中葡萄糖氧化酶的活性

    2017-07-05 13:24:12劉洋汝
    食品與機(jī)械 2017年5期
    關(guān)鍵詞:葡萄糖氧化酶黑曲霉伏安

    劉洋汝

    李忠海1,2

    任佳麗1, 2

    (1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室,湖南 長沙 410004)

    電化學(xué)法測量黑曲霉孢子萌發(fā)過程中葡萄糖氧化酶的活性

    劉洋汝1

    李忠海1,2

    任佳麗1, 2

    (1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室,湖南 長沙 410004)

    建立了電化學(xué)循環(huán)伏安法測定葡萄糖氧化酶活性的方法。該方法引入二茂鐵甲醇作為氧化還原探針,以玻碳電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉑絲電極作為輔助電極,采用循環(huán)伏安法,得到不同酶活的峰電流值,在酶濃度為0.128~2.377 U/mL,酶濃度與峰電流之間存在線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.998,檢測下限為0.128 U/mL。運(yùn)用該法測定了孢子萌發(fā)過程中酶活的變化,隨著孢子的萌發(fā),酶活先增加,達(dá)到最大值(2.130 U/mL)后再次下降,同時采用傳統(tǒng)滴定法進(jìn)行對照。結(jié)果表明,相較于傳統(tǒng)方法,電化學(xué)方法具有準(zhǔn)確、快速和簡便的特點。

    孢子;萌發(fā);葡萄糖氧化酶;循環(huán)伏安法

    葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)是一種需氧脫氫酶,能高度專一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫,在食品、畜牧以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前工業(yè)中生產(chǎn)葡萄糖氧化酶常采用黑曲酶整菌發(fā)酵法[3],該方法生產(chǎn)的游離GOD存在穩(wěn)定性差、易變性失活、酶與底物難以分離等缺陷,不利于產(chǎn)物的回收與連續(xù)生產(chǎn)[4-5]。S. Ramachandran等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉孢子是一個葡萄糖氧化酶的貯存庫,并通過檸檬醛透化孢子膜,抑制孢子萌發(fā),使孢子催化活力增長到1.500~4.350 g/(L·h)。Moksia等[8]證明黑曲霉孢子具有一個充滿活力的酶催化體系,孢子本身也可以起到良好的酶固定作用,可作為GOD生物催化劑進(jìn)行開發(fā)。目前,對于黑曲霉孢子的研究主要集中在發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸能力[6-10],然而黑曲霉孢子在哪個階段的葡萄糖氧化酶酶活力最強(qiáng),尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。

    目前,國內(nèi)外檢測葡萄糖氧化酶酶活力主要采用滴定法和分光光度法,但是這兩種方法測量精度低,操作繁瑣,耗時較長。電化學(xué)方法具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、操作簡便等優(yōu)勢,是研究生物化學(xué)和生物活動的一種新方法。由于酶在電極表面的取向往往不利于其電活性基團(tuán)與電極之間的電子交換,與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移受到阻礙,通過電化學(xué)檢測酶活力歷來是一個令人困擾的問題。本試驗擬以二茂鐵甲醇(Ferrocene methanol,F(xiàn)c)為氧化還原介質(zhì),介導(dǎo)酶與電極間的電子傳遞,玻碳電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為輔助電極,掃描得到循環(huán)伏安曲線,然后將獲得的陽極峰電流與酶濃度進(jìn)行線性回歸,以期實現(xiàn)對葡萄糖氧化酶活力的檢測。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    黑曲霉 (Aspergillusniger) NRRL3:美國ATCC公司。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 材料與試劑

    葡萄糖:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    吐溫-80:化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    二茂鐵甲醇:216.060 g/mol, 西格瑪奧德里奇公司;

    葡萄糖氧化酶:228 253 U/g,西格瑪奧德里奇公司;

    檸檬醛:95%,美國西格瑪奧德里奇公司;

    斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基,稱取 200 g馬鈴薯,加水煮爛,紗布過濾,加入15 g瓊脂、20 g葡萄糖,補(bǔ)足水分至 1 000 mL,分裝試管,加塞、包扎,121 ℃滅菌20 min;

    固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:蕎麥種子培養(yǎng)基,稱量300 g 市售蕎麥種子,蒸餾水洗兩次,加等量的蒸餾水沸水浴15 min,過濾,分裝錐形瓶,加塞、包扎,高壓蒸氣滅菌處理,得到50 g水/100 g的蕎麥種子培養(yǎng)基[4]。

    1.2.2 主要儀器設(shè)備

    電化學(xué)工作站:660D型,上海辰華儀器有限公司;

    雙面凈化工作臺:SW-CJ-2F型,蘇州凈化設(shè)備有限公司;

    霉菌培養(yǎng)箱:MJX-150BⅢ型,北京中興偉業(yè)儀器有限公司;

    冷凍離心機(jī):TK25KG型,長沙東旺儀器有限公司;

    生物顯微鏡:BM-1000型,致微儀器有限公司;

    高壓滅菌鍋:GI54DWS型,致微儀器有限公司;

    電熱恒溫水浴鍋:DK-98型,天津市泰斯特儀器有限公司;

    超純水機(jī):LS1-10型,湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 黑曲霉孢子種子液的制備 從冰箱取出凍存黑曲霉孢子液,室溫融化后轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基,置于恒溫箱 28 ℃培養(yǎng)7 d。用含有0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水沖洗斜面,收集孢子懸液至離心管,4 ℃ 10 000×g 離心10 min,棄上清液,收集孢子沉淀。稀釋沉淀,在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù),調(diào)整孢子懸液濃度108spores/mL。

    取1 mL 108spores/mL的孢子懸液于100 g蕎麥種子培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)200 h,然后加入0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水,180 r/min 振搖1 h后,過濾,收集濾液,4 ℃ 10 000×g 離心10 min,棄掉上清液,收集沉淀,確定109spores/mL 濃度的孢子種子液備用。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    (1) 電極預(yù)處理:以玻碳電極( GC,Φ= 2 mm) 為工作電極,用 0. 050 μm氧化鋁兌水打磨拋光至鏡面,依次用無水乙醇、蒸餾水超聲清洗1 min 后,晾干備用。飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極, 鉑絲電極作為輔助電極。

    (2) 酶濃度的測量:往電解池中加入100 μL 4 g/L 葡萄糖溶液,800 μL 1 mmol/L二茂鐵甲醇的0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH=7.0),30 ℃水浴5 min,然后依次加入100 μL濃度為0.000,1.282,5.128,10.256,15.384,23.770 U/mL的葡萄糖氧化酶,設(shè)定電壓范圍0.0~0.5 V,掃速0.1 V/s,作循環(huán)伏安掃描。記錄每一個酶濃度所對應(yīng)的峰電流值,并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得到相應(yīng)的線性回歸方程。

    1.3.3 黑曲霉孢子萌發(fā)觀察 接種1 mL 109spores/mL孢子種子液至含25 mL基本培養(yǎng)基[11]的錐形瓶中,在96孔板上每孔定時加入200 μL 孢子培養(yǎng)液,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。定時取孢子培養(yǎng)液涂布于載玻片,觀察[12-13]并計數(shù)100~200個孢子,以長出的芽管長度達(dá)到2倍原孢子長度為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[14],計算孢子萌發(fā)率,之后每隔2 h 觀察,持續(xù)24 h,觀察黑曲霉孢子萌發(fā)狀況。

    1.3.4 黑曲霉孢子生長過程中的酶活測定 用移液槍吸取1 mL 109spores/mL 孢子種子液于含25 mL 基本培養(yǎng)基的錐形瓶中,在96孔板上每孔分別在0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h加入200 μL 孢子培養(yǎng)液,30 ℃恒溫培養(yǎng),每組3個平行。取對應(yīng)時間的黑曲霉孢子培養(yǎng)液100 μL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測方法進(jìn)行測試,將得到的峰電流值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的線性回歸方程中,計算得到黑曲霉孢子在休眠、萌發(fā)、菌絲生長階段的酶活信息。取適量孢子培養(yǎng)液80 ℃滅活30 min,循環(huán)伏安掃描,作為空白組。

    1.3.5 對比試驗 選用滴定法:取1 mL梯度稀釋酶液加入到已經(jīng)30 ℃恒溫5 min,25 mL含4 g/L葡萄糖的60 mmol/L (pH=5.6)的乙酸鈉緩沖液中。加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH中停止反應(yīng)。將所得混合物通過使用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定,酚酞作為指示劑至暗粉色為終點。所加鹽酸的體積為V??瞻诇y定(孢子溶液不存在)在相同的試驗條件下進(jìn)行。添加的標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積為V0。葡萄糖酸的濃度可由式(1)計算,酶活由式(2)計算,一個酶活單位為在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量。

    (1)

    (2)

    式中:

    C——葡萄糖酸的濃度,μmol/mL;

    E——酶活,μmol/(mL·min);

    N——標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液的摩爾濃度,mol/L;

    V0——空白滴定的標(biāo)準(zhǔn)HCl的體積,mL;

    V——最終滴定鹽酸的體積,mL;

    H——樣品反應(yīng)時間,min。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 葡萄糖氧化酶活性電化學(xué)測定方法的建立

    2.1.1 檢測原理 采用電化學(xué)循環(huán)伏安法檢測葡萄糖氧化酶的反應(yīng)原理[15-16]見式(3)~(6),在一定的電壓下,二茂鐵甲醇(Fc) 發(fā)生氧化反應(yīng)失去一個電子形成Fc+,在有氧化態(tài)葡萄糖氧化酶(GODox)和葡萄糖存在時,GODox氧化葡萄糖產(chǎn)生還原態(tài)葡萄糖氧化酶(GODred)和葡萄糖酸,生成的GODred還原Fc+產(chǎn)生GODox和Fc,重新生成的Fc補(bǔ)充擴(kuò)散到電極表面發(fā)生氧化,從而增加電子傳遞的速度,峰電流增加。

    工作電極表面:

    FcCH2OH-e-=FcCH2OH+。

    自然教育理念提倡讓幼兒在大自然中自然成長,幼兒美術(shù)是最接近自然的教學(xué)內(nèi)容,對提升幼兒成長品質(zhì)具有重要的促進(jìn)作用。美術(shù)教學(xué)中,教師堅持自然教育,讓幼兒在自然氛圍、自然材料、自然互動中,充分的感受美、表現(xiàn)美。幼兒對美術(shù)活動始終保持濃厚的興趣,才能全身心投入到美術(shù)創(chuàng)作中,才能獲得更多的歡樂和笑聲,才能極大實現(xiàn)課堂教學(xué)目標(biāo)。

    (3)

    葡萄糖氧化酶:

    GOxox+glucose→[GOxox+glucose],

    (4)

    [GOxox+glucose]→GOxred+gluconic acid,

    (5)

    GOxred+ FcCH2OH+→ GOxox+FcCH2OH。

    (6)

    2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 不同濃度GOD的循環(huán)伏安曲線見圖1。由圖1可知,隨著GOD濃度的上升,陽極峰電流值在增高。峰電流值與酶濃度呈正比,介質(zhì)濃度增加,電流值上升[17]。以峰電流值對酶濃度作圖(見圖2),得到線性回歸方程:y=0.435x+1.414,相關(guān)系數(shù)為0.998。

    2.1.3 精密度試驗 連續(xù)10次對100 μL 10 U/mL的葡萄糖氧化酶樣品進(jìn)行測定,結(jié)果見表1。由表1可知,精密度試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.031%,表明該檢測葡萄糖氧化酶活力的方法有較好的精確性。

    2.1.4 回收率試驗 準(zhǔn)備50 μL 1.282 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液,再分別加入50 μL不同活力單位的葡萄糖氧化酶溶液,作回收率試驗,對每份樣品重復(fù)測量3次,結(jié)果取平均值。由表2可知,回收率在97.208%~104.538%,標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.383%,表明此方法檢測葡萄糖氧化酶活力具有良好的準(zhǔn)確性。

    圖1 不同葡萄糖氧化酶酶濃度下的循環(huán)伏安掃描曲線Figure 1 The CV curves with different GOD enzyme concentration

    圖2 峰電流與葡萄糖氧化酶活性的關(guān)系Figure 2 The relationship between the peak current and the GOD enzyme activity

    2.2 電化學(xué)方法檢測黑曲霉孢子萌發(fā)中GOD的活性

    2.2.1 黑曲霉孢子的萌發(fā)觀察 定時取接種于96孔板上中的孢子培養(yǎng)液10 μL涂布于載玻片[18],采用顯微鏡觀察不同時間的孢子萌發(fā)情況(以萌發(fā)率表示),結(jié)果見表3。由表3可知,在0~4 h時未見孢子萌發(fā),但孢子體積略有增大;6 h

    表1 精密度試驗Table 1 Test for precision

    表2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Test for recovery

    2.2.2 黑曲霉孢子萌發(fā)過程中的酶活變化 定時掃描黑曲霉孢子培養(yǎng)液的循環(huán)伏安曲線,將得到的響應(yīng)峰電流值代入到線性回歸方程中,計算得出其葡萄糖氧化酶濃度。將所得到的酶濃度對時間作圖,結(jié)果見圖3。在孢子萌發(fā)早期,即可以檢測到葡萄糖氧化酶的存在,Rosenberg等[19]提出了黑曲霉氧化葡萄糖生成葡萄糖酸的能力并不依賴于完整發(fā)育的細(xì)胞。Moksia等[8]的研究證明在黑曲霉孢子持有一個活躍的酶系統(tǒng)來氧化葡萄糖,正如工業(yè)發(fā)酵中常用的黑曲霉菌絲一樣。隨著孢子對營養(yǎng)條件產(chǎn)生反應(yīng),孢子吸水膨脹并萌發(fā),合成新壁物質(zhì),相較于剛強(qiáng)的孢子膜結(jié)構(gòu)通透性增強(qiáng),便于自身與外界交換營養(yǎng)物質(zhì),酶體系活躍地氧化葡萄糖合成ATP為生長供給能量,培養(yǎng)8~10 h時GOD酶活力達(dá)到高峰。隨后,酶活力下降,可能是隨著菌絲生長,真菌為了更加復(fù)雜的生命活動發(fā)展其他的功能[20]。

    表3 孢子隨時間的萌發(fā)率Table 3 Spores germination rate over time

    2.3 對比試驗

    在采用電化學(xué)循環(huán)伏安法測定孢子萌發(fā)過程中酶活性的同時,采用傳統(tǒng)的滴定法進(jìn)行了佐證測定,結(jié)果見表4。整體而言,使用滴定法測出的結(jié)果都略低于電化學(xué)方法,可能是滴定法是通過肉眼判斷滴定終點的顏色變化。初始孢子的酶活力為 (1.355 ± 0.057) U/mL,隨著孢子開始萌發(fā)酶活力增強(qiáng),趨勢與使用電化學(xué)方法測量結(jié)果一致,對比兩種測量GOD酶活力的方法,循環(huán)伏安法測定時間更短,操作更簡便,可將該法用于葡萄糖氧化酶的監(jiān)測。

    表4 滴定法測定葡萄糖氧化酶酶活的結(jié)果Table 4 The results of titration methods for determination of the activity of GOD U/mL

    3 結(jié)論

    本試驗通過研究二茂鐵甲醇、葡萄糖和葡萄糖氧化酶三者之間的循環(huán)伏安特性,建立了電化學(xué)測定GOD活性的方法,并使用方該法測定了黑曲霉孢子萌發(fā)過程中的GOD活性。研究結(jié)果表明:隨著酶濃度的上升,峰電流值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,且在酶濃度為0.128~2.377 U/mL的范圍內(nèi)線性良好(R2=0.998)。通過顯微鏡對黑曲霉孢子萌發(fā)過程的觀測發(fā)現(xiàn),在30 ℃條件下培養(yǎng)10 h后,孢子的萌發(fā)率可達(dá)到86.534%,此時的葡萄糖氧化酶活力最強(qiáng)。本研究建立的電化學(xué)測定GOD活性的方法,能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、快速和客觀地檢測標(biāo)準(zhǔn)酶以及葡萄糖酶酶活力。將其應(yīng)用到黑曲霉孢子的酶活性檢測,為開發(fā)黑曲霉孢子作為GOD生物催化劑提供了新思路。

    [1] 袁永利, 鄒奇波, 黃衛(wèi)寧. 食品酶制劑改善冷凍面團(tuán)貯藏穩(wěn)定性的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2007, 23(3): 41-44.

    [2] 張志國, 王碩, 生慶海. HPLC-ELSD法檢測液態(tài)奶中的低聚半乳糖[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(3): 68-70.

    [3] BANKAR S B, BULE M V, SINGHAL R S, et al. Optimization ofAspergillusnigerfermentation for the production of glucose oxidase[J]. Food and Bioprocess Technology, 2009, 2(4): 344.

    [4] 李曄. 酶的固定化及其應(yīng)用[J]. 分子催化, 2008, 22(1): 86-95.

    [5] 韓志, 葉劍芝, 羅榮瓊. 固定化酶的方法及其在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 保鮮與加工, 2012, 12(5): 48-53.

    [6] RAMACHANDRAN S, FONTANILLE P, PANDEY A, et al. Spores ofAspergillusnigeras reservoir of glucose oxidase synthesized during solid-state fermentation and their use as catalyst in gluconic acid production[J]. Letters in Applied Microbiology, 2007, 44(2): 155-160.

    [7] RAMACHANDRAN S, FONTANILLE P, PANDEY A, et al. Permeabilization and inhibition of the germination of spores ofAspergillusnigerfor gluconic acid production from glucose[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(11): 4 559-4 565.

    [8] MOKSIA J, LARROCHE C, GROS J B. Gluconate production by spores ofAspergillusniger[J]. Biotechnology Letters, 1996, 18(9): 1 025-1 030.

    [9] 周玉庭. 黑曲霉孢子作為葡萄糖氧化酶生物催化劑的制備和活性測定方法研究[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學(xué), 2016: 52-59.

    [10] 莫隨青, 楊建雄, 王子浩. 用固定化黑曲霉C-435孢子生產(chǎn)檸檬酸的初步研究[J]. 陜西師大學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1990(3):93-94.

    [11] 翟彤宇, 單金緩. 葡萄糖氧化酶催化反應(yīng)動力學(xué)特征及其抑制劑[J]. 河北大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1998, 18(2): 203-205.

    [12] HELLMUTH K, PLUSCHKELL S, JUNG J K, et al. Optimization of glucose oxidase production byAspergillusnigerusing genetic-and process-engineering techniques[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995, 43(6): 978-984.

    [13] 徐俊光. 殼寡糖對植物病原真菌的抑菌活性及其機(jī)理的初步研究[D]. 大連: 中國科學(xué)院大連物理研究所, 2007: 53-54.

    [14] 李麗, 羅莉斯, 王艷萍, 等. 刺糖多孢菌生長特性及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國糧油學(xué)報, 2010(11): 89-93.

    [15] GERIN P, BELLON-FONTAINE M N, ASTHER M, et al. Immobilization of fungal spores by adhesion[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1995, 47(6): 677-687.

    [16] 王志新. 黑曲霉 A9 葡萄糖氧化酶的提取純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006:18-21.

    [17] PIERCE D T, UNWIN P R, BARD A J. Scanning electrochemical microscopy. 17. Studies of enzyme-mediator kinetics for membrane-and surface-immobilized glucose oxidase[J]. Anal. Chem, 1992, 64(1 795): 1 804.

    [18] 蔣雪薇, 李浩, 楊琛, 等. 絲狀真菌液體深層發(fā)酵菌絲體形態(tài)控制研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(9): 209-212.

    [19] ROSENBERG M, SVITEL J, STURDK E, et al. Gluconic acid production byAspergillusnigerwith oxygen supply by hydrogen peroxide[J]. Bioprocess Engineering, 1992, 7(7): 309-313.

    [20] MOIR A. How do spores germinate?[J]. Journal of Applied Microbiology, 2006, 101(3): 526-530.

    Detection of GOD activity during the germination ofAspergillusnigerspores by electrochemical method

    LIUYang-ru1

    LIZhong-hai1,2

    RENJia-li1, 2

    (1.CollegeofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.NationalEngineeringLaboratoryforRiceandBy-productDeepProcessing,Changsha,Hunan410004,China)

    In this study, the electrochemical cyclic voltammetry method was developed for the determination of activity of glucose oxidase. The ferrocene methanol was introducing as the redox probes on cyclic voltammetry, using glassy carbon electrode as working electrode, saturated calomel electrode as reference electrode, platinum wire electrode as the counter electrode and the peak current value of different enzyme activity was required . There was a linear relationship between the peak current in enzyme concentration of 1.282~2.377 U/mL with the correlation coefficient as 0.998, the detection limit as 1.282 U/mL. The enzyme activity of spores from dormancy to germination was detected by this new method, as the enzyme activity of spores decreased after increasing first, reaching the maximum (2.130 U/mL). The traditional methods were tested at the same time. Compared with the traditional method, the proposed electrochemical method has the characteristics of accurate, fast and convenient.

    Aspergillusnigerspores; germination; glucose oxidase; cyclic voltammetry

    國家自然科學(xué)基金(編號:31340059);湖南省自然科學(xué)基金(編號:2017JJ3523);糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新項目(編號:湘教通[2013]448號)

    劉洋汝,女,中南林業(yè)科技大學(xué)在讀碩士研究生。

    任佳麗(1977—),女,中南林業(yè)科技大學(xué)教授,博士。 E-mail:rjl_cl@163.com

    2017—03—20

    10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.017

    猜你喜歡
    葡萄糖氧化酶黑曲霉伏安
    用伏安法測電阻
    葡萄糖氧化酶的研究進(jìn)展及其在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用分析
    飼料博覽(2019年7期)2019-02-12 22:28:15
    齒輪狀SBA-15的制備及其對葡萄糖氧化酶的吸附行為研究
    葡萄糖氧化酶在斷奶仔豬日糧上的應(yīng)用研究進(jìn)展
    基于LABVIEW的光電池伏安特性研究
    電子制作(2016年23期)2016-05-17 03:53:41
    通過伏安特性理解半導(dǎo)體器件的開關(guān)特性
    復(fù)合誘變選育耐高溫高產(chǎn)葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:22
    黑曲霉產(chǎn)纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:20
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件
    国产日韩欧美亚洲二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲国产精品国产精品| 九色成人免费人妻av| 国产精品一区二区在线观看99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 女性被躁到高潮视频| 亚洲成人手机| 有码 亚洲区| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产探花极品一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 熟女人妻精品中文字幕| 性色avwww在线观看| 国产成人精品婷婷| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 少妇的逼好多水| 欧美人与善性xxx| 亚洲成人手机| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产淫片久久久久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 青春草国产在线视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲欧洲国产日韩| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久久久久久久久成人| 精品久久久久久久久av| kizo精华| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品一二三区在线看| 99国产精品免费福利视频| 嫩草影院新地址| 色视频www国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲精品国产av蜜桃| 三级国产精品片| 亚洲av不卡在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产视频首页在线观看| 一级毛片电影观看| 夫妻午夜视频| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人免费观看mmmm| 国产一区二区三区av在线| 亚洲真实伦在线观看| 22中文网久久字幕| 久久人妻熟女aⅴ| 国产成人精品福利久久| 久久国产精品大桥未久av | 免费av中文字幕在线| 看非洲黑人一级黄片| 久久人妻熟女aⅴ| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99国产精品免费福利视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲欧美精品专区久久| 伦精品一区二区三区| 国产在线男女| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 嘟嘟电影网在线观看| 免费黄色在线免费观看| 国产精品一区www在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲自偷自拍三级| 欧美bdsm另类| 五月伊人婷婷丁香| 日本-黄色视频高清免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 97在线人人人人妻| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲av男天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美日韩在线观看h| 2022亚洲国产成人精品| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜日本视频在线| 大话2 男鬼变身卡| 日日啪夜夜撸| 日韩中字成人| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久午夜欧美精品| 熟女电影av网| 18+在线观看网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 在线观看人妻少妇| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看www视频免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费看av在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 久久精品国产亚洲av天美| 黄色视频在线播放观看不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲综合精品二区| 最近手机中文字幕大全| 国产精品一二三区在线看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人手机| 91精品伊人久久大香线蕉| 国模一区二区三区四区视频| 久久99热6这里只有精品| 成人综合一区亚洲| 国产色爽女视频免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品99久久久久久久久| 成年人免费黄色播放视频 | 亚洲av日韩在线播放| 国产精品福利在线免费观看| 99久久精品热视频| 九色成人免费人妻av| 国产免费视频播放在线视频| 老司机亚洲免费影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人看人人澡| 亚洲电影在线观看av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| videossex国产| 国产成人精品婷婷| 九九在线视频观看精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色欧美视频在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 两个人的视频大全免费| 黄色配什么色好看| 日韩电影二区| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久99精品国语久久久| 国产精品久久久久久久电影| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品一区二区三区视频在线| 国产男人的电影天堂91| av又黄又爽大尺度在线免费看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲av男天堂| 国产熟女午夜一区二区三区 | 老女人水多毛片| 最近2019中文字幕mv第一页| 一级毛片久久久久久久久女| 中国三级夫妇交换| 成人国产麻豆网| 人人妻人人澡人人看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久人人爽人人爽人人片va| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 最后的刺客免费高清国语| 中文字幕av电影在线播放| 成人无遮挡网站| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲成人手机| 日韩欧美精品免费久久| av国产精品久久久久影院| 伦理电影免费视频| 高清av免费在线| 久久久久视频综合| 偷拍熟女少妇极品色| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品夜色国产| 99热这里只有是精品在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| av在线播放精品| 色视频在线一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 免费大片18禁| 视频中文字幕在线观看| 天美传媒精品一区二区| 久久6这里有精品| 我要看黄色一级片免费的| 曰老女人黄片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲国产精品999| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品福利在线免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 在线观看免费高清a一片| 国内精品宾馆在线| 国产69精品久久久久777片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 人妻系列 视频| 国产一级毛片在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人精品一,二区| 久久这里有精品视频免费| 免费大片黄手机在线观看| 欧美人与善性xxx| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲,欧美,日韩| 色94色欧美一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久人妻| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最黄视频免费看| 一边亲一边摸免费视频| 91精品国产国语对白视频| 在现免费观看毛片| 18禁动态无遮挡网站| 99久久精品一区二区三区| 久久久久国产网址| 高清黄色对白视频在线免费看 | 精品一区在线观看国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产在视频线精品| 免费黄色在线免费观看| 香蕉精品网在线| 亚洲av不卡在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜免费观看性视频| 内射极品少妇av片p| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 2022亚洲国产成人精品| 最黄视频免费看| 亚洲精品色激情综合| 国产男女内射视频| 搡老乐熟女国产| 黄色毛片三级朝国网站 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品一二三| 色94色欧美一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人a∨麻豆精品| 丝袜脚勾引网站| 99热这里只有精品一区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费看不卡的av| 色网站视频免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 一级二级三级毛片免费看| 麻豆成人午夜福利视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费人成在线观看视频色| 国产在线视频一区二区| 成人毛片60女人毛片免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 一级毛片电影观看| av一本久久久久| 天美传媒精品一区二区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人一二三区av| 丝袜喷水一区| 国产精品人妻久久久久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 美女大奶头黄色视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产亚洲91精品色在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 熟女人妻精品中文字幕| 一级爰片在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 大码成人一级视频| 日韩免费高清中文字幕av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 51国产日韩欧美| 在线观看一区二区三区激情| 永久免费av网站大全| 国产高清有码在线观看视频| 成年av动漫网址| 国产高清不卡午夜福利| 日韩中字成人| 91精品国产国语对白视频| 日韩大片免费观看网站| 国产一级毛片在线| 国产色婷婷99| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 午夜91福利影院| 美女福利国产在线| 高清欧美精品videossex| 久久久久精品性色| 韩国高清视频一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品国产av在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品成人在线| 亚洲欧洲日产国产| 韩国高清视频一区二区三区| 伦精品一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产高清不卡午夜福利| 97超碰精品成人国产| 国产永久视频网站| 亚洲av.av天堂| 久久久久网色| 韩国av在线不卡| 两个人免费观看高清视频 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本91视频免费播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最黄视频免费看| 日韩制服骚丝袜av| 国产亚洲欧美精品永久| 美女cb高潮喷水在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 美女中出高潮动态图| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品日韩av片在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 色视频www国产| 蜜桃在线观看..| 91aial.com中文字幕在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 婷婷色av中文字幕| 久久久国产精品麻豆| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲国产欧美在线一区| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 一边亲一边摸免费视频| 免费大片18禁| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 一区二区三区乱码不卡18| 观看免费一级毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人国产av品久久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国模一区二区三区四区视频| 色视频www国产| 亚洲第一av免费看| 亚洲国产精品国产精品| 秋霞伦理黄片| 91成人精品电影| 22中文网久久字幕| 亚洲自偷自拍三级| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩电影二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一级a做视频免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品不卡视频一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 高清毛片免费看| 永久网站在线| 欧美精品国产亚洲| 天堂俺去俺来也www色官网| 在线精品无人区一区二区三| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本与韩国留学比较| 少妇人妻一区二区三区视频| 桃花免费在线播放| 99九九线精品视频在线观看视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本午夜av视频| 久久韩国三级中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 天堂中文最新版在线下载| 多毛熟女@视频| 麻豆乱淫一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 26uuu在线亚洲综合色| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av成人精品一区久久| 免费观看在线日韩| 日韩中文字幕视频在线看片| av女优亚洲男人天堂| 观看免费一级毛片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 天堂8中文在线网| 免费在线观看成人毛片| 欧美+日韩+精品| 日韩中字成人| 成人无遮挡网站| 观看免费一级毛片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产高清有码在线观看视频| 国产爽快片一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 夫妻午夜视频| 人妻系列 视频| av在线老鸭窝| 22中文网久久字幕| 中国国产av一级| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品久久久久久久性| 免费看光身美女| 亚洲综合色惰| 国产成人aa在线观看| 99国产精品免费福利视频| 一区二区av电影网| a 毛片基地| 国产成人freesex在线| 久久久久久伊人网av| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 99热网站在线观看| 国产 精品1| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| a级一级毛片免费在线观看| av播播在线观看一区| 日本av手机在线免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲av欧美aⅴ国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产午夜精品一二区理论片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 最近手机中文字幕大全| 伊人久久精品亚洲午夜| 永久网站在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 寂寞人妻少妇视频99o| 黄色怎么调成土黄色| 日日啪夜夜爽| 久久99一区二区三区| 国产综合精华液| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 91久久精品电影网| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| av在线观看视频网站免费| 99久久综合免费| 国产精品国产av在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 简卡轻食公司| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av男天堂| 韩国av在线不卡| 欧美三级亚洲精品| 久久综合国产亚洲精品| 日日啪夜夜爽| 国产精品偷伦视频观看了| 91久久精品国产一区二区成人| 国产在线男女| 99热网站在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品久久久久久久久av| 自线自在国产av| 久久久午夜欧美精品| 国产精品久久久久久av不卡| 久久毛片免费看一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费黄色在线免费观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 99九九线精品视频在线观看视频| 自线自在国产av| 这个男人来自地球电影免费观看 | h视频一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇的逼好多水| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 一个人看视频在线观看www免费| 国产男女内射视频| 自线自在国产av| 久久99蜜桃精品久久| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片电影观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久精品夜色国产| 国产熟女欧美一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 青春草国产在线视频| 美女大奶头黄色视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本91视频免费播放| 69精品国产乱码久久久| 99久国产av精品国产电影| 不卡视频在线观看欧美| 午夜久久久在线观看| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲,欧美,日韩| 午夜久久久在线观看| 97在线人人人人妻| av播播在线观看一区| 老司机亚洲免费影院| 人体艺术视频欧美日本| 黄色毛片三级朝国网站 | 欧美精品国产亚洲| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久午夜欧美精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看国产h片| 美女中出高潮动态图| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 十八禁高潮呻吟视频 | a级毛色黄片| 天天操日日干夜夜撸| 午夜91福利影院| 国产在线免费精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 两个人的视频大全免费| 久久午夜福利片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 综合色丁香网| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 婷婷色综合大香蕉| 精品久久久噜噜| 成人国产麻豆网| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产一区二区三区av在线| 一级黄片播放器| 在线看a的网站| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲情色 制服丝袜| 国产av一区二区精品久久| 777米奇影视久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 国产69精品久久久久777片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品一区www在线观看| 男女免费视频国产| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 色网站视频免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 成人免费观看视频高清| 黄色毛片三级朝国网站 | 成人特级av手机在线观看| 一级爰片在线观看| 亚州av有码| 国产成人精品一,二区| 亚洲av福利一区| 欧美97在线视频| 大码成人一级视频| 午夜影院在线不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧洲国产日韩| 中文字幕制服av| 成人国产麻豆网| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩制服骚丝袜av| 涩涩av久久男人的天堂| 人人妻人人澡人人看| 99热这里只有精品一区| 美女主播在线视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 深夜a级毛片| 妹子高潮喷水视频| 久久99蜜桃精品久久| 国产69精品久久久久777片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 精品酒店卫生间| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人看视频在线观看www免费| 9色porny在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久欧美国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 另类亚洲欧美激情| 国产视频首页在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩强制内射视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲国产精品一区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 视频中文字幕在线观看|