可得然膠對肌球蛋白凝膠凍融穩(wěn)定性的影響

王培森

李倩如1，2

江文韜1，2

繆 松1，2，3

張龍濤1，2，3

鄭寶東1，2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計研究中心，福建 福州 350002；3. 替格斯食品研究中心，愛爾蘭 科克市)

可得然膠對肌球蛋白凝膠凍融穩(wěn)定性的影響

王培森1，2

李倩如1，2

江文韜1，2

繆 松1，2，3

張龍濤1，2，3

鄭寶東1，2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計研究中心，福建 福州 350002；3. 替格斯食品研究中心，愛爾蘭 科克市)

為了探索可得然膠對魚糜制品凍融穩(wěn)定性的影響及作用機理，以肌球蛋白凝膠為模型，研究可得然膠的添加對其循環(huán)凍融過程中凝膠強度、持水率的影響，并通過低場核磁共振(LF-NMR)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)、掃描電鏡(SEM)等手段分別測定添加可得然膠對肌球蛋白凝膠水分分布、分子間作用力、微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討作用機理。結(jié)果表明：添加1%可得然膠可提高肌球蛋白凝膠的凝膠強度和保水性，減緩循環(huán)凍融過程中凝膠強度和持水率的降低。添加可得然膠可增強肌球蛋白內(nèi)部的氫鍵作用，使蛋白凝膠形成密實的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，降低肌球蛋白凝膠中不同組分水的流動性，同時降低不易流動水向自由水的轉(zhuǎn)化量，從而使蛋白凝膠凍融穩(wěn)定性和持水率得到提高。

肌球蛋白；凍融處理；可得然膠；穩(wěn)定性

凍品是魚糜制品最常見的產(chǎn)品形式，由于冷藏、運輸和銷售過程中一些無法避免的因素所引起的溫度波動，會使魚糜制品的凝膠強度、質(zhì)構(gòu)特性下降，影響產(chǎn)品質(zhì)量和食用品質(zhì)。添加親水性膠體被證明可提高蛋白凝膠類食品的品質(zhì)，并可在一定程度上緩解溫度波動對魚糜制品的損傷[1-4]。

可得然膠是由β-1,3-糖苷鍵組成的線性無分枝結(jié)構(gòu)，無味、無臭、無色的微生物膠，1989年首先在日本投入商業(yè)生產(chǎn)。由于其獨特的功能，如熱凝膠特性等，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中[5]。Funami等[6]研究可得然膠對豬肉糜熱特性、凝膠特性和流變特性影響的結(jié)果表明，在75 ℃下可得然膠與豬肉可以形成較強的凝膠結(jié)構(gòu)，同時明顯提高了豬肉凝膠的保水性。勵慧敏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.5%的可得然膠可以顯著提高豬肉丸口感、風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、咀嚼性以及綜合評分。胡亞琴等[8-9]研究了可得然膠在帶魚魚糜中的添加效果，發(fā)現(xiàn)添加可得然膠能改善帶魚肌肉蛋白的凝膠性能。但魚糜、肉糜制品成分的復(fù)雜性限制了對可得然膠添加效果作用機理的探討。

肌球蛋白是魚肌肉蛋白質(zhì)中最重要且含量最多的一種蛋白質(zhì)，占肌原纖維蛋白的 50%～55%，占魚肌肉總蛋白的30%以上[10]。肌球蛋白也是肌原纖維蛋白中唯一一種可單獨形成良好凝膠的蛋白[11]，是魚糜制品形成穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)的主要成分，其凝膠特性直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。目前未見可得然膠與肌球蛋白的凝膠作用以及凝膠凍融穩(wěn)定性的研究。

本試驗以肌球蛋白為材料，制備肌球蛋白凝膠，以循環(huán)凍結(jié)—解凍模擬魚糜制品在物流過程的溫度波動，研究可得然膠的添加效果，并探討其作用機理，旨在為冷凍魚糜制品凍融穩(wěn)定性的提高提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅羅非魚：個體質(zhì)量(500±100) g，福州永輝超市購得；

可得然膠(CUD)：純度≥98.0%，貨號A1049，美國Amresco公司；

NaN3、Tris、KCl、EGTA、KHCO3、MgCl2、鹽酸、醋酸鎂、β-巰基乙醇：分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

攪拌機：MJ-25BM05A型，廣東精品電器制造有限公司；

高剪切分散乳化機：FA-25型，法國弗魯克(上海)有限公司；

高速冷凍離心機：JA-26型，美國貝克曼有限公司；

質(zhì)構(gòu)測試儀：TA-XTplus型，英國Stable Micro System公司；

核磁共振分析儀：PQ001型，上海紐邁電子科技有限公司；

紅外光譜儀：Vertex 70 FTIR型，法國弗魯克有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-6380LV型，日本電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝膠的制備 肌球蛋白的提取參考Park等[12]的方法，采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度，用0.6 mol/L KCl溶液調(diào)整蛋白質(zhì)溶液至40 mg/mL。可得然膠以1 g/100 g的比例添加到肌球蛋白溶液作為處理，相同濃度的純肌球蛋白溶液為對照。樣品在 10 000 r/min 均質(zhì) 1 min，4 ℃靜止過夜后，取10 mL分別加入到25 mL燒杯，水浴鍋中以2 ℃/min的升溫速率從 20 ℃加熱到 80 ℃并于 80 ℃保溫20 min。用流動水冷卻至室溫并于 4 ℃過夜。

1.3.2 循環(huán)凍融 樣品放置于-18 ℃的環(huán)境下冷凍18 h后于室溫(25 ℃±1 ℃)下解凍6 h，計為1個凍融循環(huán)。肌球蛋白及其與可得然膠的混合凝膠樣品分別進行1，2，3，4，5次的循環(huán)凍融[13]，取樣測定。

1.3.3 持水率的測定 參照文獻[14]，按式(1)計算持水率。試驗設(shè)置 6 個平行樣品。

(1)

式中：

WHC——持水率，%；

W1——離心前樣品質(zhì)量，g；

W2——除去水分后的樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 凝膠強度的測定 采用TA.XTPlus型物性測試儀GMIAGelatine程序的壓縮模式測試[15]。探頭型號：P0.5，測前速度：2 mm/s，測試速度：1 mm/s，測后速度：2 mm/s，形變量：40%，觸發(fā)力：5 g；觸發(fā)類型：自動。

1.3.5 低場核磁共振(LF-NMR)檢測 質(zhì)子共振頻率為 18.183 MHz，磁體強度0.43 T，測量溫度為 32 ℃。大約2～4 g樣品放入直徑25 mm核磁管，而后放入分析儀中。自旋—自旋弛豫時間T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進行測量，參數(shù)設(shè)置：TW(重復(fù)采樣等待時間)為8 000 ms，TE(回波時間)為0.8 ms，NS(掃描次數(shù))為4，NECH(回波個數(shù))為12 000，P1(90°脈寬)為5 μs，P2(180°脈寬)為10.4 μs，PRG(前置放大倍數(shù))為3，得到的圖為指數(shù)衰減圖形。CMPG 指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的 MultiExp InvAnalysis 軟件進行反演，得到T2值。

1.3.6 傅里葉紅外光譜( FT-IR) 檢測 將凍融處理的凝膠凍干后取1～3 mg，溴化鉀壓片。傅里葉光譜掃描范圍 4 000～400 cm-1，分辨率 4 cm-1，室溫下重復(fù)掃描 16 次。掃描結(jié)果采用 Origin 7.0 作圖。

1.3.7 SEM掃描電鏡觀察 樣品切成 3 mm×3 mm×2 mm 的薄片，放入 4%甲醛和 2.5%戊二醛混合溶液(體積比1∶1)中固定2 h；用 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗5～10 次，再用乙醇(30%～100%)和丙酮(100%)溶液梯度脫水，每次各 10 min；用冷風(fēng)除去易揮發(fā)的有機溶劑后，冷凍干燥 15 h；噴金，用電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)凍融對凝膠強度的影響

凝膠強度是衡量肉制品凝膠品質(zhì)的重要物理參數(shù)。本課題組前期試驗證明0.25%～1.00%的可得然膠均可顯著提高肌球蛋白凝膠的凝膠強度和持水率，添加量為1%時效果最佳。由圖1可知，添加可得然膠可顯著提高肌球蛋白凝膠的凝膠強度。在凍融過程中，肌球蛋白及其與可得然膠的混合凝膠的凝膠強度隨凍融次數(shù)的增多而降低，但添加可得然膠組高于對照組，說明可得然膠可顯著提高肌球蛋白的凝膠性能和凍融穩(wěn)定性。Angela Hunt等[16]報道了卡拉膠添加量為0.25%～1.00%的阿拉斯加鱈魚魚糜凝膠的破斷力隨凍融次數(shù)的增加而降低，整體凝膠強度呈下降趨勢，與本試驗基本一致。

2.2 循環(huán)凍融對凝膠持水率的影響

蛋白凝膠持水能力與靜電作用、疏水作用、氫鍵、范德華力、凝膠水分分布與流動性及微觀結(jié)構(gòu)等有關(guān)[17]。由圖2可知，未凍融時，可得然膠—肌球蛋白混合凝膠的持水率高于肌球蛋白組。丁麗麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.4%的可得然膠添加量即可使魚糜制品的壓出水分從4.5%降低至2.5%，提高了魚糜制品的持水率，與本試驗結(jié)果一致。反復(fù)凍融會導(dǎo)致凝膠內(nèi)部三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)損傷，凝膠中的水分流失，持水率下降。肌球蛋白凝膠及其與可得然膠的混合凝膠的持水率隨凍融次數(shù)的增多而降低，但添加可得然膠組的持水率均高于未添加組，可得然膠的添加減緩了肌球蛋白凝膠凍融過程中持水率的降低。肖旭華[19]研究發(fā)現(xiàn)，魚糜凝膠的持水率隨凍融次數(shù)的增加而降低，與本試驗結(jié)果類似；魚糜凝膠在反復(fù)凍融過程中，冰晶不斷形成和消失，對三維凝膠網(wǎng)絡(luò)有一定的破壞作用，使其截留水分的能力降低。

圖1 凍融次數(shù)對肌球蛋白凝膠強度的影響Figure 1 Effects of freeze-thaw cycles on the gel strength of myosin

圖2 凍融次數(shù)對肌球蛋白凝膠持水率的影響Figure 2 Effect of freeze-thaw cycles on the Water holding capacity of the myosin gel

2.3 LF-NMR測試

弛豫時間可以反映水分的自由度，弛豫時間越短說明水分與底物結(jié)合越緊密，弛豫時間越長說明水分越自由。對CPMG脈沖序列得到的衰減曲線進行多指數(shù)擬合后(圖3、4)，發(fā)現(xiàn)T2在1～10 000 ms的弛豫時間分布上出現(xiàn)了4個峰，T213.511～9.326 ms、T2228.48～151.99 ms、T23174.75～811.13 ms、T241 232.85～2 477.08 ms，分別對應(yīng)結(jié)合水、中度不易流動水、不易流動水、自由水4種水分，與Qin等[20-21]的報道一致。圖3、4為經(jīng)過5次凍融后肌球蛋白凝膠及肌球蛋白—可得然膠凝膠的T2圖譜。由表1可知，循環(huán)凍融過程中T21、T22、T23、T24的弛豫時間呈增大趨勢，表明混合凝膠經(jīng)過多次凍融循環(huán)后，凝膠中水分受到的束縛力降低，4種不同狀態(tài)水分的流動性增大，可能是凝膠在凍融過程中凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到冰晶的破壞，使凝膠內(nèi)部整體平均孔徑變大，水分在凝膠網(wǎng)絡(luò)中自由流動的空間增大。

M代表肌球蛋白凝膠；0FT、1FT、3FT、5FT分別代表0、1、3、5次凍融

圖3 5次循環(huán)凍融對肌球蛋白凝膠T2的影響

Figure 3 Effect of five times freeze-thaw cycles on the distribution of theT2relaxation times of myosin gel

M代表肌球蛋白凝膠；CUD代表可得然膠；0FT、1FT、3FT、5FT分別代表0、1、3、5次凍融

圖4 5次循環(huán)凍融對肌球蛋白—可得然膠凝膠T2的影響

Figure 4 Effect of five times freeze-thaw cycles on the distribution of theT2relaxation times of myosin-curdlan gel

各峰的峰面積百分比可以用來表示不同組分水分占總水分的比例。表2為凍融處理前后T21、T22、T23、T24的面積百分比。T21代表的是凝膠結(jié)構(gòu)中與蛋白質(zhì)結(jié)合最緊密的結(jié)合水，在循環(huán)凍融過程中變化量較小。T22、T23代表中度不易流動水和不易流動水，可將二者統(tǒng)一定義為不易流動水，T24為自由水，由圖3、4和表2可知，在循環(huán)凍融的過程中部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，可得然膠的添加減少了不易流動水的轉(zhuǎn)化量。此結(jié)果與凍融過程中肌球蛋白凝膠的持水率變化規(guī)律相符合。

表1 凍融過程中T2弛豫時間的變化Table 1 The change of T2 relaxation times in freeze-thaw cycles treatment ms

表2 凍融過程中T21、T22、T23、T24的面積百分比變化Table 2 T21, T22, T23, T24 area percentage of freeze-thaw cycle treatment %

2.4 FT-IR測試

由圖5和表3可知，肌球蛋白及其與多糖的混合凝膠的紅外特征峰有PK1，3 430 cm-1(酰胺A帶，N—H伸縮振動)；PK2，2 930 cm-1；PK3，1 652 cm-1(酰胺I帶，C═O伸縮振動)；PK4，1 540 cm-1(酰胺II帶，N—H彎曲振動)；PK5，1 066 cm-1[22-23]。未加入和加入可得然膠組的峰位與峰型基本一致，說明可得然膠的添加對肌球蛋白的骨架結(jié)構(gòu)基本沒有影響，未發(fā)生蛋白質(zhì)基團的改變。酰胺A(3 000～3 500 cm-1)帶通常被用來評估和分析蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用[24]，CUD 的添加使得 PK1 位移至較低的波數(shù)(3 312 cm-1)，表明肌球蛋白分子中氫鍵作用增強[25]，從而提高了凝膠強度和持水率。

M代表肌球蛋白；CUD代表可得然膠；5FT代表第5次凍融

圖5 凍融處理前后肌球蛋白凝膠的傅里葉紅外掃描圖譜Figure 5 FT-IR spectra dates of myosin gel befoe and after freeze-thaw cycle treatment表3 凍融前后肌球蛋白凝膠紅外光譜數(shù)據(jù)?Table 3 FT-IR spectral data for myosin gel before and after freeze-thaw cycles cm-1

? M代表肌球蛋白；CUD代表可得然膠；5FT代表第5次凍融。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是通過其主鏈上C═O和N—H間的氫鍵作用來維持，F(xiàn)T-IR經(jīng)常被用來檢測分析蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)常被用來確認并分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。酰胺I帶的紅外吸收主要與C═O或C═N的伸縮振動有關(guān)，其中，1 610～1 639 cm-1被認為是β-折疊結(jié)構(gòu)；1 640～1 660 cm-1被認為是無規(guī)則卷曲(C═O與水形成氫鍵)；1 661～1 680 cm-1被認為是α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 681～1 700 cm-1被認為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[26]。為了獲得更加詳細的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的信息，利用傅里葉自去卷積化對酰胺I帶進行處理，然后對紅外光譜上的酰胺I帶進行高斯曲線擬合，得到的結(jié)果見表4。由表4可知，β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量基本上無較大的變化，說明可得然膠的引入沒有改變肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)，并且凍融過程中也沒有涉及到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。

表4 可得然膠對肌球蛋白凍融前后二級結(jié)構(gòu)的影響?

Table 4 Effects of CUD on secondary structures of myosin before and after freeze-thaw cycles

%

? M代表肌球蛋白；CUD代表可得然膠；5FT代表第5次凍融。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是影響凝膠的凝膠強度、保水性等的重要因素[27]。凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成是蛋白質(zhì)變性所引起的，該作用導(dǎo)致了分子間共價鍵和非共價鍵相互作用，包括二硫鍵和疏水鍵等[28]。由SEM結(jié)果可知，未添加可得然膠的肌球蛋白形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)孔洞較大且分布散亂，孔徑大小不一，形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)粗糙(圖6 A1)。添加1%的可得然膠—肌球蛋白混合凝膠結(jié)構(gòu)致密，孔洞分布均勻，孔徑較小(圖6 B1)。孔洞分布有序、孔徑較小的凝膠網(wǎng)絡(luò)凝膠強度較大；分布雜亂、孔徑較大的凝膠強度較小[29]。因此，推測這是可得然膠—肌球蛋白混合凝膠強度大于純的肌球蛋白凝膠的原因。

凝膠的凍結(jié)和解凍都伴隨著其內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中冰結(jié)晶的出現(xiàn)和消失，每一次的凍融過程都會對凝膠造成不同程度的損傷。5次凍融后，純肌球蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)基本完全崩潰，產(chǎn)生了更大的孔洞和裂縫(圖6 A2)。添加1%可得然膠的肌球蛋白凝膠凍融5次后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)微觀圖像(圖6 B2)顯示，凍融使膠體原有的規(guī)則纖細的網(wǎng)絡(luò)變成混亂粗糙且具有較大孔洞的結(jié)構(gòu)，以及斷裂的纖維束。凝膠中的可凍結(jié)水凍結(jié)時體積變大，導(dǎo)致小的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)破壞。解凍時，臨近的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中的水分匯集，再次凍結(jié)時形成了較大的冰晶，對凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進一步的損傷。因此，反復(fù)凍融后，凝膠結(jié)構(gòu)完全崩潰。添加的可得然膠參與了蛋白質(zhì)凝膠的形成過程，兩者之間發(fā)生相互作用，形成了交聯(lián)度高、結(jié)構(gòu)牢固、韌性強的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在一定程度上可以緩解凍融過程中冰晶對凝膠結(jié)構(gòu)的破壞。

A1(肌球蛋白)、B1(肌球蛋白+CUD)為凍融處理前的掃描電鏡圖片；A2(肌球蛋白)、B2(肌球蛋白+CUD)為凍融處理后的掃描電鏡圖片

圖6 肌球蛋白凝膠凍融處理前后的微觀結(jié)構(gòu)圖

Figure 6 SEM of myosin gel befoe and after freeze-thaw cycle treatment

3 結(jié)論

5次循環(huán)凍融處理后，添加1%的可得然膠使肌球蛋白凝膠的凝膠強度和持水率分別由對照組的12.3 g、32.99%增大至25.8 g、62.2%。凝膠中不易流動水的含量由47.43%增大至59.5%，自由水含量由51.67%降低至39.55%。同時，膠體的引入增強了肌球蛋白分子間氫鍵作用，與肌球蛋白形成交聯(lián)度高，結(jié)構(gòu)致密，孔洞均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高了肌球蛋白凝膠的凝膠強度和持水率，有效地緩解凍融過程中冰晶對凝膠結(jié)構(gòu)的破壞，減緩凍融過程中凝膠強度及持水率的降低。因此，可得然膠可以作為一種提高凍融穩(wěn)定性的添加物應(yīng)用在魚糜制品的生產(chǎn)中。

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Effects of curdlan on the freeze-thaw stability of myosin gel

WANGPei-sen1,2

LIQian-ru1,2

JIANGWen-tao1,2

MIAOSong1，2,3

ZHANGLong-tao1,2,3

ZHENGBao-dong1,2

(1.CollegeofFoodScience&FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China;2.China-IrelandInternationalCooperationLaboratoryofFoodsMaterialScienceandStructuralDesign,Fuzhou,Fujian350002,China; 3.TeagascFoodResearchCentre,Moorepark,Fermoy,Co.Cork,Ireland)

In order to investigate the effects and mechanization of curdlan on the free-thaw stability of surimi, gel strength and water holding capacity of myosin gel model in freeze-thaw cycles were observed. The intermolecular force, water distribution and microstructure were determined by LF-NMR, FT-IR and SEM respectively. The result showed that 1% curdlan increased the gel strength and water holding capacity and alleviated the reduction of gel strength and water holding capacity during freezing and thawing cycle. The addition of curdlan strengthened the hydrogen bonding inter myosin，which led to the formation of a compact three-dimensional network structure of myosin gel. Moreover, the liquidity of different components of water and the immobile water shifted into free water decreased, and the freeze-thaw stability and water holding capacity were increased.

myosin; freeze-thaw cycles; curdlan

王培森，男，福建農(nóng)林大學(xué)在讀碩士研究生。

張龍濤(1979—)，男，福建農(nóng)林大學(xué)副教授，博士。 E-mail：zlongtao@hotmail.com

2017—03—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.006